Tradução do artigo Quantitative analysis of particles, genomes and infectious particles in supernatants of haemorrhagic fever virus cell cultures

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Análise quantitativa de partículas, genomas e partículas infecciosas em sobrenadantes de culturas de células do vírus da febre hemorrágica
As informações sobre a replicação dos vírus na febre hemorrágica viral não estão prontamente disponíveis e nunca foramanalisadas ​​em uma abordagem comparativa. Aqui, nós comparamos as características de crescimento de cultura de células dos vírus (HFV), do Arenaviridae, Filoviridae, Bunyaviridae eFlaviviridae, executando a análise quantitativa de sobrenadantes de cultura de células por: I) microscopia de eletrons para a quantificação de partículas de vírus, II) PCR quantitativo em tempo real, para a quantificação de genomas, e III) determinação das unidades formadoras de focos pelo revestimento de anticorpos fluorescentes por monocamadas de células infectadas, para a quantificação de infecciosidade do vírus.A análise comparativa revelou que filovírus e replicação RVFV resultado num excedente de genomas mas variando graus de eficiência de empacotamento e de partículas infecciosas. Uma replicação e empacotamento mais eficiente foi observada para Lassa vírus e vírus da dengue, resultando em um melhor rendimento de partículas infecciosas, enquanto YFV acabou por ser mais eficiente, com apenas quatro partículas induzindo uma FFU. Para Crimeia-Congo vírus da febre hemorrágica (CCHFV) um excedente de cascas vazias foi observado, com apenas um em 24 partículas apareceu genoma. As partículas completas acabarampor ser extremamente infecciosas.
Microscópio eletrônico
Os estudos de microscopia eletrônica foram realizadas utilizando um microscópio electrónico Philips CM100 (Eindhoven, Países Baixos), como descrito anteriormente [10]. Os sobrenadantes virais foram fixados em glutaraldeído a 2,5% (razão de 1: 1) para um mínimo de 1 hora no laboratório BSL3 / 4, antes de descontaminação dos tubos e transferência para laboratório BSL2 seguintes instruções de segurança. Após a fixação, partículas virais foram sedimentadas em carbono / Formvar revestidas de grades de cobre de 400 mesh (Gilder Grades, Lincolnshire, Inglaterra). Resumidamente, a 150 ul de suspensão de vírus foi centrifugada durante 10 min numa centrífuga de Eppendorf 5417C (Hamburgo, Alemanha) com um rotor basculante para fora, a uma força máxima de 12000 × g. As grelhas foram colocados na parte inferior plana do recipiente exterior de Sarstedtmicrovette CB 300 tubos (Nümbrecht- Memmelsdorf, Alemanha). Dez quadrículas foram contados em cada caso. Uma partícula por metro quadrado igual a uma concentração de 1,5 x 105 partículas por ml. As grades foram coradas por 2% de ácido tungstofosfórico (Merck, Darmstadt, Alemanha), a pH 6.
Determinação de unidades formadoras de focos (CFU)
Os vírus foram titulados de 10 vezes de 1:10 a 1: 1010 em meio MEM e 100 ul de cada diluição foi transferido para células Vero confluentes em placas de cultura de tecidos de 96 poços, seguido por incubação durante 24-48 horas a 37 ° C e 5 % de CO2.
Subsequentemente, os sobrenadantes foram removidos, e as células infectadas foram lavadas 3 vezes com PBS, antes da fixação por acetona fria (80%) em água destilada durante 60 minutos a -20 ° C. Após a fixação, os ensaios de formação de focos fluorescentes foram realizadas por incubação de anticorpos específicos sobre as células infectadas durante 30 minutos a 37 ° C, seguido por incubação com anticorpos de f luoresceína-conjugado secundário para, adicionalmente, de 30 minutos a 37 ° C (Tabela 1). títulos de ponto final (UFF) foram criados na última diluição dando fluorescência inequívoca.
Quantitativa PCR em tempo real
O RNA foi isolado de uma BSL3 4 laboratório / a partir dos stocks virais por meio de tratamento com TRIZOL Reagente (razão 1 + 3) (Invitrogen) durante um mínimo de 5 minutos, antes de descontaminação dos tubos e transporte para um laboratório de BSL2 seguintes as instruções de segurança. Quantitativa em tempo real de RT-PCR (qPCR) foi realizada utilizando iniciadores e sondas publicados e padrões de ARN para RVFV, YFV, EBOZV, EBOSV, VMDR e DEN [11-15] e os iniciadores e sondas na tabela 2 para CCHFV e LasV. primers CCHFV foram projetados em referência às sequências U39455, AF467768, NC_005300, de Africano FHCC isolados, os primersLasV foram projetados em referência às sequências J04324, AF333969 e AF246121. padrões de ARN quantitativos para CCHFV, LasV foram transcritas a partir do H-segmento (CCHFV), o gene da nucleoproteína (LasV) e região 3 'NTR (DENV) ligado em pCRII e avaliadas tal como previamente descrito [13]. qPCR foi realizado utilizando o Kit QuantiTectProbe RT-PCR (Qiagen, Hilden Alemanha) no reciclador Luz 2.0 (Roche, Mannheim, Alemanha), e o seguinte protocolo de temperatura: temperatura ambiente 50 ° C durante 5 min, a activação a 95 ° C durante 15 min, 45 ciclos de amplificação para a 95 ° C durante 5 sec e 60 ° C durante 15 seg. Para CCHFV foi utilizado o mesmo protocolo com uma aterragem em dois passos a partir de graus de 70 ° C a 64 ° C durante 3 ciclos de cada e 33 ciclos a 62 ° C.
Resultados
PCR em tempo real
Os novos ensaios de qPCR para o CCHFV 10200 M-segmento, para LasV Josias-N e DEN 3'NTR mostrou uma sensibilidade analítica de 100, 10 e 100 moléculas de RNA detectados e eficiência (E = 10-1 / inclinação-1) de 0,9 , 1.3 e 1.5, respectivamente.
Tabela 1
Descrição dos anticorpos utilizados para a determinação de FFU
	Vírus 
	Anticorpos primários
	Anticorpos secundários
	LASV
	soro de ratinho vírus Anti-Lassa (NP), (in-house)
	Coelho conjugado com FITC anti-ratinho de imunoglobulinas, (DakoCytomation, Dinamarca)
	EBOZV/EBOSV
	soro de ratinho anti-vírus Ebola (NP), (in-house)
	Conjugado com FITC de cabra anti-IgG de ratinho, (Jackson ImmunoResearch, Baltimore, EUA)
	MARV
	Soro humano paciente
	Conjugado com FITC de cabra anti-IgG humana (específica FC), (Sigma-AldrichCo., Ltd., Reino Unido)
	CCHFV
	Coelho soro Anti-FHCC (NP), (in-house)
	Conjugado com FITC de cabra anti-IgG de coelho (H + L), (Jackson ImmunoResearch, Baltimore, EUA)
	RVFV
	anticorpospoliclonais de rato (fornecido por Michele Bouloy, Instituto Pasteur, Paris).
	Coelho conjugado com FITC anti-ratinho de imunoglobulinas, (DakoCytomation, Dinamarca)
	DENV 1
	Monoclonal de ratinho para o vírus dengue glicoproteína E, (Abcam, Cambridge, Reino Unido)
	Conjugado com FITC de cabra anti-IgG de ratinho, (Jackson ImmunoResearch, Baltimore, EUA)
	YFV
	Monoclonais de ratinho para amarelo vírus da febre, (Abcam, Cambridge, Reino Unido)
	Conjugado com FITC de cabra anti-IgG de ratinho, (Jackson ImmunoResearch, Baltimore, EUA)
Febres hemorrágicas virais (FHV) são causadas por vários vírus de febre hemorrágica (VAF): Arenaviridae, Filoviridae, Bunyaviridae e Flaviviridae. Há apenas alguns laboratórios especializados em pesquisa sobre estes agentes. Informações virológicas básicas sobre estes vírus é escassa e descrito exclusivamente no quadro de relatos de casos e modelos animais. Embora algum progresso tem sido alcançado no que se diz respeito à interação desses vírus com mecanismos de imunidade inata e as vias de óxido de nitrito (CCHFV). Informação concisa sobre as suas características virológicas básicas são limitadas. Este tipo de dados, porém, é importante para a biossegurança e fins de avaliação de risco. Aqui, apresentamos uma análise comparativa das quantidades de HFV em cultura de células determinada por contagem em microscópio eletrônico, PCR quantitativo em tempo real e focando nas unidades formadores, que revelam alguns aspectos da replicação destes vírus que não foram descritos antes. 
Métodos 
 Propagação de vírus 
Estoques virais foram preparados a partir do Lassa vírus(LasV) cepa Josiah, o vírus Ebola Zaire (EBOVZ) cepaMayinga, Ebola Sudão vírus (EBOSV) cepas Maridi e Boniface, virusMarburg (MARV) cepas Ravn, Ozolin e Musoke, Crimean-Congo vírus da febre hemorrágica CCHFV) cepaIbar 10200, vírus da febre do Vale do Rift (RVFV) cepa ZH 548, Dengue 1 do vírus (DENV 1) cepa293, vírus da febre amarela (YFV) cepaAsibi. Células Veroconfluentes (ATCC CCL-81) foram inoculadas com o respectivo vírus e cresceram entre 1 e 10 dias nomeio essencial mínimo (MEM) suplementado com penicilina / estreptomicina solução, HEPES e 2% de soro fetal de vitelo inactivado aquecido (todos Gibco®BRL, Invitrogen, Life Technologies, Paisley, Reino Unido), a 37 ° C. os sobrenadantes com o vírus da progenitura foram recolhidos e estocados em -80 graus Celsius antes de serem usados.
Determinação das quantidades de vírus
Os títulos de vírus foram determinados a partir de 1 ml de sobrenadante de cultura de tecidos com vírus por (i) microscopia electrónica (EM), (ii) PCR em tempo real quantitativa (qPCR) de genomas de RNA extraído a partir do sobrenadante da cultura e (iii) determinação das unidades formadoras de focos ( FFU) em monocamadas de células infectadas com o sobrenadante utilizando anticorpos fluorescentes.
As contagens genoma viral foram geralmente de 1 a 2 ordens de grandeza (log10-passos) mais elevados do que as contagens de partículas (Tabela 3, coluna 4). As contagens de unidades formadoras de foco mostrou muito maiores diferenças sendo até( 5 log10-passos) mais baixas do que as contagens de partículas (Tabela 3, coluna 5) e 1-6 log10-passos mais baixas do que a contagem de genoma (Tabela 3, coluna 6).
 As cepas EBOZV( ebola- Zaire) e EBOSV( ebola- Sudão) mostraram uma contagem de genoma 2 log10-passo maior do que a contagem de partículas, mas muito menor FFU contagens diferentes de -3 a -5 log10-passos da contagem de partículas. As cepas de vírus de MarburgoRavn e Ozolin mostraram-se quase iguais as contagens de partículas e genoma , enquanto o Vírus de MarburgoMusoke mostrou uma redução -1 log10-passo na contagem de genoma em comparação com a contagem de partículas. Quanto a EBOZV e EBOSV, as contagens FFU das cepas Marv( Vírus de Marburgo) eram -3 a -4 log10-passos mais baixas do que as contagens de partículas. A diferença entre a contagem de genoma e de partículas para LasV( Lassa Vírus), RVFV( Vírus da febre do Vale Rift) e DENV( Vírus da dengue) foi entre 1-2 log 10 etapas. A redução FFU a partir da contagem de partículas para estes vírus variou entre -2 e -3 log10-passos.
YFV ( vírus da febre amarela) foi o único vírus que a contagem do número de partículas e de FFU se igualou, coberto apenas por uma contagem de genoma 1 log10-passo e a menor diferença (-1 log10-passo) da FFU contar para a contagem de genoma.
Além de YFV( vírus da febre amarela) , Vírus da febre da Crimeia- Congo(CCHFV) apresentou o menor nível de diferença entre FFU e contagem de partículas (-1 log10-passo). Em comparação com um YFV log10-passo aumentou a contagem de um genoma sobre a partícula, portanto, conduz a uma redução log10 -2-passo da contagem do FFU para a contagem de genoma.
Para interpretar os dados obtidos, a relação foi formada entre os três conjuntos de dados quantitativos. As proporções observadas de partículas / FFU (tabela 4, coluna 1) apontam que, para LasV, CCHFV e YFV apenas poucas partículas (1- 10²) estão associados com um FFU, enquanto que para todos os outros vírus quantidades muito mais elevadas (10³-105) foram contadas (103 para EBOZV, VMDR Ravn, VMDR Ozolin, RVFV e DENV 1- 104 para EBOSV Boniface, VMDR Musoke e 105 para EBOSV Maridi).
A relação de genomas por partícula e sua recíproca (tabela 4, coluna 2 e 3) indicam que a maioria dos vírus aparece para ser overproducing genomas para guardar uma fracção de genomas em invólucros para criarpartículas completas. EBOZV, EBOSV e RVFV parecem produzir um excedente genômica na faixa de 74 - 336 em relação às conchas produzidas, enquanto esse excedente é de magnitude reduzida para LasV, DENV e YFV (cerca de 15-20). VMDR parece ser eficientemente um invólucro para todos os 3º 5º genoma em uma partícula (tabela 4, coluna 3) atingir este por um ligeiro excesso de produção de “conchas”. A maquinaria CCHFV produz 23 conchas vazias de 1 partícula embalado com um genoma. Os genomas embalados, porém, são altamente infecciosa, tal como indicado pelo valor de 1 para a relação de FFU / genomas (Tabela 4 coluna 4).
Discussão
A análise quantitativa comparativa dos títulos de vírus em cultura de células usando três métodos independentes revelou alguns insights sobre a eficiência de embalagem dos vírus analisados. Os genomas virais de RNA foram quantificados a partir de sobrenadantes de cultura de células, o que certamente continham genomas de RNA livres a partir de células lisadas durante todo o vírus, exceto para Vírus da febre hemorrágica da Crimeia Congo (CCHFV), que não induz uma efeito citotóxico em células Vero. No entanto, existem algumas diferenças importantes na magnitude de genomas e na produção de partículas observadas. No grupo dos filovírus parece haver uma separação clara entre as características de crescimento de vírus Ebola Zaire (EBOZV) e vírus Ebola Sudão(EBOSV) por um lado, e cepas de virus Marburg (MARV) , por outro lado. Embora os vírus Ebola pareçam produzir 2 log10 excedente de genomas sobre as partículas detectável na microscopia eletrônica, a partícula e valores de genoma para VMDR estão quase no mesmo nível. Surpreendentemente, apesar da produção de 108-109 ,de partículas dos tipos de filovírus, parecem produzir relativamente poucas partículas infecciosas, com FFU faz a contagem regressiva de 3 a 4 log10- de cepas da quantidade de partículas (e genomas) para MARV e 4 a 5 log10 para EBOZV e EBOSV. Devido ao excesso de produção,quantidades resultante de FFU ainda são verdadeiras, mas parece que embalagem genomica eficiente por Marv (1 genoma em 3-5partículas) mediante produção de mais reservatórios de genomas faz não conduzir a uma elevada taxa de partículas infecciosas, como sobre 1000 partículas são necessários para induzir um FFU. Para EBOZV e EBOSV uma produção de 100 vezes de genomas só rende uma quantidade ainda menor de partículas de doenças infecciosas, como 103-105 são necessários para induzir um FFU. Isto Parece justo dizer que ,pelo menos como observado em cultura de células,as partícula e a produção genomica parece se esgotar em sincronia com o resultando em uma quantidade proporcionalmente baixa de partículas de doenças infecciosas.Em experimentos animais, para EBOZV em doses baixas a partir de uma unidade apresenta formação de placas suficientes para causar infecção[16]. A quantidade de partículas registradas para um FFU indicam que, embora a produção de partículas não é muito eficiente de fato a alta quantidade total de partículas presentes na placa garantia uma infecção.O crescimento celular de RVFV parece comparável à de EBOZV Mayinga com rendimentos muito elevados de partículas (10^8) e de genomas (10^11) levando a um genoma em 119 estando empacotada numa partícula dos quais 10^3 são necessários para induzir um FFU. Em experiências recentes, ovelhas foram inoculadas ,com sucesso ,com RVFV a uma dose de 1 × 10^5 TCID50 [17]. TCID50 e FFU não são fáceis de se relacionar, mas parece que Há ainda muito espaço para determinar uma infecção com dose muito menor de RVFV. A diferença entre a contagem de partículas para a contagem de genoma para LASV é baixo e reflete em um genoma de partículas a proporção de 22 ,indicando uma boa correlação entre e partículas de vírus produzidos pelos genomas. A eficiência das partículas de vírus e da sua infecciosidade (100 / UFF) observada em cultura de células é refletido pelo fato de modelos animais poderem ser altamente suscetível à infecção letal como por exemplo, a 2 PFU por tensão inata da cobaia (porco)13 [18]. A eficiência similar das partículas passado foi observado em tecidos LASV marmoset infectadas por vírus,que continham quantidades significativas de RNA viral comparável com níveis de viremia (medido em UFP) .O melhor rendimento de partículas corretamente embalados é obtido por YFV e CCHFV indicando sincronização eficiente do escudo e produção do genoma (tabela 4,coluna 4) por estes vírus. DENV pacotes de genomas ainda mais eficiente do que LASV e YFV (1 em 15 em comparação com 1 em 20). O DENV tempartículas resultantes , contudo, muito menos infecciosa YFV do que as partículas e cerca de 103 são necessários para induzir uma UFF.YFV apresenta-se como o pacote mais eficiente, levando a uma relação muito elevada de partículas infecciosas uma vez que é o único vírus para o qual contagem de partículas e contagem de FFU são os mesmos. A partir da proporção formada parece que um ligeiro excesso de produção de genomas (1 log10 – intensifica a partir da contagem de partículas) é propício a um genoma com proporção de embalagem 1 em 21 dos quais apenas quatro são necessários para induzir uma FFU. Macacos rhesus foram com sucesso infectados com 7×102 unidades formadoras de placas (PFU) determinado no vero E6 células [20]. Os nossos resultados mostram que partículas YFV na verdade, são altamente infecciosa e que a dose infecciosa necessária para modelos animais pode ser ainda abaixo da dose utilizada. O CCHFV não induziu um CPE em células Vero e genomas de RNA viral, portanto, adicionais liberados por células lisadas não contribuem para a contagem de genoma. Portanto as modalidades de montagem de partículas infecciosas CCHFV é inversa aos dos outros vírus, uma vez que apenas 24partículas irá realmente conter um genoma que conduz para um excedente de conchas vazias. A correta montagem de partículas ,no entanto, são altamente infecciosas como cada um deles induz uma UFF. Na análise EM partículas CCHFVmal formadas foram notadas (veja a Figura 1). Partículas interferentes defeituosas (DIP) foram descritas para quase todos os DNA e RNA virais. DIP têm uma influência sobre os rendimentos de vírus viáveis (medido em PFU) em cultura de células. Proporções particulares de vírus viáveis são preditoras para bons ou maus rendimentos de progênie viral. Os modelos matemáticos para essa relação foram estendidos recentemente [21]. AsCCHFV infecciosas (1 genoma / FFU) indicam que as partículas CCHFV malformads observadas podem conduzir DIP a este tipo de rendimento.
Um estudo recente mostrou que 10 FFU suficiente para matar IFNAR - / - camundongos sem o receptor de IFN. Estes ratos não desenvolvem uma resposta daimunidade inata e, por conseguinte, desenvolvemuma doença aguda que lhes conferem como um bom modelo para a infecção e doença CCHFV [22]. Estes resultados confirmam a infecciosidade extraordinária das partículas CCHFV observadas em nosso estudo.
Conclusão
Os títulos de vírus analisados quantitativamente indicam que os vírus YFV e CCHFV são os mais eficientes na produção de partículas infecciosas. Esses vírus conseguem sincronizar genoma e produção de partículas de forma ideal,ao contrário, por exemplo, dosfilovírus com umaaparente e ineficiente produção de genomas e partículas. YFV e CCHFV representam uma ótima sincronização das estratégias de replicação, ou seja, superprodução observada dos genomas e superprodução da casca, respectivamente.