Biomol Aplicada - resumo P2

Prévia do material em texto

BIOLOGIA MOLECULAR APLICADA – P2
PCR – Reação em Cadeia da Polimerase
Consiste em fazer cópias de DNA in vitro, usando os elementos básicos do processo de replicação natural.
Reação de síntese de regiões específicas de DNA em ciclos repetitivos.
Aplicações:
Obtenção de um grande número de cópias de DNA.
Síntese de regiões específicas.
Amplificação (exponencial) a partir de uma única cópia de DNA molde (no mínimo).
Etapas:
DESNATURAÇÃO: separação da dupla fita de DNA;
T = 95°C (acima disso, quebram-se as ligações fosfodiéster).
ANELAMENTO: pareamento dos primers ao DNA molde;
T = Tm – 5°C (50 a 70°C).
EXTENSÃO: síntese do DNA pela DNA polimerase;
T = 72°C (temperatura ótima para a ação enzimática da Taq polimerase).
* Essas três etapas são repetidas x vezes (x = número de ciclos).
* Taq polimerase: DNA polimerase da bactéria Thermus aquaticus, que resiste a altas temperaturas (vive em fontes termais). Máximo de 95°C.
O tempo de cada etapa e o número de ciclos variam de acordo com a amostra e são flexíveis na determinação do mehor protocolo para cada caso.
A seqüência dos primers determinará a temperatura ótima de anelamento, mas esta temperatura deve estar na faixa entre 50°C e 70°C.
* ↑ 70°C : anelamento inespecífico. ↓ 50°C : não há anelamento.
Os primers podem ser modificados para se adequarem a necessidades da reação, porém a terminação 3’ do primer deve ser 100% homóloga (complementar) à fita molde. Esta é a região mais importante, pois é ali que se inicia a extensão da fita complementar pela polimerase.
AMPLICON: produto de amplificação dupla fita delimitado pelos primers (é a seqüência de interesse bem definida) – Maniatis.
Componentes da PCR:
DNA molde: [DNA molde] ⟹ 1 a 2μg
[DNA molde] > 2μg ⟹ falso anelamento (muita oferta, anelamento inespecífico)
[DNA molde] < 1μg ⟹ ↓ [amplificado]
Taq polimerase:
Adiciona dNTPs na porção 3’-OH do primer
Tolerância T ≤ 95°C
Temperatura ótima: 72°C
Atividade é proporcional a [Mg2+] livre
Não possui atividade de exonuclease no sentido 3’→5’ para realizar a “leitura de revisão” (isso só ocorre in vivo)
Insere um erro a cada 300pb
Íons magnésio:
Cofator enzimático
Forma complexo equimolecular (1:1) com o dNTP (Mg2+ deve ser colocado em excesso)
[Mg2+] = 1,5mM total (0,5 a 5mM)
↓ [Mg2+] ⟹ pouco ou nenhum produto
↑ [Mg2+] ⟹ aumento da taxa de erro (hiperestimulação da enzima)
Desoxirribonucleotídeos trifosfato (dNTPs):
[dATP] = [dTTP] = [dGTP] = [dCTP] = 0,05mM
[dNTP] = 0,05 a 0,2mM
↑ [dNTP] ⟹ ↓ [Mg2+] pouco produto
↓ [dNTP] ⟹ ↑ [Mg2+] aumento da taxa de erro
Primers:
Anelar a uma única seqüência-alvo
Conteúdo G≡C de 35 a 65% (~50%)
↑ [GC] ⟹ ↑ temperatura de anelamento
Primers de 18 a 30mer: fragmentos < 4kb
Primers de 30 a 35mer: fragmentos > 4kb
Não podem ser complementares entre si
Não precisam ser completamente homólogos à molécula-alvo
Terminação 3’ é a mais importante (região reconhecida pela enzima)
Evitar a formação de grampos (hairpins): dobra do primer
Evitar a formação de dímeros de primer
* mer = nucleotídeo.
Temperatura de fusão (temperatura de melting – Tm): temperatura na qual 50% da seqüência do primer encontra-se associada ao DNA molde.
Primers menores que 25mer: Tm = 2(A+T) + 4(G+C)
Tanelamento = Tm – 5°C (50 a 70°C)
As temperaturas de anelamento dos primers não podem divergir de mais que 6°C
Primers de 25 a 100mer:
[Na+] = 0,01 a 1M
Tm = 81,5 + 16,6(log[Na+]) + 0,41(G+C) – 600
Tanelamento = Tm – 5°C (50 a 70°C)
As temperaturas de anelamento dos primers não podem divergir de mais que 6°C
* Quanto maior a concentração de Na+, maior a dificuldade de formação de ligações de hidrogênio (maior a força iônica).
Ciclos térmicos da PCR:
Padrão de 25 a 35 ciclos para Taq polimerase comum.
↑ número de ciclos, ↑ [primers] ⟹ pois eles são consumidos na reação.
O tempo de incubação de cada ciclo depende do termociclador utilizado e da espessura do microtubo.
* Taq polimerase não é totalemente termoestável.
Inibidores da PCR (da enzima):
Grupamento heme, bilirrubina e bile.
Sais provenientes de fluidos biológicos.
Proteinase, SDS, fenol, EDTA, tiocianato de guanidina.
* Como evitar? Dilui-se a amostra!
PCR MULTIPLEX:
Várias regiões do DNA são amplificadas simultaneamente por pares de primers diferentes.
Temperatura de anelamento dos pares de primers deve ser semelhante.
O tamanho dos amplicons devem ser diferentes.
Maior rapidez e economia.
NESTED PCR:
O DNA molde utilizado é o produto proveniente de uma amplificação anterior.
A região de amplificação de um par de primers é interna ao produto do outro.
Amplicon do nested PCR é menor que o da primeira amplificação.
Usado, principalmente, se a seqüência-alvo é pequena, a qual requer primers menores, e quanto menor o primer, menos específico ele é.
Aumento da especificidade e da sensibilidade.
* Nested PCR: 4 primers (2 pares). Semi-nested PCR: 3 primers (1 par + 1 ⟹ este é igual da 1ª etapa).
RT-PCR:
A informação genética a ser amplificada é uma molécula de RNA.
RT = reverse transcription.
RNA →1 cDNA (fita simples) → Amplificação (geração de fita dupla)
1: transcriptase reversa + primer
As etapas de transcrição reversa e amplificação do cDNA ocorrem em separado.
Primer:
Primers aleatórios: mistura de hexâmeros de nucleotídeos (inespecíficos).
Oligo-dT: primer de timina anela com a cauda poli-A de RNAm eucariótico.
Específicos: seqüência complementar ao RNA alvo.
HIBRIDIZAÇÃO
* O certo seria hibridação. Hibridização remete a orbitais moleculares.
“Baseia-se na propriedade intrínseca dos ácidos nucleicos de complementariedade de bases nitrogenadas”.
Faz-se uso desta propriedade para a identificação de uma molécula-alvo.
Exemplos:
Oligonucleotídeo específico, associado a um marcador fluorescente, para diagnosticar se uma amostra de DNA é ou não aquela em questão
Anticorpo, associado a um marcador fluorescente, para identificar uma proteína específica.
Ligante: SONDA.
Molécula-alvo: ANALITO.
A amostra deve estar presa a uma membrana.
Sistema indicador:
Representa o sistema que se ligará à molécula-alvo.
Alta especificidade: ligação covalente; interação de alta afinidade (ligação de H).
Direto ou indireto.
Sistema detector:
Grupamento que será ligado ao sistema indicador para posterior detecção.
Isótopos radioativos (14C, 32P, 35S e 125I) ⟹ “sonda marcada a quente”.
Não-radioativos (fluoresceína, rodamina, biotina, digoxigenina, etc.) ⟹ “sonda marcada a frio”.
Sistema indicador DIRETO:
A sonda contém um grupamento reporter ligado covalentemente.
Vantagens:
Detecção feita em apenas uma etapa.
Sem anticorpo conjugado.
Sem etapas de lavagem (somente a lavagem final).
Desvantagens:
Para cada tipo de molécula-alvo, há a necessidade de um indicador com seu sistema detector específico.
Aplicação: cópia simples da molécula-alvo proveniente de Southern e Northern Blot.
Sistema indicador INDIRETO:
Há uma interação não-covalente entre um grupamento detector e o grupamento modificado ligado à sonda.
Detecção feita em duas etapas.
Vantagens:
Um mesmo sistema de detecção poderá ser utilizado para qualquer tipo de molécula-alvo.
A especificidade do sistema pode ser regulada através da estringência.
Desvantagens:
Requer a interação entre o anticorpo e o grupamento modificado (deve ser específico).
Aplicações:
Utilização direta in situ.
Quantificação de oligonucleotídeos.
Amostras de DNA e RNA provenientes de Southern, Northern e Dot Blot.
O ligante ainda é específico para o analito.
O grupamento modificado estabiliza o ligante, o que permite uma variação na temperatura que favoreça a interação com a amostra, aumento o rendimento do processo.
Método de marcação: introdução do marcador na sonda.
Enzimático (mais utilizado)
Fotoquímico
Químico
Vai depender do grupamento químico, do tamanho da sonda e do método de detecção.
Marcação da sonda:
TERMINAÇÃO 5’ DACADEIA
Isótopo radioativo
Sondas de tamanho reduzido (até 25mer)
TERMINAÇÃO 3’ DA CADEIA
Radioativo ou não
Sondas de tamanho reduzido (até 25mer)
PRIMER RANDÔMICO
Para sondas maiores (acima de 25mer).
Radioativo ou não.
dsDNA ⟹ desnaturação ⟹ ssDNA ⟹ + hexâmeros RAM, dNTPs, dXTP-* (um deles marcado), polimerase (Fragmento de Klenow) ⟹ anelamento/ alongamento da cadeia ⟹ desnaturação ⟹ purificação ⟹ obtenção da sonda.
dXTP = dATP ou dTTP ou dGTP ou dCTP. Haverá marcação toda vez que o dXTP-* escolhido entrar na seqüência.
NICK TRANSLATION
Para sondas maiores (acima de 25mer).
Radioativo ou não.
dsDNA ⟹ tratamento com DNAse (baixa concentração e pouco tempo) ⟹ quebra e retirada de 1 ou poucos nucleotídeos ⟹ DNA polimerase I + dNTPs + dXTP-* ⟹ conserta a quebra, mas também refaz tudo o que estiver na seqüência ⟹ desnaturação ⟹ purificação ⟹ obtenção da sonda.
dXTP = dATP ou dTTP ou dGTP ou dCTP. Haverá marcação toda vez que o dXTP-* escolhido entrar na seqüência.
Método de detecção:
Substrato colorido: ESPECTROFOTOMETRIA.
Luminescência: FILME RADIOGRÁFICO.
Fluorescência: SCANER.
Preparo da membrana:
DNA amplificado → Suporte de hibridização (membrana) → Fixação por luz UV ou forno de aquecimento.
A membrana pode ser de:
Nitrocelulose: baixa resistência; conselhável para fragmentos maiores que 500pb, e fixa DNA por calor ou vácuo.
Nylon: alta resistência; permite reutilização; liga 5 vezes mais DNA e fixa DNA por UV.
ESTRINGÊNCIA = representa o conjunto de condições fisico-químicas que interfere na associação das fitas de ácidos nucleicos.
Teoricamente: ↑ temperatura e ↓ [Na+] ⟹ ↑ estringência.
↑ temperatura: facilita a ligação, mas pode perder especificidade.
IMOBILIZAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS
A sonda não é capaz de atravessar o gel, por isso é feita a transferência das amostras para a membrana.
A imobilização é feita quando há necessidade de caracterizar ácidos nucleicos em uma mistura complexa desses elementos.
Mistura (ex.: amostra clínica) → eletroforese (separação) → transferência para a membrana → hibridização.
Por que fazer a hibridização com a sonda após a eletroforese?
Confirmar presença ou ausência da amostra específica (diagnóstico);
Permite visualizar bandas que não apareceram na eletrofoese.
SOUTHERN BLOT:
Localizar ou identificar fragmentos específicos de DNA.
Hibridização in situ.
Fragmentos provenientes de PCR ou clivagem por enzimas de restrição.
A sonda é um oligonucleotídeo marcado.
Imersão do gel em solução de pH alcalino (desnaturação da dupla fita; facilitará hibridização);
Transferência para a membrana e fixação;
Incubação com a sonda.
* Fixação é feita com UV ou calor.
* DNA “finger print” = impressão digital.
NORTHERN BLOT:
Método utilizado para determinar se um gene é expresso por meio da detecção de RNA.
Hibridização in situ.
RNA proveniente de células ou vírus.
A sonda é um cDNA marcado.
Baixa sensibilidade se o gene transcrito for de baixa concentração. Neste caso, seria melhor utilizar a técnica de Dot Blot.
Imersão do gel em solução de pH alcalino;
Transferência para a membrana e fixação;
Incubação com a sonda.
Hibridização in situ:
Detecção de atividade genômica diretamente em células ou em tecidos fixados.
Sondas de DNA ou cDNA marcados.
Utilizada para detecção de HPV, Epstein-Barr (mononucleose), HBV (vírus da hepatite B) e marcadores tumorais.
WESTERN BLOT:
Utiliza ligação específica de anticorpos a proteínas.
Sistema detector representado por anticorpo secundário com fluoróforo.
Imunocitoquímica é o equivalente no tecido.
DOT BLOT:
Aplicação direta da amostra na membrana (qualquer que seja a natureza da amostra).
Resultado positivo ou negativo frente à sonda específica: não há gradação de intensidade, que seria referente à concentração da amostra.
* As outras técnicas apresentam tal gradação.
Não é possível quantificar.
SONDA DIG: sonda com digoxigenina + anticorpo anti-digoxigenina.
SONDA BIOTINA:
Hibridização:
FASE SÓLIDA: Southern Blot / Northern Blot / Dot Blot.
FASE LÍQUIDA: captura híbrida.
Captura híbrida:
Feita em placa de ELISA (96 poços).
Digestão/ desnaturação;
Hibridização (DNA + sonda);
Captura dos híbridos (com anticorpos aderidos à placa);
Reação com conjugado (anticorpo com enzima se liga à sonda);
Reação com substrato (que gerará cor);
Luminômetro.
DIAGNÓSTICO MOLECULAR
Detecção:
Direta (agente etiológico) ⟹ microscopia, cultura, etc.
Indireta (antígenos e anticorpos) ⟹ sorologia, imunologia, etc.
Detecção DIRETA:
Exame microscópico: visualização direta do agente em espécimes clínicos.
Poderá gerar confusão ou erro diagnóstico como decorrência da morfologia aterada.
Cultivo: identificação por características fisiológicas e bioquímicas.
Organismos de crescimento lento ou ausência de crescimento (não-cultiváveis in vitro) são complicadores nesse tipo de análise.
Detecção INDIRETA:
Sorodiagnóstico:
Detecção de antígenos constituintes do agente etiológico.
Possibilidade de resultado falso-positivo por similaridade antigênica (reação cruzada).
Detecção de anticorpos específicos para o agente etiológico.
Possibilidade de resultado falso-negativo por baixa concentração de anticorpos (janela imunológica).
Se, pelos métodos clássicos, os resultados derem negativos ou inconclusivos, pode-se utilizar um marcador molecular para uma melhor avaliação da amostra.
DIAGNÓSTICO MOLECULAR:
Maior sensibilidade (capacidade de identificar o DNA genômico).
Mair especificidade (utilização de um marcador molecular).
Maior rapidez (possibilidade de um diagnóstico precoce).
Falso-positivo: contaminação por amplicons de outro paciente.
Falso-negativo: presença de inibidores (Hb e heparina).
Fatores a serem considerados:
Primers para uma região conservada (sem polimorfismos).
Alvo gênico multicópia (trechos que se repetem no genoma ⟹ facilita a detecção, aumenta a sensibilidade).
Identificação a nível de espécie (permite direcionar para um tratamento mais adequado).
Protocolo de diagnóstico molecular:
Preparo da amostra: extração de ácidos nucleicos.
Metodologia molecular: amplificação e/ou hibridização.
Análise molecular: eletroforese e/ou hibridização.
DNA ou RNA → diagnóstico → esquema terapêutico → monitoramento.
Validação do método:
Padronizados: FDA ou OMS (acurácia, precisão, sensibilidade e especificidade).
“in house”: no laboratório.
BIOLOGIA MOLECULAR APLICADA À MICROBIOLOGIA
Tuberculose:
Sonda molecular para DNAr (ribossomal) de Mycobacterium tuberculosis e micobactérias atípicas.
* Baixa sensibilidade quando há ↓ [DNA].
Amplificação de DNA ⟹ teste Amplicor (Roche).
Amplificação de RNA ⟹ teste EMTD (Gen-Probe).
* Paciente com suspeita de tuberculose pulmonar não-infectado pelo HIV.
* Aqueles infectados pelo HIV desenvolvem a doença com pouca quantidade do vírus:↓[DNA].
TESTE AMPLICOR ou AMTD:
Como um PCR; uma fita gera duas*.
Utiliza termociclador.
DNA
Nucleotídeos
Mg2+
Taq polimerase
Primers biotinelados ⟹ já funcionam como uma sonda
* Análise de BAAR (+).
TESTE EMTD ou GEN-PROBE:
Avalia o RNA transcrito.
Utiliza uma placa de aquecimento.
Mais rápido, mais barato e mais sensível.
Primer para RNA;
Transcriptase reversa (TR);
Formação do híbrido RNA/DNA;
TR possui função RNAse ⟹ deixa ssDNA;
Outro primer pareia com o ssDNA;
TR promove a síntese;
RNA polimerase gera 100-1000 cópias de RNA* a partir deste dsDNA;
O processo, então, se repete.
* Análise de BAAR (+) e (-).
Chlamydia trachomatis:
Agente etiológico do tracoma (conjutivite granulomatosa) e da clamidíase (DST).
Amplificação de DNA ⟹ teste Amplicor.
Amplificação de RNA ⟹ teste EMTD.
Amplificação por PCR para linhagem específica.
* Sensibilidade e especificidade da PCR varia de acordo coma população analisada.
Meningites bacterianas:
PCR multiplex seguido de Dot Blot com sonda específica.
Amplificação de DNAr.
* Ainda não aprovado pelo FDA.
Helicobacter pylori:
Bactéria que causa úlcera.
Única conhecida que sobrevive no pH estomacal.
RT-PCR ⟹ avaliação da expressão gênica.
PCR para o gene decodificador da urease (protege a colônia do baixo pH).
* PCR: especificidade 100% / sensibilidade 96%
BIOLOGIA MOLECULAR APLICADA À PARASITOLOGIA
Toxoplasmose:
Causada pelo protozoário Toxoplasma gondii.
PCR e hibridização por Dot Blot ⟹ quando a pesquisa de anticorpos dá resultado falso-positivo.
Amostra não-refrigerada ⟹ protozoários se auto-destroem.
Gene B1, P30 e DNAr.
* Genes B1 e P30: região conservada multicópia.
* DNAr: alta sensibilidade e especificidade de diagnóstico.
Real time PCR = PCR quantitativo em tempo real.
REAL TIME PCR:
Sistema baseado na detecção e quantificação de um sinal fluorescente.
Observação do produto amplificado a cada ciclo; deve ser analisado comparativamente a um padrão.
Termociclador
Sistema óptico ⟹ laser incidido sobre moléculas sinalizadoras
Hardware
Software
Compostos fluorescentes:
SYBR GREEN: só emite fluorescência ligado ao DNA.
Vantagem: baixo custo; facilidade de uso; sensibilidade.
Desvantagem: inespecífico (se liga a qualquer dsDNA).
TAQ MAN: seqüência de oligonucleotídeos (não é o primer). Sonda marcada contendo fluoróforo-5’ (grupamento repórter) e quencher-3’.
Vantagem: sensibilidade e especificidade; podem ser usadas várias sondas ao mesmo tempo com fluoróforos diferentes.
* O quencher absorve fluorescência do fluoróforo (sonda é pequena). A polimerase da reação liberará o grupamento repórter para o meio reacional, emitindo a fluorescência.
MOLECULAR BEACONS: sonda marcada contendo fluoróforo-5’, quencher-3’ e “haste-loop” (região de pareamento com o DNA).
Vantagem: sensibilidade e maior especificidade; podem ser usadas várias ao mesmo tempo com fluoróforos diferentes.
* Fluorescência é emitida quando ocorre o pareamento e a haste se abre. Polimerase ainda liberará o grupamento.
BIOLOGIA MOLECULAR APLICADA À VIROLOGIA
Hepatite B:
Vírus de DNA.
95% se curam.
PCR para os genes S e C.
Monitoramento do tratamento (se o paciente está respondendo ou não).
Quantificação da viremia em pacientes crônicos (“carga viral”) ⟹ Amplicor e captura híbrida.
* Detecção de DNA: replicação viral (infectividade).
Hepatite C:
Vírus de RNA.
95% cronificam.
HCV em recém-natos.
Diferenciação entre infecção ativa e resolvida (se a pessoa já teve).
Monitoramento do tratamento.
Resultados imunológicos indeterminados.
Pacientes com deficiência imunológica ⟹ ↓ [Ig]
* Detecção de RNA “padrão ouro” (RT-PCR, Amplicor e real time PCR).
HIV:
Infecta linfócito T CD4 helper.
RNA – HIV: marcador da replicação viral.
Seqüênciamento do gene da polimerase do HIV (mutações de resistência).
* Detecção de RNA – HIV viral (Amplicor e NASBA).
NASBA:
Possui o esqueleto reacional do Gen-Probe:
“
Primer para RNA;
Transcriptase reversa (TR);
Formação do híbrido RNA/DNA;
TR possui função RNAse ⟹ deixa ssDNA;
Outro primer pareia com o ssDNA;
TR promove a síntese;
RNA polimerase gera 100-1000 cópias de RNA* a partir deste dsDNA;
O processo, então, se repete.
“
Amplificação baseada na seqüência de ácido nucleico.
Amplificação isotérmica a 41°C do RNA viral por reações sucessivas.
O resultado é expresso em nº de cópias / ml.