MEC 2016

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14/3/2016
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Métodos de Estudo da Célula
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
DEPARTAMENTO DE HISTOLOGIA E EMBRIOLOGIA
CITOLOGIA
Profa. Rosa Amorim
(rosavaleria@ufpe.br)
MICROSCÓPIO
Produção de imagens aumentadas de 
objetos não visualizados à olho nú
 Principal instrumento da Biologia Celular e Histologia
1) De luz (ML) / Óptico comum 
Modificado (variações) com propósitos especiais
 Contraste de fase  Invertido
 Polarização  Fluorescência
2) Eletrônico (ME) - imagens mais aumentadas / feixe de elétrons
Microscópio Eletrônico de Transmissão (MET)
Microscópio Eletrônico de Varredura (MEV)
Quatro tipos de Microscopia óptica - Imagem de uma célula cultivada de fibroblasto. A)
Microscopia de campo-claro. B) Microscopia de contraste de fase; c) Microscopia de contraste
de Interferência diferencial; d) Microscopia de campo escuro.
Microscopia Óptico
TIPOS DE MICROSCOPIA
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TIPOS DE MICROSCOPIA
Microscopia Eletrônica 
Microscopia Eletrônica de 
Transmissão (MET)
Microscopia Eletrônica de 
Varredura (MEV)
As unidades de medida atualmente usadas em 
biologia celular e em histologia são as seguintes: 
Unidade de 
medida Símbolo Valor
Micrômetro m 0,001 mm (milésima parte do 
milímetro)
Nanômetro nm 0,001mm (milésima parte do 
micrômetro)
 Preparados Temporários (Estudos de Células 
Vivas)
Corantes supravitais;
Ex. Cultura de células e de tecidos (in vitro); Cultivo de 
protozoários; Células vegetais; Células em atividade e/ou 
em circulação (pequenos animais).
 Preparados Permanentes (Células Mortas)
Fixação e Coloração;
Preparados permanentes... Vantagem! 
Células preservadas melhor demonstração 
(fixadas e coradas) de seus componentes. 
Como as Células podem ser Estudadas?
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Técnicas de Coleta
Existem métodos específicos para coleta de 
material distintos.
Esfregaço: Células livres presentes nos fluidos 
corpóreos (sangue, linfa, sêmem, líquor, hemolinfa); 
 Espalhamento: Consiste em promover uma raspagem 
das camadas superficiais das mucosas Ex.: mucosas 
vaginais ou bucais;
 Montagem total (à fresco ou não): Ex.: Órgão inteiro 
de insetos, folha de uma planta;
 Corte histológico: cortes extremamente finos 
(micrômetros) ;
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Preparação de Lâminas Permanentes para a 
observação em Microscopia de Luz
Etapa do Processamento Microscopia de Luz
Fixação Em uma etapa (formalina ou 
outro agente fixador)
Desidratação Álcool etílico
Clarificação Xilol
Inclusão Parafina
Corte Micrótomo
Coleta do corte Lâmina de vidro
Coloração Corantes (Ácidos ou Básicos)
Processamento de Material Biológico
Fixação do material
“A fixação imobiliza os componentes químicos 
celulares”
· Proteínas;
· Ácidos Nucléicos;
· Polissacarídeos;
· Lipídeos.
Finalidades:
1. Evitar autólise;
2. Impedir a atividade e proliferação de bactérias;
3. Preparar células para etapas seguintes das técnicas
histológicas;
4. Aumentar a afinidade das estruturas celulares pelos 
corantes usados na microscopia óptica
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“Existe pouco conteúdo dentro das
células que impedem a passagem da
luz, assim células fixadas e
seccionadas vistas ao Microscópio
Óptico são transparentes, com exceção:
células vegetais – cloroplastos
Célula animal – hemácias”
Uma maneira de tornar as células
visíveis é a utilização de corantes!!!
“Diferentes componentes celulares podem 
ser seletivamente corados” 
“A coloração acentua a absorção de luz pelo material”
Corantes - moléculas orgânicas que apresentam em sua estrutura
duplas ou triplas ligações, as quais interagem com a luz dotando
os corpos de capacidades absortivas: Grupo Cromofórico.
 Corantes Ácidos = aniônicos (Eosina, 
Orange G, Fucsina):
– Grupo iônico carregado 
negativamente;
– Liga-se a moléculas básicas (+);
 Ex: Proteínas ricas em aa básicos (NH2)
Eosina
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 Corantes Básicos = catiônicos (Azul de toluidina, 
Azul de metileno, Hematoxilina):
– Grupo iônico carregado positivamente;
– Liga-se a moléculas ácidas
 Ex: radicais fosfato -H2PO4 (DNA e RNA), 
carboxilas -COOH, Hidroxila –OH, sulfatos –HSO4
Azul de metileno
Reações de Acidofilia e Basofilia
 Afinidade por corantes ácidos (proteínas básicas 
citoplasmáticas)  ACIDÓFILAS
 Afinidade por corantes básicos (DNA, RNA, 
glicoproteínas ácidas, Pectatos e polissacarídeos 
ácidos)  BASÓFILAS
Células de Allium cepa coradas com Azul 
de Metileno.
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COLORAÇÃO GERAL
OS MÉTODOS DE COLORAÇÃO PODEM SER GERAIS 
OU CITOQUÍMICOS
COLORAÇÃO GERAL
Os métodos gerais são aqueles cujo pH final da solução
permite a coloração de uma ampla gama de substratos, não
havendo possibilidade de se quantificar os compostos corados.
Ex.: Hematoxilina e Eosina
COLORAÇÃO CITOQUÍMICA
Os métodos citoquímicos apresentam alta especificidade
para seus substratos, havendo técnicas que permitem a
quantificação destes após a coloração. Ex. Corantes
citoquímicos:
Ex. Azul de Tuluidina e Xylidine Ponceau
Citoquímica / Histoquímica
“COMPREENDE TÉCNICAS DIVERSAS PARA A 
IDENTIFICAÇÃO E LOCALIZAÇÃO DAS MOLÉCULAS QUE 
CONSTITUEM AS CÉLULAS”
· Proteínas;
· Ácidos Nucléicos;
· Polissacarídeos;
· Lipídeos;
· Íons (Ex. Ca+2);
· Enzimas;
Métodos Especiais de Estudo
Deve ser:
Específicas - Reações químicas só deve ocorrer 
com o componente pesquisado;
Sensível - Capaz de detectar quantidades muito 
pequenas do componente;
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Citoquímica / Histoquímica
Para se localizar uma determinada substância, a 
reação citoquímica deve resultar:
Produto da Reação Tipo de 
Microscopia
Insolúvel e corado 
Cromóforo
Emite Fluorescência
Fluoróforo
Dispersar elétrons 
Eletro-denso
M. O.
Microscopia de 
Fluorescência
M.E.T.
As reações citoquímicas
podem ser mediadas por:
•Interações Eletrostáticas;
•Ligações Covalentes;
•Interações Hidrofóbicas;
REAÇÃO DE P.A.S. ( Periodic Acid Schiff): muito útil na
detecção de polissacarídeos neutros (glicogênio, amido e
celulose) e de radicais glicídicos de glicoproteínas;
A reação de P.A.S. (ácido periódico/reativo de Shiff),
também consiste de duas etapas:
1 Oxidação com ácido periódico, de grupamentos OH
vizinhos formando grupamentos aldeídos;
2 Coloração com reativo de Shiff, restaurando o grupo
cromofórico e gerando um composto corado (Magenta).
Reações Citoquímicas (Ligações Covalentes)
OBS.: a fixação do material não 
pode ser feita com formaldeído, 
paraformaldeído e Glutaraldeído. 
Corte transversal das glândulas do intestino 
grosso, mostrando as suas células 
caliciformes e absorventes. Método do PAS 
(Periodic-Acid-Schiff). Aumento médio.
células de Fígado. Método do PAS (Periodic-
Acid-Schiff). Aumento médio.
APLICAÇÃO: Fígado (acúmulo de glicogênio); Estômago 
(camada de revestimento – glicosaminoglicanos); 
Depósito de polissacarídeos nos tecidos = Amiloidoses e 
outras patologias.
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CITOQUÍMICA ENZIMÁTICA
“DETECTA ENZIMAS ASSOCIADAS COM ESTRUTURAS SUBCELULARES”
FUNDAMENTO: O método emprega um substrato que é
especificamente clivado por uma enzima na célula para liberar um
produto, o qual é transformado em um precipitado visível.
Ex.: A atividade da fosfatase ácida (lisossomos) foi determinado pela
incubação das células com -glicerofosfato de sódio e revelada em presença do
chumbo fosfato de chumbo, precipitado elétron-denso .
Requisitos: 1.Preservação da integridade molecular
(Fixadores brandos ou congelamento)
2. Ambiente de incupação adequado (pH
e temperatura)
Figura -Micrografia Eletrônica mostrando
a localização da enzima fosfatase ácida
em lisossomos.
IMUNOCITOQUÍMICAou IMUNOHISTOQUÍMICA
“AS TÉCNICAS IMUNOCITOQUÍMICAS PERMITEM O 
ESTUDO DA LOCALIZAÇÃO INTRACELULAR DE PROTEÍNAS 
ESPECÍFICAS”
É BASEADA NA REAÇÃO: ANTÍGENO - ANTICORPO
ANTÍGENO: Qualquer substância estranha que pode induzir
uma resposta imune em um hospedeiro e reage
especificamente com anticorpos.
ANTICORPO: Proteínas que se ligam fortemente aos seus
alvos, sintetizadas pelas células brancas do sangue.
O complexo antígeno-anticorpo pode ser
revelado por meio de marcadores
especiais ou sondas (corantes
fluorescente, enzimas, esferas de ouro
coloidal) e podem se visualizados sob
diferentes microscopias.
PODE SER DE DOIS TIPOS
IMUNOCITOQUÍMICA DIRETA - O anticorpo é marcado 
por um marcador (sonda), ex.: enzima, proteína.
IMUNOCITOQUÍMICA INDIRETA - O anticorpo é 
marcado por um segundo anticorpo (anticorpo secundário), ao 
qual será inserido um marcador (sonda).
IMUNOCITOQUÍMICA ou IMUNOHISTOQUÍMICA
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IMUNOFLUORESCÊNCIA
“QUANDO O COMPOSTO UTILIZADO NA MARCAÇÃO DO ANTICORPO É UM 
FLUOROCROMO”
 Isotiocianato de Fluoresceína (FITC) – Emite fluorescência VERDE.
 Isotiocianato de Tetrametilrodamina (TRITC) - Emite fluorescência
VERMELHA.
EQUIPAMENTO UTILIZADO: MICROSCÓPIO DE FLUORESCÊNCIA.
Marcação por fluorescência. Em vermelho: actina; em 
verde: microtúbulos; em azul: núcleo
Aplicações:
• Identificar subpopulações de linfócitos;
• Identificar espécies bacterianas;
• localização de hormônios;
• Detecção complexos ag-ac em doenças auto-imunes
•Detecção anticorpos anti-DNA
• Teste qualitativo;
Fc
FRACIONAMENTO CELULAR
“POR CENTRIFUGAÇÃO É POSSÍVEL OBTER ORGANELAS 
CELULARES EM ESTADO DE PUREZA E, EM SEGUIDA 
ESTUDAR SUAS PROPRIEDADES QUÍMICAS, FÍSICAS E 
BIOLÓGICAS”
CENTRIFUGAÇÃO FRACIONADA – Consiste de uma
série de centrifugações a velocidades crescentes.
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Etapas:
1.Homogeneização do tecido;
2. Centrifugação fracionada;
O isolamento da organela 
depende de seu COEFICIENTE 
DE SEDIMENTAÇÃO (Tamanho, 
forma e densidade)