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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS ESCOLA DE VETERINÁRIA COLEGIADO DE PÓS – GRADUAÇÃO INFLUÊNCIA DE RAÇAS BOVINAS NA COMPOSIÇÃO E CONTAGEM DE CÉLULAS SOMÁTICAS DO LEITE NO ESTADO DE MINAS GERAIS LETÍCIA FONSECA FERREIRA BELO HORIZONTE - MG ESCOLA DE VETERINÁRIA DA UFMG 2019 Letícia Fonseca Ferreira 2 INFLUÊNCIA DE RAÇAS BOVINAS NA COMPOSIÇÃO E CONTAGEM DE CÉLULAS SOMÁTICAS DO LEITE NO ESTADO DE MINAS GERAIS Dissertação apresentada à Escola de Veterinária da Universidade Federal de Minas Gerais – UFMG, como requisito para obtenção do grau de Mestre em Ciência Animal. Área de concentração: Tecnologia e Inspeção de Produtos de Origem Animal. Orientador: Leorges Moraes da Fonseca. BELO HORIZONTE - MG ESCOLA DE VETERINÁRIA DA UFMG 2019 3 4 5 “Quanto mais aumenta nosso conhecimento, mais evidente fica nossa ignorância”. John F. Ke 6 AGRADECIMENTOS Agradeço primeiramente a Deus, por me iluminar sempre e a Nossa Senhora por me cobrir com seu manto de proteção. A minha família por estar presente me incentivando e motivando. Ao meu pai, Sérgio, por sempre ter uma mensagem bem humorada para tornar o dia mais leve. A minha mãe, Margarida, pelo exemplo de força e determinação, me ajudando em todos os momentos bons e difíceis dessa longa caminhada, em especial no cuidado da nossa Ana. Ao meu irmão e minha cunhada, Adriano e Marília, por serem paz e sorrisos sempre que presentes, completando nossa família com mais amor com a chegada de Benício. A minha sogra, Cidinha, pela disponibilidade infinita de auxílio. A minha gata Doralice pelos seis anos de aconchegos quentinhos e muitos ronrons nos dias mais difíceis. Ao meu marido Jonathan, por ser o companheiro de uma vida, trazendo felicidade e um amor incondicional. A minha amada filha Ana Carolina, que me ensina a cada dia ser mais paciente, responsável e companheira, enchendo meus dias de um amor e felicidade que nem imaginei que existissem. Você, pequena, é quem me traz ânimo pra ser a minha melhor versão todos os dias. Ao professor Dr. Leorges Moraes da Fonseca, pela compreensão e paciência durante a orientação do mestrado e iniciação científica, pela amizade construída neste período e pelo exemplo de ser humano e profissional. A todos os professores do DTIPOA pelos ensinamentos transmitidos com boa vontade e carinho. Ao professor Dr Lívio Molina, por ser meu primeiro guia na formação profissional. A todo o pessoal do LabUFMG pela disponibilidade de auxílio. A Associação Paranaense de Criadores de Bovinos da Raça Holandesa (APCGH) pela utilização do SISTEMA WebLeite® de análise dos dados. Aos colegas da pós-graduação pelos momentos de descontração e auxílio em especial a Juliana, pela estadia acolhedora em momentos de necessidade. Aos amigos da Vet, principalmente do Projeto Unileite, pelos anos de estudos e amizade, em especial ao Hilton, Marina, Roberta, Clarissa, Pedro e Andreia. Aos meus amigos de Bom Jesus, pelos mais de 20 anos de amizade e companheirismo, em especial a Ana Carolina, que mesmo distante está sempre presente nos meus dias me apoiando. A todos que contribuíram direta ou indiretamente para a realização deste trabalho. A Escola de Veterinária, a FAPEMIG e ao CNPq. 7 Sumário RESUMO ......................................................................................................................... 10 ABSTRACT ..................................................................................................................... 11 1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................ 12 2. OBJETIVOS ............................................................................................................. 13 2.1 GERAL ......................................................................................................................... 13 2.2 ESPECÍFICOS ............................................................................................................... 13 3. REVISÃO DE LITERATURA .................................................................................. 13 3.1 PARÂMETROS DE AVALIAÇÃO DA COMPOSIÇÃO DO LEITE ........................................... 13 3.1.1 CONTAGEM DE CÉLULAS SOMÁTICAS (CCS) ............................................................ 15 3.1.2 TEOR DE GORDURA NO LEITE ................................................................................... 20 3.1.3 TEOR DE PROTEÍNA NO LEITE .................................................................................. 22 3.1.4 TEOR DE LACTOSE NO LEITE..................................................................................... 26 3.2 ANÁLISE DE COMPONENTES PRINCIPAIS ..................................................................... 28 3.3 IDADE DOS ANIMAIS ............................................................................................. 29 3.4 RAÇAS ....................................................................................................................... 30 4 MATERIAL E MÉTODOS ....................................................................................... 32 4.1 AMOSTRAGEM ............................................................................................................. 32 4.2 ANÁLISES LABORATORIAIS .......................................................................................... 33 4.3 ANÁLISE ESTATÍSTICA ................................................................................................. 34 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................................ 34 5.1 CONTAGEM DE CÉLULAS SOMÁTICAS (LOG10* 1000/ML) NAS DIFERENTES FAIXAS ETÁRIAS NAS RAÇAS GIR, GIROLANDO, HOLANDESA, JÉRSEY E MESTIÇA-SRD. ................ 34 5.2 VARIAÇÃO DOS VALORES DE GORDURA, PROTEÍNA E LACTOSE EM CADA FAIXA ETÁRIA NAS RAÇAS GIR, GIROLANDO, HOLANDESA, JÉRSEY E MESTIÇA-SRD .................. 38 8 5.3 ANÁLISE DOS COMPONENTES PRINCIPAIS .............................................................. 42 6 CONCLUSÕES ......................................................................................................... 44 7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................................................... 45 LISTA DE QUADROS Quadro 1 - Quadro 2 - Características e Composição das células somáticas em leite saudável de bovinos Comparação entre o número de carbonos dos ácidos graxos e sua origem LISTA DE FIGURAS Figura 1 – Composição do leite. Figura 2 - Modelo da micela de caseína Figura 3 - Esquema da molécula da lactose LISTA DE TABELAS Tabela 1 – Tabela 1. Correlação entre os valores de CCS nas 5 faixas etárias das raças Gir, Girolando, Holandês, Jérsey e Mestiça-SRD.Faixas etárias: 1 (20-36 meses), 2 (37- 48 meses), 3 (49 a 60 meses), 4 (61 a 96 meses) e 5 (>96meses). Tabela 2. Correlação entre os valores de gordura, proteína e lactose em nas 5 faixas etárias das raças Gir, Girolando, Holandês, Jérsey e Mestiça-SRD. Faixas etárias: 1 (20-36 meses), 2 (37-48 meses), 3 (49 a 60 meses), 4 (61 a 96 meses) e 5 (>96 meses). 9 LISTA DE GRÁFICOS Gráfico 1 – Distribuição dos valores de CCS e Lactose (g/100g) nas 5 faixas etárias das raças Gir, Girolando,em especial Jérsey e 45 Holandesa. De acordo com o apresentado no estudo esses dados possuem uma relação direta já relatada por outros autores. . Os valores de Proteína não sofreram variações relevantes nas diferentes faixas etárias estudadas e entre as raças, mesmo que na raça Jersey esses valores fossem um pouco mais elevados. Entretanto, foi visto que nas raças Girolando e Holandesa há maior correlação entre gordura e proteína do que nas demais raças, sendo menor na raça Gir. Adicionalmente, os valores de gordura apresentaram maiores variações e valores na raça Jersey, em concordância com sua característica de grande produção de sólidos. Em relação à lactose, as raças de maior aptidão leiteira avaliadas apresentaram maior queda com o aumento das faixas etárias, queda esta correlacionada com o aumento das CCS. Há ainda maior correlação entre os dados nas raças Holandesa e Girolando, principalmente em relação à Gir, o que pode ser decorrente de diferentes objetivos de seleção genética. 7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ALI, A.K.A; SHOOK, G.E. Na optimum transformation for somatic cell concentration in milk. 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Sabendo da importância do leite para a economia brasileira, é necessário elucidar os fatores que podem influenciar na composição e qualidade deste produto. O objetivo desse estudo foi estabelecer a influência de diferentes raças bovinas em alguns dos componentes do leite. No estudo foram analisados 38374 amostras de leite individual de animais de propriedades do estado de Minas Gerais coletadas no período entre 2011 e 2017. As coletas foram realizadas pelos funcionários das propriedades, de acordo com as instruções do Laboratório de Análise da Qualidade do Leite da Escola de Veterinária UFMG (LabUFMG). Os resultados foram obtidos após análise de composição e contagem de células somáticas das amostras no LabUFMG. As análises incluíam gordura, proteína, lactose (g/100g) por meio de FTIR e contagem de células somáticas por citometria de fluxo. Os resultados de contagem de células somáticas (CCS) foram transformados para a função logarítmica, para se obter uma distribuição normal dos dados, os quais foram separados em 5 faixas etárias: 1 (20-36 meses), 2 (37-48 meses), 3 (49 a 60 meses), 4 (61 a 96 meses) e 5 (>96 meses). As raças presentes no estudo foram Gir, Girolando, Holandesa, Jersey e Mestiça-SRD de acordo com classificação dos responsáveis pela propriedade. Os resultados encontrados mostram um aumento dos valores de CCS em todas as raças em decorrência do aumento da idade dos animais. A raça Holandesa apresentou os maiores valores médios de CCS. Os menores valores de CCS foram encontrados na raça Jersey. Os valores de gordura apresentaram maiores valores na raça Jersey, em concordância com sua característica de grande produção de sólidos. Enquanto isso, os valores de Proteína não sofreram variações relevantes nas diferentes faixas etárias estudadas e entre as raças. Foi relatado que nas raças Girolanda e Holandesa há maior correlação entre gordura e proteína do que nas demais raças, sendo esta menor na raça Gir. De maneira geral, houve queda dos teores da lactose nas raças de maior aptidão leiteira com o aumento das faixas etárias, o que poderia estar ligado a menor rusticidade destas raças, com consequente queda de produção após maior tempo de exposição a diversos fatores desafiadores. Esta queda nos teores de lactose está inversamente correlacionada com a CCS, como foi visto nos gráficos de cargas fatoriais da análise de componentes principais. Houve também maior correlação entre os dados nas raças Holandesa e Girolando, principalmente em relação à Gir, o que pode ser decorrente de diferentes objetivos de seleção genética. Os resultados mostraram a importância da identificação dos fatores que podem influenciar de maneira mais determinante na composição e qualidade do leite, além da necessidade de identificação e monitoramento dos dados de todos os animais da propriedade. Palavras chave: raças, qualidade do leite, CCS, gordura, proteína, lactose. 11 ABSTRACT Milk production has been growing steadily in Brazil, especially in the state of Minas Gerais, which is te major milk producer in Brazil. Knowing the importance of milk for the Brazilian economy, it is necessary to elucidate the factors that may influence the composition and quality of this product. The aim of this study was to establish the influence of different cattle breeds on some of the milk components. In the study 38374 samples of individual milk from animals from Minas Gerais State farms collected between 2011 and 2017 were analyzed. The collections were performed by the employees of the farms, according to the instructions of the Milk Quality Laboratory Veterinary School, Universidade Federal de Minas Gerais (LabUFMG).Analyzed componentes included fat, protein, and lactose (g/100g) using FTIR and somatic cell couts through flow citometry. Somatic cell count (SCC) results were transformed to the logarithmic function to allow normal data distribution. All data were separated into 5 age groups: 1 (20- 36 months), 2 (37-48 months), 3 (49 to 60 months), 4 (61 to 96 months) and 5 (> 96 months). The breads present in the study were Gyr, Girolando, Holstein, Jersey and Mestiça-SRD according to the classification of those responsible for the property. The results show an increase in milSCC for Girolando breed k SCC values for all breeds due to the increasing age of the animals. The Holstein presented the highest values of SCC averages., presented values with more linear distribution increase than the others, which may be linked to the influence of Gyr genetics in its composition, which confers greater rusticity. The Jersey breed maintained the lowest SCC values. Fat confear larger variations and values in the Jersey breed, in agreement with its characteristic of great production of solids. Meanwhile, Protein values did not change significantly in the different age groups studied and between races. For Girolando and Holstein breeds there is a higher correlation between fat and protein than in the other races, which is lower in the Gir breed. In general, there was a decrease in lactose levels for breeds with higher milk production with increasing age, which could be linked to higher susceppility of these breeds, with consequent drop in production after longer exposure to several challenging factors. This drop in lactose levels is inversely correlated with SCC, as seen in the principal component analysis graphs. There was also a higher data correlation between Holstein and Girolando breeds, which may be due to different genetic selection objectives. The results showed the importance of identifying the factors that may be the composition and quality of milk, as well as the need to identify and monitor the data of all animals on the property. Key words: races, milk quality, SCC, fat, protein, lactose 12 1. INTRODUÇÃO O controle de dados zootécnicos era pouco utilizado nas propriedades leite iras no Brasil até meados de 1990, principalmente devido aos altos custos. A falta de registro dos dados do rebanho dificultava a utilização de metodologias eficientes de seleção, diminuindo assim a eficiência do processo (GONÇALVES et al, 1999). Segundo SOARES (2012), a partir de 1991 a atividade leiteira no Brasil iniciou um processo de intensa transformação. Isto resultou na introdução dos conceitos de logística integrada, utilização de softwares e programas de gerenciamento mais eficientes nas propriedades, além de uma expansão dos estudos sobre a influência da genética na produção de leite, possibilitando um aumento no banco de dados das associações de raças bovinas leiteiras. A busca por compet itividade em um mercado aberto e com preços livres possibilitou que a produtividade fosse o principal fator a explicar o crescimento da produção, ao contrário do passado em que o aumento de produção se dava principalmente pelo aumento do rebanho. Este trabalho visa à realização de umestudo sobre a influência que as diferentes raças podem exercer sobre a produção e qualidade do leite. De acordo com AULDIST et al (1998) a qualidade e produção de leite são influenciadas por diversos fatores, entre eles estão os fatores ambientais (como sazonalidade e pluviosidade), fatores genéticos (como raça do animal e genes associados à maior produção total ou de algum componente específico) e alterações fisiológicas associadas ao estágio de lactação ou a patologias, alé m de alguns fatores socioeconômicos, que têm sido alvo de estudos. Ainda segundo AULDIST et al (1998), na maioria dos casos o que irá ocorrer é uma interação entre os diversos fatores. Apesar da interação existente, é importante realizar a avaliação indivi dual dos mesmos, para elucidar seu nível de influência nos diversos índices. 13 Ao utilizarmos os controles zootécnico e sanitário dos dados das propriedades, a avaliação individual dos fatores de influência se torna possível, pois todos os dados de acompanhamento necessários estão disponíveis nessa plataforma. A partir do momento em que o fator que exerce maior influência é descoberto, o técnico pode se concentrar no controle deste fator para melhorar a qualidade e a produção de leite. Ao realizar este es tudo de abrangência estadual, podemos destacar a influência de diversas raças na produção e qualidade do leite. 2. OBJETIVOS 2.1 Geral 2.1.1 Avaliar os efeitos das diferentes raças bovinas na composição e contagem de células somáticas do leite de rebanhos leiteiros no Estado de Minas Gerais. 2.2 Específicos 2.2.1 Analisar os dados de gerenciamento de rebanhos leiteiros coletados por produtores associados ao Laboratório de Análise da Qualidade do Leite da Escola de Veterinária da UFMG (LabUFMG); 2.2.2 Avaliar a correlação entre as diferentes raças bovinas e a composição e contagem de células somáticas do leite em rebanhos leiteiros no estado de Minas Gerais; 2.2.3 Avaliar a correlação entre a idade dos animais e a composição e contagem de células somáticas do leite em rebanhos leiteiros no estado de Minas Gerais; 3. REVISÃO DE LITERATURA 3.1 Parâmetros de avaliação da Composição do Leite 14 Segundo ABREU (1999) o leite é um produto de alta complexidade, sendo difícil estabelecer uma definição única e precisa. De uma maneira geral, o leite pode ser definido segundo três quesitos: fisiológico, físico -químico e higiênico. Sob o ponto de vista fisiológico, o leite pode ser definido como sendo o produto de secreção das glândulas mamárias das fêmeas mamíferas, logo após o parto, com a finalidade de alimentar o recém-nascido na primeira fase de sua vida. Já sob o ponto de vista físico-químico, o leite é uma emulsão natural perfeita, na qual os glóbulos de gordura estão mantidos em suspensão, em um líquido salino açucarado, graças à presença de substâncias proteicas e minerais em estado coloidal. (ABREU,1999) A definição de leite sobre o ponto de vista higiênico foi apresentada no Congresso Mundial de Laticínios, na Suíça em 1917. Baseando -se nos aspectos higiênicos, o leite é o produto íntegro da ordenha total e sem interrupção de uma fêmea leiteira em bom estado de saúde, bem alimentada e sem sofre r cansaço, isento de colostro, recolhido e manipulado em condições higiênicas. Desta forma, obtem-se então um produto agradável (com preservação das suas propriedades de sabor, cor, odor, viscosidade), limpo (livre de sujidades, microrganismos e resíduos), íntegro (composição correta e conservação adequada), em ausência de patógenos e toxinas microbianas (ABREU, 1999; BRASIL, 1952). A função do leite na natureza é a de nutrir e fornecer proteção imunológica para o mamífero na primeira fase de sua vida. O leite tem sido um alimento para o ser humano desde épocas remotas, sendo o leite da vaca um dos mais consumidos e processados em todo o mundo. Sabidamente o leite bovino possui um alto valor nutritivo, constituindo-se de um alimento complexo, com mais de 100.000 compostos químicos já identificadas (BRESSAN et al., 1999). A qualidade do leite é definida por parâmetros de composição química, características físico-química, higiene e integridade. A presença e os teores de proteína, gordura, lactose e sais determinam a qualidade da composição, que por sua vez, é influenciada pela alimentação, manejo, genética e raça do animal. Fatores ligados a cada animal, como o período de lactação, o escore cor poral ou 15 situações de estresse também são importantes quanto à qualidade composicional. (BRITO e BRITO, 2006) A qualidade do leite produzido e armazenado nas propriedades leiteiras influi de maneira determinante na qualidade dos produtos processados. É nesse sentido que se insere a necessidade de padronização e mensuração das características microbiológicas e físico-químicas do leite captado nas fazendas leiteiras. Um esquema da composição comumente encontrada no leite bovino pode ser visto na Figura 1. Além disso, para efeito de manutenção de um bom padrão de qualidade é fundamental que o produtor seja recompensado pela obtenção de bons resultados. (SILVA, 2006) Figura 1. Composição do leite Fonte: BLOWEY, (1992). 3.1.1 Contagem de Células Somáticas (CCS) 16 A contagem de células somáticas no leite bovino é usada como i ndicadora da qualidade do leite e para controle da mastite (SMITH, 1996). O conjunto de células brancas e células epiteliais presentes no leite são denominados células somáticas (PHILPOT E NICKERSON, 1991; HARMON, 1998). As células epiteliais são oriundas da descamação normal do tecido de revestimento e secretor interno da glândula mamária e compreendem de 2% a 25% do total de células. As células brancas de defesa ou leucócitos (macrófagos, neutrófilos polimorfonucleares (PMN) e linfócitos) constituem 75% a 98% do total de células e migram do sangue para o úbere no caso de infecç ão ou agressão (RIBAS, 2001). Os quatro principais constituintes da CCS e suas funções durante o processo defensivo podem ser vistos no quadro 1: Quadro 1. Características e composição das células somáticas de leite saudável de bovinos. Macrófagos PMNs Linfócitos Células Epiteliais Características Morfológicas Núcleo grande Núcleo Plurilobulado Núcleo denso e esférico Núcleo Esférico Funções Biológicas Fagocitose, Apresentação do antígeno, Secreção de quimiotaxinas Fagocitose, Secreção de fatores antibacterianos, Detecção de quimiotaxinas Atuação na resposta imune específica, Produção de citocinas imunoregulatórias, Lise de células autóctones lesadas Secreção de quimiotaxinas Porcentagem de cada célula no leite bovino 35 - 79 03 - 06 16 -18 02 - 15 Fonte: Adaptado de MALIK et al (2018). Devido às células de descamação, mesmo em um úbere sadio a contagem de células somáticas terá valores acima de zero. Porém, esses valores tendem a ser 17 relativamente constantes, exceto no período pós-parto, pois no colostro há grande número de células somáticas. (MILLER et al., 2004). Em contrapartida, quando ocorre uma infecção no úbere, um grande número de leucócitos migra da circulação sanguínea para o úbere para debelar os microrganismos invasores. Durante esse processo, há o aumento da CCS do leite, devido ao grande influxo de células brancas no úbere. Ao fim da infecção, a CCS do leite tende a retornar aos valores normais de um animal sadio, que são abaixo de 105 céls/mL de leite. Durante a infecção, os valores podem ser maiores que 106 céls/mL de leite. (BYTYGI et al., 2010) No início da infecção, os macrófagos são os responsáveis pela resposta inicial ao agente invasor, atuando de duas formas: fagocitose dos micro rganismos invasores (em sua maioria as bactérias) e liberação de mensageiros químicos que serão detectadospelos neutrófilos polimorfonucleares. No decorrer da infecção, os PNMs serão os responsáveis pelo aumento da CCS do leite, devido ao grande influxo dos mesmos em resposta aos mensageiros químicos liberados pelos macrófagos. Os PNMs atuam fagocitando os microrganismos e eliminando -os através da combinação de mecanismos não oxidativos e oxidativos. Enquanto isso, os linfócitos são responsáveis por reconhecer os antígenos através de receptores de membrana específicos para invadir os patógenos. Utilizando todos esses mecanismos, o organismo é capaz de eliminar os microrganismos causadores da infecção. Porém, em alguns casos, essa defesa não consegue ser efi ciente, sendo necessário o uso de medicamentos para o tratamento da infecção existente. (PHAM, 2006) Além do papel defensivo durante o processo infeccioso, as células somáticas também atuam na proteção contra essa infecção, principalmente através da secreção de enzimas. Outros fatores que influenciam na contagem de células somáticas do leite, além do processo infeccioso são: - Estágio de lactação: no pós-parto imediato há um aumento da CCS do leite, devido ao grande influxo de células de defesa (em sua maioria neutrófilos) para o 18 colostro. Após o término da secreção de colostro, entre 7 e 10 dias após o parto, a CCS diminui de 10 6 céls/mL para 10 5 céls/mL de leite. A partir deste momento, em um animal não infectado, os valores de CCS tendem a ser consta ntes por um período, até aumentarem gradativamente no final da lactação. Esse aumento ocorre devido a maior secreção de neutrófilos no final da lactação e decréscimo da secreção de macrófagos. (MIJIC´ et al., 2012) - Número e frequência de ordenhas: segundo PETTERSSON et al (2012) um aumento de 2 para 3 ordenhas no período de 24 horas diminuiu os valores de CCS do tanque e também o número de vacas com alta CCS do leite, enquanto que intervalos entre ordenhas menores do que 4 horas levaram ao aumento da CCS do leite do tanque. - Número de partos: à medida que o animal aumenta o número de partos, há um aumento da descamação das células da glândula mamária. Adicionalmente, há uma queda na eficiência da resposta imune aos patógenos que infectam a glândula mamária, que tem sido exposta a diversos tipos de patógenos durante as inúmeras ordenhas e no ambiente. Todos estes fatores juntos podem colaborar para o aumento da CCS em alguns animais com maior número de partos. (BOMB ADE et al., 2017) - Variações sazonais: de acordo com BOMBADE et al (2017) os valores de CCS costumam ser maiores no verão, provavelmente devido ao maior número de microrganismos viáveis no ambiente dos animais, principalmente devido às maiores temperaturas e umidade. - Raça: variações na CCS foram notificadas entre diferentes raças de bovinos leiteiros, sendo relatados maiores índices de células somáticas em raças exóticas de alta produção quando comparadas às raças nativas de menores produções. (KROL et al, 2013) Mesmo sofrendo interferência de diversos fatores, os valores de CCS individuais são utilizados pelas propriedades na avaliação do status sanitário do úbere dos animais, sendo uma ferramenta de controle muito utilizada atualmente. Já os valores de CCS do tanque são utilizados como indicadores da sanidade de todo o 19 rebanho, porém, os valores mínimos aceitáveis tendem a variar em relação aos diferentes países. Os valores máximos para a Contagem de Células Somáticas do leite do tanque nos Estados Unidos são de 750.000 céls/mL, porém, os valores encontrados nas propriedades estão majoritariamente abaixo de 400.000 céls/mL. (USDA, 2013) No Brasil, o valor máximo para a CCS do leite do tanque foi atualizado para 500.000 céls/mL de leite através da publicação da IN 76 em Novembro de 2018. (BRASIL, 2018) A contagem de células somáticas no leite bovino pode ser determinada utilizando-se várias técnicas de diagnóstico, que são divididas em métodos diretos e indiretos. Como exemplo dos métodos indiretos, podem ser citados o “California Mastitis Test” (CMT), o “Wisconsin Mastitis Test” (WMT) e a medida da condutividade elétrica. Como exemplo dos métodos diretos tem-se a contagem de células somáticas por microscopia direta (DMSCC) e os analisadores eletrônicos para contagem celular. Os analisadores eletrônicos baseiam-se em diferentes técnicas de análises, como a contagem de impulsos elétricos gerados pela passagem de partículas entre dois eletrodos, a fluorescência óptica e a citometria de fluxo (BABAK e RYSANEK, 1999). No princípio da fluorescência óptica, um corante se liga ao DNA das células. Esse DNA após ser corado e ao ser estimulado por uma fonte de luz emite fluorescência. A energia emitida é medida como pulsos elétricos por um sistema ótico e convertida em quantidade de células somáticas presente s na amostra (CHRISTEN, 1993). Na citometria de fluxo as células coradas são carreadas por um líquido em um capilar. O corante ligado ao material genético emite fluorescência após a incidência de um feixe de laser. Os impulsos luminosos são amplificados por um fotomultiplicador, contados e convertidos em concentração de células somáticas 20 no equipamento previamente ajustado com leite contendo CCS previamente estabelecida por método de referência (CECALAIT, 1993). No Brasil, os equipamentos mais utilizados são o SomaScope (Delta Instruments), o Fossomatic (Foss) e o Somacount (Bentley). 3.1.2 Teor de Gordura no leite . A gordura é o principal componente energético do leite, sendo responsável por grande parte das propriedades físicas e qualidades o rganolépticas do leite e seus derivados, sendo predominantemente formada por triglicerídeos (mais do que 95%) em mamíferos. O restante dos lipídeos são formados na fase de emulsão do leite, como o colesterol livre e seus ésteres, além das vitaminas liposso lúveis, como A, D, E e K. (ANNISON et al., 2003) O teor de gordura pode variar amplamente dentro de uma mesma espécie, sendo possível verificar em um mesmo rebanho variações entre 2 e 4%. Esses índices costumam ser superiores às variações encontradas nos outros componentes do leite. Além do teor, a composição da gordura também pode sofrer grandes variações, de acordo com o perfil de ácidos graxos. (BAUMANN e GRIINARI, 2003) Nas espécies com apenas um estômago, como suínos, aves e equinos; o perfil de ácidos graxos encontrados no leite é muito semelhante ao do alimento consumido. Entretanto, nos bovinos, ocorre a biohidrogenação dos ácidos graxos poli - insaturados da dieta pelos microrganismos do rúmen, o que torna os ácidos graxos presentes no leite diferentes dos ingeridos. Como a alimentação dos bovinos pode diferir muito entre propriedades, já foram encontrados mais de 400 tipos de ácidos graxos no leite de bovinos. Entretanto, os ácidos graxos presentes em maior concentração são o ácido oleico (C18:1 cis-9) e o ácido palmítico (C16:0), que somados representam cerca de 50% do total de ácidos graxos no leite bovino. (BAUMANN e GRIINARI, 2003) 21 A alteração dos ácidos graxos do leite decorrente da biohidrogenação tende a tornar a gordura do leite mais saturada além da formação e secreção de ácidos graxos da configuração trans, o que seria benéfico para a saúde dos consumidores. O leite de ruminantes ainda possui níveis mais elevados de ácidos graxos de cadeia curta (4-8C, em especial o butirato C4:0), que são responsáveis por sua fluidez, outra característica desejável aos consumidores. (BAUMANN e GRIINARI, 2003) Há duas origens para os ácidos graxos secretados no leite: a circulação sanguínea ou a síntese de novo nas células do epitélio mamário. Ácidos graxos de cadeia longa (maiores que 18C) são oriundos da circulação, enquanto que ácidos graxos de cadeias curta e média (10 – 16 C) são sintetizados pelas células epiteliaismamárias a partir de produtos da degradação de carboidratos no rúmen, principalmente o acetato. Esse esquema pode ser visto no quadro 2. (ANNISON et al., 2003) Quadro 2. Comparação entre o número de carbonos dos ácidos graxos e sua origem. Ácidos Graxos % AG da Síntese de Novo % AG da circulação C4-C10 100 0 C12 80-90 10-20 C14 30-40 60-70 C16 10-30 70-90 C18 0 100 Fonte: Adaptado de ANNISON et al (2003). De acordo com BELURY (2002) os animais monogástricos realizam a síntese de novo de ácidos graxos a partir da glicose, que nos ruminantes é utilizado como substrato na síntese de lactose do leite. Enquanto isso, os ácidos graxos pré - formados utilizados pela glândula mamária na síntese da gordura do leite podem ser originados de ácidos graxos não-esterificados da mobilização de reservas corporais de gordura ou de lipoproteínas circulantes oriundas da absorção de lipídeos da dieta no intestino. Geralmente, a mobilização da gordura corporal contribui com valores menores que 10 % dos ácidos graxos secretados no leite de 22 ruminantes, porém, quando os animais estão em balanço energético negativo este valor aumenta diretamente em proporção à intensidade da deficiênci a energética. Entre os fatores que possuem influência no teor de gordura do leite quando analisado na propriedade, estão: alimentação, genética, raças, manejo e estado sanitário da glândula mamária. Após a coleta, o teor de gordura do leite ainda pode sofrer influência de defeitos como a rancificação e aglutinação das gorduras. (BELURY, 2002) Uma pesquisa realizada por MONARDES et al (1996) em Quebec, Canadá, avaliou 12.480 amostras com datas de coleta diferentes. As amostras que haviam sido coletadas há mais dias apresentaram menores teores de gordura, não havendo diferenças nos níveis de proteína, comparando amostras de 3 a 7 dia s após a coleta. Enquanto isso, MADALENA (1998) encontrou estabilidade nos valores de gordura por até 6,5 dias, com posterior declínio de 0,00147 unidades percentuais por dia adicional. Foram analisadas 13.189 amostras de leite de 465 vacas em 65 fazendas neste estudo. Em contrapartida, LONGO (2016) encontrou diminuição dos teores de gordura após 24 horas de incubação das amostras, em um estudo realizado na Universidade Federal de Minas Gerais. De acordo com a IN 76 (2018) o leite cru refrigerado deve seguir os parâmetros de teor mínimo de gordura de 3g/100g, sendo que os teores de gordura variam geralmente entre 3,5 e 5%. (BRASIL, 2018) Para a determinação da gordura do leite, o método utilizado nos laboratórios de controle de qualidade é a espectroscopia no infravermelho, por ser mais rápido na determinação de resultados, possibilitando a realização de maior número de análises em menor tempo. Nas moléculas de gordura, a absorção da radiação ocorre nos grupos carbonilas (C=0) e nos grupos carbono -hidrogênio (C-H), nos comprimentos de onda 5,7 μm e 3,5 μm, respectivamente. (BABAK e RYSANEK, 1999) em equipamentos de espectroscopia baseado em filtro. 3.1.3 Teor de Proteína no leite 23 Didaticamente, separam-se os diferentes compostos nitrogenados do leite em proteínas verdadeiras (caseínas) e proteínas do soro e sanguínea (albumina e globulinas). A caseína é a proteína encontrada em maior quantidade no leite bovino (2 a 3,5%), seguida de lactoalbumina (0,4 a 0,7%) e lactoglobulina (0,2 a 0,3%). Para efeitos produtivos consideram-se os produtos nitrogenados: caseínas, proteínas do soro do leite e nitrogênio não proteico. (BOUDA, 1991) As proteínas verdadeiras são sintetizadas a partir de aminoácidos precursores pela glândula mamária, tendo a secreção regulada pelas células mamárias, que sintetizam as diferentes proteínas nos ribossomos e retículo endoplasmático rugoso mediante uma codificação genética específica. (ENJALBERT, 1994) Como todo o processo depende desta configuração genética, ocorrem vari antes de algumas proteínas, a exemplo dos alelos A e B das caseínas beta ou da lactalbumina, que são de interesse industrial pelas características físicas e de rendimento que apresentam seus subprodutos. Ademais, a indústria monitora essas variantes das proteínas também para evitar ter de pagar como proteína as substâncias não proteicas, além da detecção de possíveis adulterações e fraudes. Essas análises podem ser realizadas por meio da eletroforese em gel de poliacrimilamida (PAGE). (BARROS et al, 1998) Como exemplo dessas variantes, o leite proveniente de vacas de raça Holandesa com alelos B da CN-S1, da CN- , da CN- e da -lactoglobulina, produzem 9% a mais de matéria seca de queijo do que vacas com a variante A. Por outro lado, a raça Jersey tem uma maior frequência da variante B da CN- que a raça Holandesa. (DePeters, 1992). Diversos fatores ambientais podem exercer influência sobre a composição proteica do leite, entre eles a raça do animal, manejo, sanidade e a alimentação. O aumento da proteína do leite decorrente de suplementações na dieta acontece fundamentalmente através do aumento do nitrogênio não proteico (NNP). Porém, a suplementação também pode ser responsável pelo aumento da produção total de leite. (DAVIES, 1998) 24 Segundo BLOCK (2000), a porcentagem de proteína verdadeira no leite de bovinos equivale a 95,1% do nitrogênio total, sendo que a maior parte do NNP é ureia. Enquanto isso, a caseína constitui 77% do nitrogênio total ou cerca de 80% da proteína verdadeira. De acordo com a IN 76 (2018), o valor mínimo de proteína do leite cru refrigerado deve ser de 2,9g/100g de leite. Outro fator que pode influenciar esse resultado são problemas decorrentes da refrigeração e armazenamento do leite. Em casos de armazenamento eficiente, como relatado no estudo realizado por MADALENA (1998) em um trabalho realizado com 10.893 amostras de leite, o s teores de proteína mantiveram-se constantes durante 11,2 dias, declinando posteriormente a uma taxa de 0,0062 unidades percentuais/dia. Após esse período, o leite das amostras teve quedas na estabilidade. A estrutura das micelas de caseína pode ser vista na Figura 2. As micelas de caseína possuem duas regiões distintas, a região hidrofóbica e a região hidrofílica, que são compostas respectivamente por beta e alfa -caseína e kappa-caseína. Os principais fatores que afetam a estabilidade dessas micelas são a hidrólise enzimática da kappa-caseína, a temperatura, o pH, o excesso de CA 2+ e a adição de etanol. 25 Figura 2. Modelo da micela de Caseína. (A:submicela, B:cadeias protéicas de K-caseína (+ ácido siálico), C:fosfado de cálcio,D:kappa casein, E: grupos fosfato). Fonte: www.food-info.net/images/caseinmicelle.jpg O fator temperatura possui grande influência na estabilidade do leite. Falhas n a refrigeração que levam ao aumento da temperatura irão gerar instabilidade do leite, principalmente pela acidificação, assim como a refrigeração por longos períodos também pode gerar instabilidade. Neste último caso, as responsáveis são as bactérias psicrotróficas, que se multiplicam no leite refrigerado depois de certos períodos e atuam sobre a kappa-caseína por meio de proteases, que são termoestáveis. (BARROS, 1998) Outro fator importante é o equilíbrio salino, determinado pelas concentrações de cálcio, fósforo e citrato presentes no leite. O que determina a união das micelas de caseína é o fosfato de cálcio, sendo a força desta união um fator determinante para a estabilidade do leite. Alterações no equilíbrio entre o cálcio solúvel e o coloidal afetarão diretamente os resultados da prova do álcool e, consequentemente, a estabilidade térmica do leite. Um dos fatores que pode alterar o equilíbrio salino do leite é a ocorrência de mastite, que altera a permeabilidade vascular das células secretoras de leite, aumentando o influxode Sódio (Na+) e Cloreto (Cl -) e saída https://www.milkpoint.com.br/colunas/marco-veiga-dos-santos/www.food-info.net/images/caseinmicelle.jpg#_blank 26 de K+. Ademais, o leite com elevada contagem de células somáticas (CCS) apresenta enzimas proteolíticas que podem causar a desestabilização das micelas. 3.1.4 Teor de Lactose no leite A lactose, principal glicídeo do leite, é um dissacarídeo composto pelos monossacarídeos D-glicose e D-galactose, ligados por ponte glicosídica ß -1,4. O nome químico da lactose é 4-0-ß-D-galactopiranosil-D-glucopiranose. Sua síntese é realizada pelas glândulas mamárias dos animais em lactação, é pouco solúvel e tem como função auxiliar na absorção do cálcio. É o carboidrato mais presente no leite bovino, seguido de glicose e galactose. A lactose é o principal açúcar do leite, mas é considerado o menos doce de todos os açúcares, tendo apenas 1/6 da doçura da sacarose. (FONSECA, 1995) Figura 3. Esquema da molécula da lactose. Fonte: https://mundoeducacao.bol.uol.com.br/quimica/lactose.htm Os valores de lactose são os que sofrem menores variações na composição do leite bovino, variando geralmente entre 4,6 e 5,2% e com teor mínimo de 4,3g de acordo com a IN76 (2018). (BRASIL, 2018) Essa baixa variação está ligada à estreita relação entre a síntese de lactose e a quantidade de água drenada para o leite. Além disso, a lactose compreende aproximadamente 52% dos sólidos totais do leite desnatado, 70% dos sólidos encontrados no soro do leite e 30% das calorias fornecidas pelo leite. (SCHIMDT, 1974) Nos ruminantes, há baixa absorção de glicose pelo intestino, portanto 45 a 60% da glicose sanguínea são provenientes da síntese de ácidos graxos voláteis (AGV) formados através da fermentação dos carboidratos da dieta. A síntese dos AGV https://mundoeducacao.bol.uol.com.br/quimica/lactose.htm 27 ocorre pelo processo de gliconeogênese. Os mais importantes para a formação da glicose são propionato e aminoácidos glicogênicos (alanina, aspartato, asparagina, cisteína, fenilalanina, glicina, isoleucina , metionina, serina, tirosina, treonina e valina). (SCHIMDT, 1974) Segundo BARRY (1964) o principal precursor da lactose é a glicose sanguínea, visto que 60 a 70% dela são destinados à síntese de lactose nas células epiteliais que envolvem os alvéolos na glândula mamária. As maioria das reações ocorre no citosol, porém, a reação final (catalisada pela lactose -sintetase) ocorre nas vesículas do Complexo de Golgi através do mecanismo de pinocitose reversa. A lactose possui efeito osmótico no leite, sendo responsável por 50% da pressão osmótica. Esse efeito ocorre devido à constância na secreção da lactose, potássio e sódio. Portanto, quando a lactose é sintetizada, a água se difunde para manter o citoplasma da célula isotônico. Para manter o equilíbrio o smótico, as concentrações de lactose são inversamente relacionas às concentrações de sódio e potássio. Pode-se concluir então que a lactose exerce um mecanismo de controle sobre o volume do leite produzido. (SCHIMDT, 1974) Apesar da constância na secreção de lactose, alguns fatores podem levar a pequenas alterações no teor de lactose do leite. Entre eles está o estágio de lactação, visto que apesar da lactose ser a principal fonte de energia para o recém - nascido, sua secreção será ligeiramente menor no co lostro, pois a secreção de proteína estará elevada e é preciso manter o equilíbrio osmótico do leite. Outro fator que pode alterar o teor de lactose é a sanidade da glândula mamária, pois a ocorrência de mastite pode levar a uma redução de até 10% na la ctose do leite. Ademais, os mecanismos de defesa contra a infecção buscam também reestabelecer o equilíbrio osmótico, que sofreu influência pela queda da lactose. Ocorre então uma maior passagem de íons sódio, que será determinante para o aumento da condutividade elétrica do leite e ainda contribui um sabor salgado ao leite. (FONSECA e SANTOS, 2000) 28 Os métodos eletrônicos de determinação por espectrofotometria na região do infravermelho, já citados neste trabalho são mais utilizados na rotina dos laboratórios atualmente, visando maior agilidade na obtenção de resultados. A necessidade determinação do teor de lactose pode ser associada a sua grande importância para o processamento industrial . A lactose é o principal componente dos processos de acidificação do leite (fermentação e maturação, princípios básicos para a produção de iogurtes e produtos fermentados), está relacionada ao valor nutritivo, textura e solubilidade, desempenhando também um fator preponderante na cor e sabor do produto final. (OLIVEIRA e CARUSO, 1996) 3.2 Análise de Componentes principais A Análise de Componentes Principais (Principal Component Analysis, PCA) é uma técnica de pré-processamento que reduz os dados, gerando um conjunto menor de variáveis que visam capturar a maioria das informações nas variáveis originais. Esta técnica é denominada redução de dados, e com sua aplicação, poucas variáveis podem ser usadas para oferecer uma representação razoável ao conjunto de dados original. O PCA converte um conjunto de variáveis correlacionadas em um conjunto de valores linearmente não correlacionados denominados componentes principais (Principal Components, PC). (KUHN e JOHNSON, 2013) A transformação é realizada de forma que a primeir a componente principal tenha a maior variância possível, isto é, uma componente que seja responsável pela maior variabilidade nos dados. Outras componentes principais são calculadas de forma que a maior variabilidade restante seja capturada. (KUHN e JOHNSO N, 2013) O PCA pode ser entendido também como uma ferramenta para identificar a relação entre características extraídas de dados e possui grande utilidade quando os vetores das características têm muitas dimensões (KUHN e JOHNSON, 2013). 29 . O PCA foi utilizado no presente trabalho por se tratar de uma ferramenta de análise exploratória dos dados, sendo sua operação entendida como a de revelar a estrutura interna dos dados de forma que melhor explique a variância dos mesmos. No PCA podemos encontrar, entre outros, os gráficos de cargas fatoriais, como os gráficos de pesos e os gráficos de escores. Para traçar esses gráficos, é necessário promover uma transformação linear nos dados de modo que os dados resultantes desta transformação tenham suas componentes mais relevantes nas primeiras dimensões, em eixos denominados principais. (VASCONCELOS, 2010) Partindo deste princípio, nos Gráficos de Pesos, são traçadas linhas que representam cada variável e quanto mais próximo a linha está dos valores de -1 e 1, mais forte é a influência desta variável no objeto de estudo. Em contrapartida, quanto mais próximo a linha da variável estiver do valor zero no gráfico, mais fraca é a influência dessa variável sobre o objeto de estudo. Já no gráfico de escores, os eixos são os componentes principais nos quais os dados são projetados, em forma de pontos. Quanto maior agrupamento desses pontos, maior relação entre os fatores estudados. (VASCONCELOS, 2010) 3.3 Idade dos animais A idade ao primeiro parto é utilizada como índice zootécnico importante na avaliação da produção de leite, visto que marca o início da vida produtiva da fêmea, podendo demonstrar rebanhos precoces sexualmente, momento ideal para o início da vida reprodutiva e análise de índices produtivos. Em um trabalho com vacas holandesas no estado do Paraná, BARBOSA et al (2007) avaliaram a contagem de células somáticas e escore de células somáticas durante a primeira lactação no dia de controle mensal e observaram que a CCS aumentou nos rebanhos estudados de acordo com o avanço da lactação do meio para o fim. 30 DIAS et al (2017), em estudo realizadoem Goiás com 110 vacas holandesas mantidas em free-stall não encontraram diferenças nos valores de CCS, gordura e proteína do leite dos animais nas diferentes ordens de parto, quando avaliados na segunda fase da lactação. No terço final da lactação, houve aumento dos valores de CCS e diminuição de gordura e proteína de forma mais acentuada nos animais acima de 2 ordens de parto. Uma das hipóteses para o aumento da CCS nos animais à medida que a idade avança é que vacas de ordens de lactação superiores estariam expostas a contato com agentes infecciosos causadores da mastite . Em contrapartida, vacas com menor número de lactações estão em contato com esses agentes por menor período de tempo, além de terem sido submetidas a menor número de ordenhas durante a vida produtiva, diminuindo a chance de ocorrência de lesões nos tetos devido a falhas na rotina de ordenha ou equipamentos de ordenha desregulados, que podem dificultar a ação de proteção natural contra agentes infecciosos, como o fechamento correto do esfíncter do teto. (SANTOS, FONSECA, 2 3.4 Raças Segundo SANTOS e FONSECA (2006), aproximadamente 55% do total de variabilidade de composição do leite é decorrente da genética, sendo o restante decorrente de fatores ambientais. Entre as raças com seleção genética voltada à produção leiteira, a Holandesa apresenta as menores concentrações de proteína no leite, enquanto a raça Jersey se destaca com maiores percentuais de sólidos. De uma forma geral, SANTOS e FONSECA (2006) não encontraram variações na proporção caseína-proteína do leite entre as raças leite iras. Estudos realizados no Brasil por TEIXEIRA et al (2003) e RIBAS (1998) já indicavam que a quantidade total de proteína produzida por uma vaca Holandesa com lactação média de 6000 Kg é de 188 Kg, o que equivale à mesma quantidade de proteína produzida por uma vaca Jersey com lactação de 5108 Kg. Desse modo, SANTOS e FONSECA (2006) supõem que o cruzamento entre essas duas raças seria uma forma rápida de elevar o teor de sólidos em uma propriedade. 31 Sabendo dessas variações, o presente trabalho visa a análise da influência na composição do leite de uma maior quantidade de raças e cruzamentos entre elas, objetivando assim a produção de um estudo mais completo sobre a influência da genética na composição do leite nos rebanhos de Minas Gerais. As raças presentes neste estudo são: - GIR: Raça de origem indiana, comumente associada à dupla aptidão. Segundo a Associação de Criadores da Raça Gir Leiteiro (ABCGil), o rebanho brasileiro em 2018 era de aproximadamente 300 mil animais no país, sendo o maior número de criadores situados em Minas Gerais e Goiás. Tem alta longevidade, boa habilidade materna e grande resistência à ecto e endoparasitas. Porém, possui menor produção de leite que as raças mais especializadas, por isso é muito utilizada nos cruzamentos. (ZOCCAL, 2018) - GIROLANDO: Cruzamento entre as raças Holandês e Gir, sendo os graus de sangue 5/8 e 3/8, respectivamente. Porém, outros níveis de cruzamento podem ser utilizados de acordo com as necessidades do produtor. A Associação Brasileira de Criadores da Raça Girolando (ABCRG) estima que 50% do rebanho brasileiro sejam compostos por animais provenientes do cruzamento entre Gir e Holandês em seus diversos graus de sangue. Apresenta características fisiológicas e morfológicas ideais para a produção de leite, como capacidade de úbere, suporte de tetas, capacidade termorreguladora, fatores intrínsecos à lactação, conversão alimentar e eficiência reprodutiva. Minas Gerais é o estado com maior quantidades de produção da raça, seguido de outros estados da região Sudeste e dos estados do Centro-Oeste, onde a criação da raça tem aumentado. (ZOCCAL, 2018) - HOLANDESA: Originária das províncias holandesas do Norte e Friesland, e Schleswig-Holstein no Norte da Alemanha e Jutland. Segundo a Associação Brasileira de Criadores da Raça Holandesa (ABCRH) a raça 100% pura representa cerca de 10% do total do plantel brasileiro, porém, é muito utilizada como base genética para cruzamentos no país inteiro, o que leva a grande dispersão genética da raça. As características principais da raça são a alta produção de leite com boa 32 concentração de sólidos, sendo os pontos negativos a alta sensibilidade a ambientes extremos. Pelas diferenças de temperaturas anuais e sazonalidade na produção de pastagens, o gado holandês puro é criado no Brasil principalmente nos sistemas intensivos. Os principais criadores da raça estão no Paraná, Seguidos do Rio Grande do Sul e Minas Gerais. (ZOCCAL, 2018) - JERSEY: Muito utilizada no Brasil tanto pura quanto em cruzamentos. Segundo a Associação Brasileira de Criadores da Raça Jérsey (ABCRJ) existem 2000 criadores associados e cerca de 750 mil animais no país. O maior número de criadores da raça pura está em Santa Catarina, seguido de Paraná, Minas Gerais e Rio Grande do Sul. Possui elevada quantidade de sólidos no leite, em especial gordura e proteína e cálcio. Estima-se que o valor desses componentes pode ser até 30% superior quando comparado a outras raças. Mesmo sendo originária da Inglaterra, possui certa rusticidade, porém, alcança maio res produções em sistemas de criação intensivos. Uma desvantagem da raça é o alto custo das novilhas, tornando necessário alto investimento para a formaç ão de um plantel. (ZOCCAL, 2018) - SRD: Sem Raça Definida. Animal resultante de cruzamento de diferente s raças, sendo difícil a identificação de características específicas de cada raça. 4 MATERIAL E MÉTODOS 4.1 Amostragem Amostras individuais de leite cru (n=38.374) foram colhidas pelos próprios interessados ao término da ordenha de cada animal. A coleta foi realizada seguindo os protocolos padronizados, como: ordenha completa do animal, homogeneização do leite por 30 segundos no copo coletor ou em um balde de material que permite sanitização, contendo o leite apenas de um animal, com movimentos vigorosos, porém com cuidado para não ocasionar danos na estrutura do leite, em especial a fase lipídica. Após período de homogeneização, o leite foi 33 adicionado em um frasco específico para coleta, contendo o conservante Bronopol® (2-bromo-2-nitropropano-1,3diol). O leite coletado foi enviado à temperatura ambiente com o tempo máximo para recebimento dessas amostras no Laboratório de Análise da Qualidade do Leite da Escola de Veterinária da UFMG (LabUFMG) de 5 dias após a ordenha. As amostras foram analisadas no Laboratório de Análise da Qualidade do Leite da Escola de Veterinária da UFMG (LabUFMG), integrante da Rede Brasileira de Laboratórios de Controle da Qualidade do Leite (RBQL). Os resultados foram compilados e processados pelo software de controle da Associação Paranaense de Criadores de Bovinos da Raça Holandesa (APCBRH). 4.2 Análises laboratoriais O método utilizado para análise das amostras de leite foi o método de espectroscopia FTIR (Fourier Transform Infrared) . As amostras foram mantidas refrigeradas a até 7ºC, sem congelamento, ao chegar ao laboratório, porém, logo antes da análise foram pré-aquecidas em banho maria a 40ºC por 15 minutos, de acordo com a especificação do equipamento. Os equipamentos utilizados para análise do leite possuem uma fonte de radiação infravermelha que emite um feixe de luz policromático. No equipamento ocorre a transformação do feixe de luz policromático em feixes monocromáticos. Na configuração há uma cubeta, local onde a amostra é irradiada e um detector. Existem três tipos de espectrofotômetros: os instrumentos dispersivos, os baseados em filtros e os baseados na Transformada de Fourier (FTIR). No LabUFMG são utilizados os espectrômetros baseados em FT IR. No equipamento baseado em filtros, os comprimentos de onda são 5,7 µm e 3,5µm para a gordura, 6,5µmpara proteína e 9,6 µm para lactose (PINTO, 2010). Já no FTIR a amostra é exposta a um único pulso de radiação e de medidas de resposta. O sinal resultante (indução bifásica) não pode ser interpretado antes da utilização da técnica matemática conhecida como Transformação de Fourier, realizada por 34 algoritmos de software e que apresenta ao usuário as informações desejadas para a análise espectral (MORGANO et al, 2005). Os componentes analisados por FTIR (Lactoscope, Delta Instruments) foram gordura, proteína e lactose, enquanto a Contagem de Células Somáticas foi analisada por citometria de fluxo (Somascope, Delta Instruments) 4.3 Análise Estatística Foi realizada uma análise descritiva com transformação logarítmica dos dados de Contagem de Células Somáticas. Para a análise dos dados, os resultados foram divididos em seis faixas etárias: 20 a 36 meses, 37 a 48 meses, 49 a 60 meses, 61 a 96 meses e acima de 96 meses. Dentro dessas divisões foram analisados os teores de gordura, proteína, lactose e CCS das 5 raças e cruzamentos (Holandês, Gir, Jersey, Girolando, e SRD-mestiça). Os dados abaixo de 0,5g/100g e acima de 6,0g/100g de gordura foram desconsiderados por serem valores extremos, provavelmente decorrentes de coleta inadequada do leite. Para análise dos dados, foi utilizada estatística multivariada, e a diferença entre tratamentos por meio do teste Fisher e Duncan, levando -se em consideração o fator de significância p de 0,05. (SAMPAIO, 2016). Foram utilizados os softwares Minitab 16 (Minitab, 2014) e JMP 14 (SAS Institute, 2018). 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO 5.1 Contagem de Células Somáticas (log10* 1000/mL) nas diferentes faixas etárias nas raças Gir, Girolando, Holandesa, Jérsey e Mestiça-SRD. No gráfico 1 vemos a variação entre os valores de Contagem de Células Somáticas em logaritmo na base 10 e Lactose (g/100g) em cada faixa etária nas raças Gir, Girolando, Holandesa, Jérsey e Mestiça -SRD. 35 36 Gráfico 1. Distribuição dos valores de CCS e Lactose (g/100g) nas 5 faixas etárias das raças Gir, Girolando, Holandês, Jérsey e Mestiça-SRD. Faixas etárias: 1 (20-36 meses), 2 (37-48 meses), 3 (49 a 60 meses), 4 (61 a 96 meses) e 5 (>96meses). Os valores de Contagem de Células Somáticas podem ser transformados em ECS (escore de células somáticas) que consiste na transformação logarítmica dos dados (CCS), através da fórmula: ECS = log2 (CCS 100) + 3 a fim de aproximá -los de uma distribuição normal, com homogeneidade de variâncias. (ALI e SHOK, 1980). Na tabela 1 vemos a correlação entre os valores de Contagem de Células Somáticas em (log10/mL) em cada faixa etária nas raças Gir, Girolando, Holandesa, Jérsey e Mestiça-SRD. Onde as letras iguais representam correlação entre os fatores e significância estatística (p>0,05) . Tabela 1. Correlação entre os valores de CCS nas 5 faixas etárias das raças Gir, Girolando, Holandês, Jérsey e Mestiça-SRD. Faixas etárias: 1 (20-36 meses), 2 (37-48 meses), 3 (49 a 60 meses), 4 (61 a 96 meses) e 5 (>96meses). Faixa Etária 1 2 3 4 5 Total CCS (log/mL) Média Desvio padrão Média Desvio padrão Média Desvio padrão Média Desvio padrão Média Desvio padrão Média Desvio padrão GIR 5,093 0,581 5,268 0,657 5,188 0,624 5,315 0,489 5,498 0,405 5,226B 0,604 GIROLANDA 5,123 0,570 5,212 0,583 5,301 0,595 5,427 0,601 5,478 0,584 5,327ª 0,602 HOLANDESA 5,139 0,580 5,282 0,613 5,338 0,65 5,485 0,632 5,609 0,618 5,344ª 0,636 JÉRSEY 5,133 0,518 5,14 0,605 5,271 0,562 5,228 0,578 5,449 0,586 5,188B 0,569 MESTIÇA – SRD 5,213 0,557 5,206 0,559 5,211 0,577 5,458 0,558 5,65 0,561 5,376ª 0,586 Analisando os dados percebe-se uma tendência em todas as raças para o aumento dos valores de CCS à medida que aumenta a idade dos animais. VOLTO LINI et al (2001) não encontraram variações significativas e padronizadas de CCS nos diferentes estádios de lactação e número de lactações em animais livres de infecções intramamárias. Entretanto, MAGALHÃES et al (2006) de forma semelhante ao presente estudo, encontraram aumento dos valores de CCS com o aumento do número de lactações dos animais. De acordo com COLDEBELLA et al (2004) as vacas multíparas tendem a ter maiores valores de CCS devido a maiores 37 danos à glândula mamária pelo maior número de ordenhas as quais são submetidas, além de maior susceptibilidade a casos de mastite, que tendem a ser infecções mais prolongadas resultando em maior dano tecidual. Foi relatado ainda que os danos tendam a ser agravados à medida que aumentam o número de lactações, assim como visto no presente trabalho. Avaliando as variações dentro de cada raça, a Holandesa aprese ntou maior aumento nos valores de CCS com o avanço das faixas etárias . Esse resultado está em concordância com estudos que relatam que animais com altos valores genéticos para produção de leite tendem a ter maiores valores de CCS, devido a maior susceptibilidade a infecções intramamárias e que esses casos tendem a ser aumentados de acordo com a intensificação de seleção para produção de leite (CARLEN et al, 2004). Sabendo que a raça holandesa tem sido selecionada principalmente para aumento da produção de leite há muitas décadas, é de se esperar então que os valores encontrados de CCS nesta raça sejam mais elevados. Esses dados estão em concordância com a análise dos coeficientes de herdabilidade de ECS (0,08 a 0,17) e para incidência de mastite (0,03) descritos por ODEGARD et al (2004). A raça que manteve o menor aumento dos valores de CCS foi a Girolando, porém sem diferença significativa (p>0,05) quando comparando a Gir ou a raça Jérsey, que possuem a correlação entre os dados totais, como pode ser visto na Figura 5 . Por outro lado, SOUZA et al (2010), em estudo realizado com animais do estado de São Paulo, encontraram maiores valores de CCS na raça Girolando do que na raça Gir, o que pode ser explicado pela maior resistência à mastite na raça Gir, visto que a raça Girolando sofre influência da genética Holandesa para aumento da produção de leite, levando a maiores valores de CCS. Enquanto isso, a raça Jersey de um modo geral, teve valores baixos de CCS nas 5 faixas etárias avaliadas (p96meses). Na tabela 2 vemos os valores de Gordura (G), Proteína (P) e Lactose (L) em cada faixa etária nas raças Gir, Girolando, Holandesa, Jérsey e Mestiça -SRD. Onde as letras iguais representam correlaçãoentre os fatores e significância estatística (p>0,05). Tabela 2. Correlação entre os valores de gordura, proteína e lactose em nas 5 faixas etárias das raças Gir, Girolando, Holandês, Jérsey e Mestiça-SRD. Faixas etárias: 1 (20-36 meses), 2 (37-48 meses), 3 (49 a 60 meses), 4 (61 a 96 meses) e 5 (>96 meses). Faixa Etária 1 2 3 4 5 Total Média Desvio padrão Média Desvio padrão Média Desvio padrão Média Desvio padrão Média Desvio padrão Média Desvio padrão GIR G (g/100g) 4,00 0,88 4,07 0,90 3,99 0,89 3,90 1,48 4,11 0,91 4,01ª 1,00 P (g/100g) 3,43 0,39 3,44 0,31 3,40 0,38 3,29 0,43 3,37 0,33 3,40B 0,37 L (g/100g) 4,66 0,33 4,60 0,34 4,59 0,37 4,61 0,26 4,72 0,19 4,62ª 0,33 GIROLANDA G (g/100g) 3,82 1,18 3,77 1,06 3,72 1,01 3,67 1,10 3,63 1,08 3,71C 1,09 P (g/100g) 3,30 0,42 3,32 0,40 3,32 0,42 3,29 0,41 3,23 0,40 3,29C,D 0,41 L (g/100g) 4,56 0,30 4,50 0,34 4,48 0,36 4,40 0,42 4,34 0,40 4,45BC 0,38 HOLANDESA G (g/100g) 3,70B 1,14 3,78 1,13 3,61 1,21 3,56 1,22 3,61 1,26 3,65C 1,19 P (g/100g) 3,27 0,45 3,29 0,45 3,28 0,48 3,29 0,46 3,29 0,57 3,28D 0,47 L (g/100g) 4,54 0,31 4,46 0,34 4,43 0,39 4,35 0,46 4,28 0,45 4,43C 0,40 JÉRSEY G (g/100g) 4,11 1,15 3,95 1,16 3,74 1,03 3,79 1,06 3,61 0,91 3,93ª 1,12 P (g/100g) 3,48 0,39 3,54 0,43 3,58 0,48 3,68 0,36 3,65 0,28 3,55ª 0,41 L (g/100g) 4,50 0,25 4,46 0,31 4,46 0,33 4,44 0,33 4,39 0,40 4,47`B 0,30 MESTIÇA – SRD G (g/100g) 4,01 1,40 3,94 1,23 3,86 0,91 3,72 1,02 3,82 1,10 3,83B 1,11 P (g/100g) 3,31 0,42 3,30 0,42 3,31 0,42 3,33 0,45 3,35 0,44 3,32C 0,43 L (g/100g) 4,59 0,32 4,45 0,29 4,43 0,28 4,41 0,33 4,34 0,38 4,43C 0,33 41 De maneira geral, os teores de proteína apresentaram menores variações numéricas que os teores de gordura e lactose entre as diferentes faixas etárias e entre as raças, estando os resultados médios em acordo com a IN 76 (2018). Resultados semelhantes aos encontrados por NORO (2004), que relata a gordura como o componente que sofre maior variação, chegando a 2 ou 3 unidades percentuais enquanto RANGER et al (2018) encontraram efeitos significativos da variável ordem de parto/idade do animal nos teores de gordura do leite. Analisando os resultados, pode ser vista uma correlação entre o aumento de CCS e a diminuição da gordura de maneira geral, com exceção da raça Gir, que apresentou um aumento dos teores de Gordura na faixa etária 5, porém sem diferença estatística como podemos ver na tabela 2. Segundo AZZARA e DIMMICK (1985), o aumento da CCS pode provocar uma diminuição da síntese de gordura, principalmente devido aos danos no epitélio secretor e ação li política ou proteolítica de enzimas leucocitárias. Do mesmo modo, GONZÁLEZ (2001) também relatou influência das raças nos teores de gordura e proteína do leite, ressaltando a importância desses componentes no pagamento por qualidade para produtores de diversos países. Os animais da raça Jersey apresentaram teores de proteína levemente acima dos encontrados nas demais raças. LUDOVICO et al (2019) também encontraram maiores valores de proteínas no leite proveniente de vacas Jersey. Assim como no estudo de SANTOS e FONSECA (2006), que encontraram maiores teores de gordura no leite proveniente de vacas Jersey quando comparado ao leite das raças Holandesa e Girolando (p