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1. TÉCNICAS BÁSICAS EM ANATOMIA VEGETAL
A anatomia vegetal é uma área do conhecimento que estuda as células vegetais (fibras, células parenquimáticas, elementos traqueais etc.), o arranjo dessas células nos diversos tecidos vegetais (epiderme, parênquima, xilema etc) e a organização dos tecidos nos órgãos das plantas (raiz, caule, folha). Neste estudo é essencial a utilização de microscópios, uma vez que a maioria das células e dos tecidos apresenta tamanho reduzido. Assim, as medidas mais utilizadas são o milímetro (mm), o micrômetro (1 µm = 0,001 mm) e o nanômetro (1 nm = 000,1 µm).
Microscopia de luz e microscopia eletrônica
O desenvolvimento dos microscópios e das técnicas de preparo de amostras tornou possível a superação do limite de resolução do olho humano na solução de problemas biológicos. 
O limite de resolução do olho humano, ou seja, a menor distância entre dois pontos que o olho humano pode distinguir é 0,1mm. O limite de resolução do microscópio de luz (ML) é menor, apenas 0,2 µm. Porém, o limite de resolução é inversamente proporcional ao poder de resolução. Pode-se concluir, então, que o poder de resolução do ML é 500 vezes maior que do olho humano.
O poder de resolução é ainda maior na microscopia eletrônica pelo uso de elétrons em substituição à luz. O limite de resolução do microscópio eletrônico é 2 nm, portanto, seu poder de resolução é 100 vezes maior que o ML. 
1.2. Interpretação de imagens obtidas em microscopia de luz e microscopia eletrônica
Os estereomicroscópios permitem a observação de superfícies de peças inteiras ou de parte delas, caracterizando a morfologia do material em estudo. A luz incide sobre as amostras e produz imagens tridimensionais e coloridas. Os ML permitem a observação de células e tecidos de um determinado órgão, ou seja, caracterizam a anatomia. A passagem da luz através das amostras, que devem ser delgadas e translúcidas, gera imagens bidimensionais e, também, coloridas. 
Os microscópios eletrônicos de varredura (MEV) também permitem o estudo de superfícies de peças inteiras ou de parte delas, assim como os estereomicroscópios, mas são os elétrons que incidem sobre as amostras. Nos MEV, as imagens produzidas são tridimensionais em preto e branco, o que caracteriza a micromorfologia. Os microscópios eletrônicos de transmissão (MET) possibilitam a visualização detalhada de componentes subcelulares, como membrana plasmática, cromossomos, mitocôndrias, plasmodesmos, ribossomos, microtúbulos, microfilamentos, dentre outros, o que caracteriza a ultraestrutura. Os elétrons atravessam as amostras, que devem ser ainda mais delgadas que aquelas utilizadas nos ML, e formam imagens bidimensionais e, também, em preto e branco. 
O processamento das amostras para microscopia eletrônica e para microscopia de luz guardam algumas semelhanças e algumas diferenças, mas o preparo das amostras é mais complexo e oneroso quando destinado à microscopia eletrônica, principalmente para MET.
1.3. Técnicas de preparo de amostras para microscopia de luz
Nas lupas, as amostras podem ser observadas sem nenhum processamento prévio e dispensa o uso de lâminas e lamínulas. Nos microscópios de luz (ML), geralmente, as amostras requerem algum processamento das amostras e o uso de lâminas e lamínulas.
Quando se estuda um órgão em ML, o que é tridimensional tem que ser compreendido em apenas duas dimensões. Para tanto, é indispensável a utilização de planos de corte específicos que devem nortear a amostragem e o processamento do material. Os principais planos de corte são: transversal, longitudinal radial e longitudinal tangencial. 
Corte transversal é aquele perpendicular ao maior eixo da estrutura ou órgão.
Corte longitudinal radial é aquele paralelo ao maior eixo da estrutura ou órgão, passando pelo centro do mesmo.
Corte longitudinal tangencial é aquele paralelo ao maior eixo da estrutura ou órgão, e que não passa pelo centro do mesmo. O corte tangencial que compreende a superfície do órgão é chamado de corte paradérmico.
As principais etapas do preparo das amostras para ML são: coleta e amostragem, fixação e conservação, seccionamento, inclusão, coloração e montagem. 
Coleta e amostragem
A coleta das amostras deve ser criteriosa e observar os objetivos do trabalho, assim como as partes coletadas (amostras) devem representar o todo. O material coletado pode ser processado ainda fresco, no campo ou levado rapidamente para o laboratório. O material fresco é utilizado apenas para observações rápidas, localização de pigmentos naturais ou testes específicos.
Na maioria das vezes, o material coletado só pode ser processado após dias ou mesmo meses da coleta e, nesse caso, é colocado diretamente em solução fixadoras. Material desidratado, como exsicatas de herbários, também pode ser utilizado após técnicas especiais de reidratação.
Fixação e conservação
A fixação é o processo de imersão das amostras em soluções (fixadores) que provocam um choque químico e a morte rápida de células e tecidos, preservando-os o mais próximo possível da condição in vivo. Os fixadores evitam a ação de enzimas de lise que agiriam naturalmente e provocariam a degradação das amostras se a morte das células e tecidos de um órgão ocorresse pela simples coleta do material.
Os principais fixadores utilizados em ML são fixadores alcóolicos como o FAA50 (formoldeído, ácido acético e álcool 50%, 5:5:90), mas fixadores não alcóolicos, como os aldeídos (glutaraldeído e paraformaldeído), também são empregados. As amostras são mergulhadas em frascos contento o fixador na proporção de 10:1 (fixador: amostras). O tempo de fixação depende do fixador e do tamanho das amostras, mas geralmente varia de 24 a 48h.
O material já fixado é transferido para frascos com solução conservante, como o etanol 70%, na proporção de 10:1. O tempo de preservação é indeterminado, chegando a anos, desde que os frascos permaneçam devidamente fechados.
Seccionamento e inclusão
O seccionamento ou corte varia de acordo com as características da amostra e da disponibilidade de aparelhos. Amostras frescas ou fixadas podem ser seccionadas à mão livre ou em micrótomo de mesa, utilizando lâminas de barbear, e em criomicrótomo ou em micrótomo de deslize, utilizando navalhas de aço permanentes ou descartáveis. 
Amostras muito pequenas, muito friáveis, muito moles, assim como a necessidade de cortes muito finos, cortes com espessura definida ou cortes seriados exigem o processo de inclusão antes do seccionamento. A inclusão consiste na embebição das amostras em materiais que aumentam sua dureza e superfície, como a parafina e a resina plástica (metacrilato). A parafina permite cortes de 10-15 µm, enquanto a resina plástica, que é mais dura, permite cortes de 3-8 µm. Apenas essas amostras incluídas em parafina ou resina plástica são seccionadas em micrótomo rotativo (com navalhas de aço permanentes ou descartáveis ou navalhas de vidro).
Coloração
A degradação rápida dos pigmentos naturais e a coloração brancacenta das paredes celulares propiciam pouco contraste entre as estruturas celulares e tecidos das amostras vegetais observadas em ML. O uso de corantes aumenta a intensidade e a durabilidade do contraste entre estruturas celulares e tecidos. Entre os métodos de coloração mais utilizados estão a dupla coloração e a coloração metacromática. Na dupla coloração, são utilizados dois corantes monocromáticos que reagem de maneira diferencial com os componentes celulares. Geralmente são utilizados o azul de astra ou verde rápido como corante geral, apenas para aumentar o contraste entre as estruturas celulares, e a safranina ou a fucsina básica como corante específico para compostos fenólicos, como a lignina presente na parede celular de algumas células. Assim, células que só apresentam lamela média e parede primária se coram apenas de azul ou verde, e aquelas que também têm depósito de parede secundária coram de vermelho ou fúcsia, o que promove a distinção clara entre dois padrões de células vegetais. Na coloração metacromática,um único corante, como o azul de toluidina, tem a capacidade de reagir com diferentes classes de compostos e exibir uma cor característica para cada um deles. Quando o azul de toluidina reage com compostos fenólicos esse substrato exibe a coloração verde, quando reage com pectinas, exibe a coloração rosa, e quando reage com material celulósico exibe a coloração azul-arroxeada. 
Enquanto os corantes são duradouros, alguns reagentes utilizados em testes histoquímicos também coram compostos químicos específicos, mas geralmente perdem a coloração rapidamente. Exemplos desses testes histoquímicos são o sudan (para detecção de lipídios), o vermelho de rutênio (para detecção de pectinas), a floroglucina ácida (para detecção de ligninas) e o lugol (para detecção de amido).
Montagem
Para a finalização de uma lâmina histológica, o meio de montagem é colocado sobre a lâmina, envolvendo toda a amostra processada e, então, coberto com lamínula. Além de envolver a amostra, o meio de montagem também deve penetrar em todas as células, tecidos e espaços intercelulares. 
Os meios de montagem mais utilizados têm índice de refração próximo ao do vidro (1,50-1,90), como a água (1,33), a glicerina (1,47), as resinas naturais como o Bálsamo do Canadá (1,53) e as resinas sintéticas como o Permount, o Entelan (1,49) e o verniz de artesanato (1,49), por exemplo.
Amostras hidratadas podem ser montadas em água, em glicerina 50%, constituindo lâminas temporárias, ou em gelatina glicerinada, constituindo lâminas semi-permanentes. As lâminas permanentes são preparadas com resinas naturais ou sintéticas como meio de montagem e, para isso, geralmente há necessidade de desidratação e posterior imersão gradativa das amostras em solventes dessas resinas. Portanto, o que define a durabilidade de uma lâmina histológica, que pode chegar a algumas décadas, não é só o tipo de processamento e a qualidade dos reagentes utilizados (corantes, por exemplo), mas principalmente o tipo de montagem.
Observação e obtenção de imagens
Após o preparo das lâminas, a observação é feita em ML, e o registro das imagens pode ser feito com uma simples câmera digital ou celular com o mesmo equipamento posicionado na ocular, ou mesmo em fotomicroscópios com câmeras fotográficas analógicas ou digitais mais específicas para esse fim. As imagens produzidas são chamadas de fotomicrografias. A confecção de desenhos esquemáticos com o auxílio de câmaras-claras ainda é uma opção para o registro das imagens.
Técnicas complementares
Outras técnicas de confecção de lâminas histológicas também são utilizadas a partir de peças inteiras ou de parte delas, como a diafanização, a dissociação de epidermes, a maceração e a impressão com adesivo instantâneo. 
Na diafanização, folhas inteiras ou parte delas são clarificadas, coradas e montadas, o que permite o estudo da venação e da epiderme. Na dissociação de epidermes, pedaços de folhas são tratados com uma mistura ácida que degrada a lamela média e permite a individualização das células, exceto as células epidérmicas que permanecem coesas pela presença da cutícula que reveste externamente esse tecido. O processo é finalizado com a coloração da epiderme isolada e a montagem. A maceração é uma técnica muito semelhante à dissociação de epiderme, mas é mais utilizado para a obtenção de células individualizadas de madeiras ou de cascas. Finalmente, a impressão com adesivo instantâneo é a mais simples, pois consiste na colagem da folha com o adesivo instantâneo sobre a lâmina histológica. Com a retirada da folha, sua superfície fica impressa na lâmina e permite a observação da superfície epidérmica sem o uso de corantes, meios de montagem e lamínulas.
	Diante do exposto, pode-se supor que o preparo de uma lâmina histológica para ML é extremamente rápido e simples, como o preparo de lâminas temporárias que são descartadas logo após a observação e o registro das imagens. Todavia, na maioria dos casos, esse preparo é muito mais lento e complexo, envolvendo muitas etapas, gasto de material e de tempo, como as lâminas permanentes que compõem o laminário dessa disciplina. Agora é mais fácil entender por que esse laminário é tão precioso e precisa ser bem cuidado por todos os usuários!
1.4. Técnicas de preparo de amostras para microscopia eletrônica
Os microscópios eletrônicos apresentam algumas limitações na observação das amostras, como a necessidade de alto vácuo na coluna e pelo baixo poder de penetração do feixe de elétrons. Esses fatores exigem etapas específicas no processamento das amostras. 
O MEV permite o exame de superfícies, com processamento de amostras relativamente rápido e simples. As principais etapas do processamento são a fixação (fixadores alcóolicos como o FAA50 ou não alcoólicos como os aldeídos), a desidratação (troca gradativa da água por etanol), a secagem em ponto crítico de CO2 (troca gradativa do etanol por CO2 líquido sob pressão) e a metalização (geralmente com ouro) das amostras. 
Em MET, o preparo das amostras inclui fixação (aldeídos), pós-fixação (ósmio), desidratação (troca gradativa da água por etanol ou acetona), inclusão em resina (troca gradativa de etanol ou acetona por resina epox), seccionamento em ultramicrótomo para obtenção de cortes semi-finos (1 µm de espessura) e, posteriormente, cortes ultrafinos (60-90 nm de espessura) recolhidos em grades de cobre (3 mm de diâmetro). O processamento é finalizado com a contrastação (acetato de chumbo e citrato de uranila) das amostras nas grades de cobre.