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Técnicas Experimentais em 
Biotecnologia
Técnicas Experimentais em Biotecnologia
• Reação em cadeia da polimerase (PCR) 
• Eletroforese em gel de agarose 
• Sequenciamento de DNA 
• Processo de Clonagem
Reação em cadeia da polimerase (PCR)
Amplificação de um segmento específico de DNA dentro 
de um genoma.
PCR – Reação em Cadeia da Polimerase
Reação em cadeia da polimerase (PCR)
Reação em cadeia da polimerase (PCR)
Primeira etapa: Denaturação do DNA 
 Segunda etapa: Anelamento 
 Terceira etapa: Extensão
Fonte: Induslab. APPLIED BIOSYSTEMS 
 
Reação em cadeia da polimerase (PCR)
Reação em cadeia da polimerase (PCR)
DENATURAÇÃO
95 oC
30 - 60 segundos
Reação em cadeia da polimerase (PCR)
ANELAMENTO
50 - 65 oC
30 segundos
Primer forwardPrimer reverse
Reação em cadeia da polimerase (PCR)
EXTENSÃO
72 oC
30 - 60 segundos
Taq polimerase
Reação em cadeia da polimerase (PCR)
25-35 ciclos 
1 / 1:30 h
Reação em cadeia da polimerase (PCR)
Pontos Chaves da PCR: 
• primer - temperatura de anelamento 
• extensão - tempo de reação
Reação em cadeia da polimerase (PCR)
Primer: 
• especificidade 
• eficiência
Ambos os primers (forward e reverse) no sentido 5’-> 3’ 
Tamanho: 18 - 25 bp 
%GC: 40 - 60 
Tm: 50 - 65 °C => Tm ≈ 2°C × (A+T) + 4°C × (G+C)
 TCGATCGACTAGCATCGATCG -5’ 
5'- ATGCGTACGTTAGCTACGATCGGATCCGATCGTACGTAGCTAGCTACGTAGCTAGCTGACGTAGCTAGCTAGCGTAGCTGATCGTAGCTAGCTGATCGTAGCTAGC -3’ 
3'- TACGCATGCAATCGATGCTAGCCTAGGCTAGCATGCATCGATCGATGCATCGATCGACTGCATCGATCGATCGCATCGACTAGCATCGATCGACTAGCATCGATCG -5’ 
5’- ATGCGTACGTTAGCTACGA
Reação em cadeia da polimerase (PCR)
5'- ATGCGTACGTTAGCTACGATCGGATCCGATCGTACGTAGCTAGCTACGTAGCTAGCTGACGTAGCTAGCTAGCGTAGCTGATCGTAGCTAGCTGATCGTAGCTAGC -3’ 
3'- TACGCATGCAATCGATGCTAGCCTAGGCTAGCATGCATCGATCGATGCATCGATCGACTGCATCGATCGATCGCATCGACTAGCATCGATCGACTAGCATCGATCG -5’
5'- ATGCGTACGTTAGCTACGATCGGATCCGATCGTACGTAGCTAGCTACGTAGCTAGCTGACGTAGCTAGCTAGCGTAGCTGATCGTAGCTAGCTGATCGTAGCTAGC -3’ 
3'- TACGCATGCAATCGATGCTAGCCTAGGCTAGCATGCATCGATCGATGCATCGATCGACTGCATCGATCGATCGCATCGACTAGCATCGATCGACTAGCATCGATCG -5’
 TCGATCGACTAGCATCGATCG -5’ 
5'- ATGCGTACGTTAGCTACGATCGGATCCGATCGTACGTAGCTAGCTACGTAGCTAGCTGACGTAGCTAGCTAGCGTAGCTGATCGTAGCTAGCTGATCGTAGCTAGC -3’ 
3'- TACGCATGCAATCGATGCTAGCCTAGGCTAGCATGCATCGATCGATGCATCGATCGACTGCATCGATCGATCGCATCGACTAGCATCGATCGACTAGCATCGATCG -5’ 
5’- ATGCGTACGTTAGCTACGA
95 oC
Tm ?
Reação em cadeia da polimerase (PCR)
 CGATCGACTAGCATCGATCG -5’ 
5'- ATGCGTACGTTAGCTACGATCGGATCCGATCGTACGTAGCTAGCTACGTAGCTAGCTGACGTAGCTAGCTAGCGTAGCTGATCGTAGCTAGCTGATCGTAGCTAGC -3’ 
3'- TACGCATGCAATCGATGCTAGCCTAGGCTAGCATGCATCGATCGATGCATCGATCGACTGCATCGATCGATCGCATCGACTAGCATCGATCGACTAGCATCGATCG -5’ 
5’- ATGCGTACGTTAGCTACGA 
 12 34 567 89 10 
 123 45 67 89 
 
Tm ≈ 2°C × (A+T) + 4°C × (G+C) 
Pf = 2(10) + 4(9) = 56 °C 
Pr = 2(9) + 4(10) = 58 °C
Fórmula útil para primers curtos e em condição padrão de sal (50 mM 
NaCl, pH neutro). 
Fórmula desconsidera: 
 - Efeitos de concentração de sal (ex.: Mg²⁺, que aumenta a *Tm*). 
 - Presença de agentes desnaturantes (como DMSO). 
 - Comprimento do primer 
Influência do Mg2+ (em geral aumenta a Tm) 
- Excesso de Mg²⁺ pode levar a ligações inespecíficas. 
- Deficiência de Mg²⁺ pode reduzir a eficiência da amplificação.
Reação em cadeia da polimerase (PCR)
5’- CGGCATGCGTA|CGTTAGCTACGATCGGATCCGATCGTACGTAGCTAGCTACGTA…GCTAGCTATAGCAGCGTAGCTGATCGTAGCTAGCTGATC|GTAGCTAGCGGCC -3’ 
3'- GCCGTACGCAT|GCAATCGATGCTAGCCTAGGCTAGCATGCATCGATCGATGCAT…CGATCGATATCGTCGCATCGACTAGCATCGATCGACTAG|CATCGATCGCCGG -5’
sequência alvo da amplificação
região alvo do primer região alvo do primer
Eletroforese em gel
Como Analisar o produto da PCR?
Eletroforese em gel
Como Analisar o produto da PCR?
Eletroforese em gel
Eletroforese em gel
Revelação do Gel
Eletroforese em gel
Sequenciamento de Sanger (1977)
Sequenciamento de Sanger (1977)
Fonte: Biologia Molecular da célula. Alberts 5 Ed. 
Sequenciamento de Sanger (1977)
No método tradicional: 
• DNA 
• DNA polimerase 
• primer 
• ddNTPs marcados radioativamente com fósforo 32 
• dNTPs (nucleotídeos)
Sequenciamento de Sanger (1977)
Fonte: Biorede 
Sequenciamento de Sanger (1977)
Sequenciamento de Sanger (1977)
Método automatizado:
Fonte: Adaptado do Estevez J.
Sequenciamento de Sanger 
Método automatizado:
Fonte: Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA. Bernard R. Glick, Jack J. 
Pasternak
Biologia Molecular e Biotecnologia
Prof. Luciano Puzer
PROVA 1
01 de Julho de 2025