DESNATURÇÃO E PRECIPITAÇÃO DE PROTEÍNAS

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO
CAMPUS UNIVERSITÁRIO DO ARAGUAIA
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE
DESNATURAÇÃO E PRECIPITAÇÃO DE PROTEÍNAS
 
SUZANE TORRES DA SILVA
Prof. Dr. NATHÁLIA RESENDE
BARRA DO GARÇAS – MT
13 de Abril de 2016
INTRODUÇÃO
Proteases, ou enzimas proteolíticas, é um grupo de enzimas que catalisam a quebra das ligações peptídicas entre os aminoácidos das proteínas. Podem ser obtidas das plantas, animais e microrganismos. Proteases têm grandes aplicações industriais, principalmente nas indústrias de comida, detergentes, medicina e biotecnologia.
MÉTODOS
Pesou-se 2g de gelatina incolor sem sabor (colágeno)e dissolveu em 20mL de água destilada em um tubo de ensaio de 30mL com a ajuda do bastão de vidro. Após total solubilização a gelatina foi levada à estufa de banho maria à 60°C e mantida na estufa até o momento de sua utilização.
Macerou-se pedaços de abacaxi com o auxílio do almofariz e do pistilo, até que uma boa quantidade de suco fosse produzida. O suco foi filtrado em funil de vidro com papel de filtro.
Com a pipeta colocou-se 2mL do suco de abacaxi em dois tubos de ensaio de 20mL. Colocou-se 2mL de água, sulfato de amônio e etanol em tubos de ensaio de 20mL. Um tubo com abacaxi foi aquecido à 60ºC e os outros foram mantidos à temperatura ambiente.
 Retirou-se o tubo com a gelatina da estufa e adicionou-se 2mL em cada um dos cinco tubos. As amostras foram observadas e os resultados anotados.
RESULTADOS
	
	Tubo 1
	Tubo 2
	Tubo 3
	Tubo 4
	Tubo 5
	Água Destilada
	2,0mL
	
	
	
	
	Amostra Abacaxi
	
	2,0mL
	
	
	
	Amostra Abacaxi 60°C
	
	
	2,0mL
	
	
	Sulfato de Amônio
	
	
	
	2,0mL
	
	Etanol Absoluto
	
	
	
	
	2,0mL
	Gelatina
	2,0mL
	2,0mL
	2,0mL
	2,0mL
	2,0mL
	Resultados
	Líquida
Homogenia
Solubilizada
Sem partículas
	Líquida
Homogenia
Solubilizada
Sem partículas
Cor amarela
	Líquida
Heterogenia
Com partículas, presença de
espuma
	Solubilizou parcialmente Formação de placas sólidas
Heterogenia
	Solubilizou parcialmente Formação de flocos, precipitado gelatinoso
Heterogenia
Tabela 1 Resultados observados nos experimentos.
Figura 1: Tubos com amostras puras, sem gelatina.
Figura 2: Resultado tubo 1 - Água destilada e gelatina
Figura 3: Resultado tubo 2 - Amostra de abacaxi e gelatina
Figura 4: Resultado tubo 3 - Amostra de abacaxi elevada a 60°C e gelatina.
Figura 5: Resultado tubo 4 - Sulfato de amônio e gelatina.
Figura 6: Resultado tubo 5 - Etanol e gelatina.
Figura 7: Amostras após adição de gelatina.
A desnaturação de proteínas acarreta perda de sua estrutura original. Ocorrendo alteração na conformação tridimensional das proteínas (estrutura secundária, terciária e quaternária) sem romper as ligações peptídicas (estrutura primária). A proteína é dita desnaturada quando sua conformação nativa é destruída devido à quebra de ligações não-covalentes e o resultado é uma cadeia polipeptídica distendida.
Figura 8: Desnaturação de proteínas.
Um dos agentes de desnaturação de proteínas é ação de ácidos ou base fortes. Quando adicionamos o suco de abacaxi ao colágeno ocorrem modificações no pH que resultam em alterações no estado iônico de cadeias laterais das proteínas, modificando as pontes de hidrogênio e as pontes salinas (associação de grupos iônicos de proteínas de carga oposta). Como afeta a ionização da proteína, conferem a molécula uma elevada carga positiva, ou negativa, ocasionando repulsão intramolecular, com exposição do núcleo hidrofóbico.
Quando elevamos a temperatura do suco de abacaxi, as enzimas presentes no suco de abacaxi são também desnaturadas, e a capacidade de quebra do colágeno é corrompida. Como a estrutura tridimensional específica das proteínas é fundamental para o exercício de suas funções, alterações estruturais provocadas pela desnaturação ocasionam a perda parcial ou completa das suas funções. Com o aumento da temperatura, a velocidade de vibração molecular aumenta. Eventualmente, interações fracas como as pontes de hidrogênio são rompidas promovendo alterações na conformação das enzimas presentes no abacaxi.
A adição de solventes orgânicos solúveis em água, como o etanol, ao colágeno presente na gelatina diminuem a constante dielétrica do meio, interferem com as interações hidrofóbicas por sua interação com os grupos R não polares e formam pontes de hidrogênio com a água e grupos proteicos polares. O álcool deixou a solução não homogênea, ou seja, com início de precipitação. Isso se deve a sua ação como desnaturadores de proteínas, modificando as estruturas da proteína em questão, uma vez que quebra as ligações fracas presentes nela. Os solventes não polares também rompem interações hidrofóbicas. A adição de sais, como o sulfato de amônio a grupos ionizáveis do colágeno, enfraquecem as interações entre grupos de cargas opostas da molécula proteica. As moléculas de água solvatam os grupos proteicos, havendo a formação de um precipitado gelatinoso. As moléculas de água competem pelo sal adicionado tornando a quantidade de solvente muito pequena e, com isso, promovendo a agregação de moléculas proteicas e a sua precipitação. Esse efeito é chamado salting out.
DISCUSSÕES
O abacaxi possui uma potente enzima, a bromelina, que leva esse nome pelo fato de o abacaxi pertencer à família das bromeliáceas. A bromelina foi detectada pela primeira vez em 1892 por Chittenden. Essa enzima está presente em todas as partes do abacaxi, porém é no caule que se encontra maiores quantidades. A enzima não está presente nos primeiros estágios de desenvolvimento do fruto, porém, seu nível aumenta rapidamente, mantendo-se elevado até o amadurecimento, onde tem um pequeno decréscimo. Essa é uma das vantagens da utilização das proteases do abacaxi em comparação com outras proteases vegetais. Apesar da diminuição da atividade proteolítica durante a maturação, o abacaxi é o único fruto que possui concentrações relativamente altas de proteases no estado maduro.
A purificação da bromelina pode ser realizada através de um método conhecido por ALE (Adsorção em Leito Expandido). Esta é uma técnica cromatográfica para separação e purificação de produtos biológicos diretamente de seu extrato bruto, sem o uso de centrifugação, microfiltração e outros passos primários de clarificação. Esta técnica permite que o extrato bruto seja alimentado na coluna cromatográfica sem tratamento inicial, e enquanto o leito expande, a superfície de contato do adsorvente aumenta, fazendo que a interação com a molécula alvo seja mais efetiva.
A atividade das proteases pode ser otimizada com o aumento da temperatura e com a proximidade do pH neutro. Esta temperatura não pode ser muito elevada, senão irá ocorrer a desnaturação da protease.
A desnaturação de proteínas não tem grande influência na utilidade nutricional dos alimentos, mas tem grande efeito em outras propriedades como sabor, cor, estabilidade e solubilidade, ou seja, a desnaturação de proteínas pelo fornecimento de calor é útil, pois facilita a digestão dos alimentos.
O abacaxi é uma fruta que contem em seu caule, folhas, raízes e fruto uma enzima proteolítica chamada bromelina. A bromelina é capaz de desdobrar proteínas em substâncias mais simples como proteases e peptonas. Ela quebra as proteínas das fibras musculares e do tecido conjuntivo, que dá liga ao músculo e é um dos principais responsáveis pela eventual dureza da carne. A bromelina pode ser utilizada na fórmula de amaciantes de carnes. Os amaciantes comerciais possuem também temperos, fazendo com que não apresente o gosto do abacaxi na carne.
CONCLUSÃO
Durante o experimento, verificamos que as proteases atuam nas ligações peptídicas. Quando a protease envolvida (bromelina) foi desnaturada, perdendo sua função, o colágeno reagiu naturalmente, enrijeceu a solução. Uma das vias para o desnaturação é o aumento da temperatura, a bromelina perdeu totalmente seu poder de reaçãocom o colágeno. Outro é a solvatação que demonstrou mesmo a temperatura sendo ambiente, como as forças nas ligações peptídicas podem modificar-se de acordo com o reagente colocado para atuar na proteína.
REFERÊNCIAS
http://www.todafruta.com.br/todafruta/mostra_conteudo.asp?conteudo=19499. Acesso em 13/04/2016.
http://www.sbpcnet.org.br/livro/57ra/programas/senior/RESUMOS/resumo_1398.html. Acesso em 13/04/2016.
http://supermundo.abril.com.br/busca/?qu=abacaxi. Acesso em 13/04/2016.