Resumo de Biologia Celular

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Terapia Gênica
Definição: Introdução de genes por meio de métodos virais ou não virais com o objetivo de correção de defeito genético e/ou manipulação do comportamento celular.
2 Formas de aplicação:
In vivo: Injeta o vetor diretamente no paciente. Ex: câncer.
Ex vivo: Retira-se as células do paciente, para em laboratório modificá-las e posteriormente introduzi-las no paciente novamente. Ex: Tratamento de células hematopoiéticas.
2 Tipo de vetores pra transferência gênica:
1 - Não virais: Através de plasmídeos (DNA naked); lipossoma; polímeros catiônicos.
Liposssoma: Envelope lipídico com DNA dentro é endocitado pela célula. 
Complexo Catiônico (Ex: JetPEI): idem ao lipossoma.
Vacina: Usada para o tratamento do câncer. Melanoma com o gene de interesse é injetado no paciente. Ele vai, então, se unir ao tumor, produzindo a proteína de interesse.
Eletroporação: Aplica-se campo elétrico na célula, para abrir os poros dela e o DNA conseguir entrar. É feito apenas com tecidos acessíveis.
Vírus combinado: Eletroporação + Sistema de transposon/transposase. A célula alvo é modificada in vivo através da adição de 2 plasmídeos. Um plasmídeo contendo o gene alvo (que produzirá que a proteína desejada) e o outro expressando transposase. A transposase adicionará o gene alvo em regiões de transposon do DNA. (Mais eficiente).
2 – Vetores virais: Retira do genoma do vírus tudo que possa causar doença (genes de replicação, etc) e insere no lugar deles o seu gene de interesse.
Adenovírus: Muito comum; parte da população já foi exposta; não envelopado.
Infecta células que expressam a proteína CAR (presente em quase todas) e integrinas específicas. Infecta também células em divisão e “resting”. 
Ele é imunogênico (capaz de causar resposta imune, graças a grande exposição da população a ele); consegue produzir altos títulos de vetor; possui grande capacidade de carga; e utiliza-se plasmídeo pra ajudar na montagem do vírus.
A expressão do gene é transiente, visto que não há injeção do gene no DNA.
Adenovírus Associado (AAV): É um vírus não envelopado, com DNA fita simples e dependente da proteína do Adenovírus pra realizar sua replicação. Reconhece diversos receptores celulares e grande partes da população já foi infectada (100 sorotipos). Logo, a eficiência de transdução depende do sorotipo/célula alvo, sendo os fibroblastos; células tronco e céls. endoteliais refratárias a ele.
Não integra o genoma, porém permite a expressão a longo prazo devido a permanência epissomal do transgene.
Obs: permanência epissomal é a capacidade que o genoma tem de se manter como epissoma, permanecendo assim ligado as histonas. Semelhante ao que ocorre com o nucleossoma (DNA+histonas) da cromatina. 
Retrovírus (M-MLV)/ Lentivírus (HIV): Possuem DNA de fita simples e são envelopados (seu envelope pode ser modificado, para alterar o tropismo).
	Retrovírus
	Lentivírus
	Infectam células em divisão
	Em divisão e “resting”
	Mais propenso a silenciamento transcricional
	Regulado por promotor exógeno
	Expressão do transgene regulado por LTR (promotor viral)
	
~> Transfecção pra geração de vetores virais: Método que consiste na introdução de plasmídeos com diferentes partes do vírus no envelope viral. Isso evita a recombinação viral e mutações que possam causar algum dano no hospedeiro.
Aplicação da terapia gênica:
- Transferência de genes;
- Correção do DNA; 
- Amplificação da produção de ptns;
- Indução de morte celular;
- Silenciamento de genes.
Riscos e prevenção: Há o risco de mutagênese insercional, porém isso pode ser prevenido com o refinamento dos protocolos.
Terapia Celular
Definição: Terapia pra restaurar a função e/ou estrutura de um órgão ou tecido danificado.
Os transplantes de órgãos são caros, há um grande período de espera e não há a possibilidade de transplantar alguns órgãos, como o cérebro.
O transplante celular pode ser autólogo (mesmo indivíduo); alogênico ( entre indivíduos da mesma espécie) e xenogênico ( entre espécies diferentes).
Testes clínicos avaliam os efeitos e benefícios em seres humanos:
Fases: 
Estudo de segurança: uso de grupos pequenos, curto prazo.
Estudo de eficácia: Há mais voluntários, avalia a melhora do paciente.
Estudo ampliado: Envolve diferentes populações, para ver se tem o mesmo efeito em pessoas de idades diferentes, sexos diferentes, origens diferentes. Busca também a relação custo/benefício do medicamento. 
Estudo da vigilância: Vê se depois de um tempo de uso há novas reações adversas e planejam estratégias de tratamento.
Desafios para a realização da terapia celular:
Imunorejeição: Causada principalmente pelo sistema sanguíneo ABO; Tipagem HLA (Human Leukocyte antigen); MHCI (presente em todas as células do corpo, dando a identidade do indivíduo) e MHCII (presente em células apresentadoras de antígeno).
Ex: Células tronco embrionárias humanas em transplantes alogênicos. 
A solução para evitar rejeição é o uso de iPS com células da própria pessoa.
Formação de tumores: Células tronco embrionárias diferenciadas, porém contaminadas com indiferenciadas, causaram teratomas em diversos estudos. CTs multipotentes também podem causar esse efeito.
Solução: Excluir células indiferenciadas do grupo que será transplantada, através de anticorpos citotóxicos pra céls. Indiferenciadas.
Quantidade de células: A expansão in vitro pode causar a contaminação e mutações, principalmente com o uso de escalonamento (uso de placas; é um processo lento e há a necessidade de muitas placas).
Solução: Uso de biorreatores com spinner dentro, que cuidarão de diversos parâmetros ao mesmo tempo (temperatura, pH, oxigenação, etc). 
	Escalonamento
	Biorreatores
	Precisa utilizar MEF
	Não precisa
	Cultura heterogênea
	Cultura homogênea
	Há mais contaminação
	Menos contaminação
	Mais caro
	Mais barato
Biomateriais utilizados para próteses em transplantes: Podem ser biodegradáveis, bioinertes, bioativos ou biotoleráveis. Também podem ser naturais (produzidos por plantas, animais e microorganismos) ou sintéticos (metálicos, cerâmicos, compósitos e polímeros).
Eles substituem, tratam ou melhoram órgãos ou funções do organismo. Tem funções protésicas, diagnósticas e terapêuticas. Ex: cirurgias ortopédicas ou vasculares.
(Principal falado) 
- Biodegradáveis: não são tóxicos, não promovem reações alérgicas. Após algum tempo são fagocitados e substituídos por tecidos do corpo, ideais para transplantes temporários e não é necessária nova cirurgia pra retirar o transplante.
Ajuda no suporte das células que vão se instalar no lugar da prótese.
Carcinogênese
Def: Processo de formação de tumor maligno.
As células tumorais possuem a aparência de fibroblasto com um núcleo bem grande.
Neoplasia: Proliferação anormal das células. Pode ser benigna ou maligna. 
Massa de células neoplásicas + estroma de apoio (vasos, células ao redor) = Tumor!
Obs: in cito -> tumor sem capacidade de invadir outros tecidos.
Nomenclatura dos tumores:
Benignos: Acrescenta-se OMA ao nome do tecido atingido.
Ex: Lipoma; osteoma; papiloma (epiderme). Há exceções.
Malignos: Considera-se a origem embrionária ao nomear:
- Tecido de revestimento interno ou externo: carcinoma;
- No epitélio glandular: adenocarcinoma;
- Nos tecidos conjuntivos ou mesenquimais: Sarcoma + nome que represente o tecido.
Ex: Fibrossarcoma; osteossarcoma; lipossarcoma. Exceções: glioblastoma; teratoma.
CONCEITOS: 
Oncogênese: patogênese da neoplasia.
Carcinogênese: patogênese do câncer.
Carcinógeno: agente causador do câncer.
Mutágeno: agente causador de mutações.
Oncogenes: genes que causam o câncer
Hiperplasia: Aumento localizado e autolimitado do número de células de um órgão ou tecido. As células ainda têm as funções e sua forma normais. Pode ser benigna ou maligna e pode ser fisiológica ou patógena.
Metaplasia: Processo proliferativo de reparo em que o tecidoformado é de tipo diferente do original. Geralmente conferem maior proteção. Ex: mudança do tipo de epitélio em determinado órgão graças ao desgaste do anterior.
Displasia: Lesão pré-neoplásica: Forma de proliferação celular caracterizada por perda de polaridade e alteração na forma e tamanho, além da presença frequente de mitose.
FORMAÇÃO DO CÂNCER:
Dano genético não letal: perda ou lesão de genes supressores; duplicação de genes promotores; perda ou lesão de genes apoptóticos ou dos genes de reparo do DNA.
As causas podem ser ambientais, hereditárias ou a combinação de ambas.
6 Fatores que levam a carcinogênese:
Autossuficiência em fatores de crescimento (GF): 
Em células cancerígenas, ocorre a superexpressão de receptores de fatores de crescimento. Elas também produzem seus próprios GFs e favorem a estimulação autócrina (autorregulação). Essas células também cooptam, ou seja, induzem células vizinhas a liberarem fatores estimulantes.
.... Não há a necessidade de adicionar GFs externos do meio de cultura das células cancerígenas.
Insensibilidade a estímulo anti-crescimento: 
Tem haver com a ptn Rb e o completo Rb/E2F. Mutações que inativam Rb que podem causar tumores: mutação no gene do Rb; Inativação do Rb por proteínas virais; Inativação por fosforilação; proteólise caspase-dependente de Rb.
Resistência a apoptose: 
Capacidade adquirida por tumores. Pode estar ligada a mutação na p53; PI3K/Akt (superexpressão leva a sobrevivência celular) ou a co-expressão de bcl-2 e myc.
Síndrome de Li Fraumeni: causa diversos tumores na pessoa, graças a mutações na p53 que ocorre em todas as células do corpo.
Capacidade ilimitada de replicação:
Graças as fatores mencionados acima. β-catenina/ APC: ligado a proliferação do epitélio do cólon. Mutação pode levar a formação de tumores.
Angiogênese: 
Ocorre superexpressão de VEGF nos tumores. São vasos geralmente mal formados, mas que conseguem levar o oxigênio para as células.
Avastin: medicamento que se liga a VEGF-A, impedindo a estimulação de angiogênese nos tumores.
Metástase:
As células tumorais de determinado tecido se espalham através dos vasos sanguíneos. (E-)caderinas/integrinas: pode haver perda dessas proteínas, causando o desligamento cél-cél e cél-MEC.
Há também outros fatores recém estudados, como: falha do sistema imune; desregulação da energia celular; e inflamação crônica (Estímulo -> citocinas pró-inflamatórias -> resposta imune -> instabilidade genômica; angiogênese -> crescimento tecidual/malignização).
Proliferação, morte celular e diferenciação no câncer
Conceitos: 
- Câncer é uma doença genética;
- Tumorigênese é um processo microevolucionário, que depende da instabilidade gênica. .......... Elas ganham das células normais pelo fato de não sofrerem apoptose e se replicarem indefinidamente.......
- Tumores são geneticamente heterogêneos, pois dentro do tumor há células com características genéticas diferentes graças a alta taxa de mutação.
TAXA DE PROLIFERAÇÃO: Dois fatores controlam esta taxa:
Taxa de Ganho Celular: É ligada a divisão celular. Na célula tumoral, há diversos mecanismos para estimular sua proliferação, como: fatores de crescimento, produção de moléculas com efeitos parácrinos em células do microambiente, ou sinalização autócrina (self-regulation). 
Exemplos: - Glioblastoma tem mutações no receptor de E2F (no núcleo), causando sua fosforilação contínua e a consequente divisão celular. OBS: Rb hiperfosforilado pode servir como um anti-apoptótico em glioblastoma.
- Em melanomas, a proteína B-RAF não precisa se ligar ao receptor Ras pra pode ativar o ciclo de divisão. Vemura-fenilo: medicamento que atua no B-RAF mutado, atuando somente nas células cancerígenas.
 É necessária apenas uma mutação na via de controle do ciclo celular para ocorrer seu descontrole.
 Controle do ciclo celular: Parte é feita pelo controle da produção de ciclinas/CDKs ou por CKIs, que inibem os complexos Clinina/CDK. Fatores ambientais também controlam o ciclo. Ex: Tumor de bexiga: Expressão de Ciclina D1 alterada influencia na malignidade ou benignidade dos tumores ( ciclinas Divisão Celular).
Taxa de Perda Celular: Relacionado a 3 fatores:
Diferenciação celular no câncer: 
- Anaplasia: Células pouco diferenciadas onde elas já deveriam estar totalmente diferenciadas. Isso ocorre muito nos tumores.
Para ocorrer a diferenciação, a célula tem que estar em Go. No caso, p21 irá causar a parada do ciclo celular, para então a cél. se diferenciar.
Ex: Rabdomiossarcoma: Não produz p21. A célula fica mais indiferenciada e não sai do ciclo celular. O Butirato induz a formação de p21, revertendo os efeitos do tumor.
Senescência Replicativa: 
A célula para de se replicar de vez, graças ao desgaste dos telômeros. Quando não ocorre a senescência sem a presença de telomerase, o DNA fica comprometido, aumentando a instabilidade gênica. 
O contrário também acontece:
Telomorase Tumorigênese : Células cancerígenas podem voltar a produzir telomerase. Quanto maior o número de replicações, mais chances de haver mutações que levam ao câncer.
Morte Celular: A maioria das terapias quer matar as células tumorais. Há duas vias que podem ser atingidas: a Intrínseca (tem haver com a via pela mitocôndria) e a Extrínseca (ativada por receptores de morte).
Há 2 tipos de fatores que podem levar a apoptose:
 - Hiperproliferação: em células normais há a ativação da apoptose (via intrínseca).
Ex: c-myc desregulado leva a alta proliferação e o impedimento da morte celular. Ele bloqueia a ação da p53.
- Quimioterápicos: Leva a apoptose por dano no DNA.
Ex: Se não houver ativação da p53, a célula não morre. Na maioria dos tumores, p53 está mutado. Mesmo com dano no DNA, se o p53 não for ativado, não haverá apoptose. A solução é ativar a via extrínseca de apoptose, que não depende de p53 (é o que os quimioterápicos fazem).
Base Molecular do Câncer
Conceitos:
Alterações genéticas que podem levar ao câncer: mutação pontual, amplificação gênicas ou deleção gênica.
As causas podem ser por fatores ambientais, como: radiações; tabaco; álcool em excesso; compostos químicos; dieta rica em gordura trans; estresse; vírus.
Os danos podem ser diretos ou indiretos ao DNA.
Possíveis danos ao DNA em:
	Iniciadores
	Promotores
	Mutam o DNA
	Não mutam
	Irreversível
	Reversível
	Sozinhos podem causar o câncer
	Não podem causar o câncer sozinhos
Hormônios e Câncer:
- Hormônios de crescimento (HGF) e estradiols tendem a ter efeito mitogênico/proliferativo nas células. E quanto mais divisão celular, maior a chance de acumular erros no DNA.
- Com a menopausa, o risco de incidência de câncer diminui, já que não há mais a produção extensiva de progesterona e estrogênio.
Porém, a obesidade pós-menopausa aumenta o risco de câncer: adipócitos convertem androstenediona em estrona.
- O aumento da atividade física e o aumento do período de lactação diminuem o risco de câncer.
Vírus e Câncer:
-Retrovírus: integração do genoma no meio de gene importante para a célula pode levar a formação de câncer. Ele também tem a capacidade de carreiar cópias de genes de mamíferos, que quando presentes, duplicam a quantidade do gene transcrito.
- HPV: Possui as proteínas E6 e E7. A E6 age na p53, marcando-a com ubiquitina e levando-a a degradação. Já a E7 fosforila o Rb, fazendo que E2F fique livre pra continuar com o ciclo celular.
Erros de replicação da DNA polimerase (aleatórios): 
Caso os erros não sejam corrigidos, pode haver a formação de tumores (graças à instabilidade gênica e a erros em genes importantes pra apoptose e replicação). Ao longo da vida, esses erros tendem a se acumular.
Em suma: 1ª mutação: maior capacidade proliferativa
		2ª mutação: aumenta mais ainda a capacidade proliferativa
		3ª mutação: capacidade de resistir a apoptose.
Mudanças Epigenéticas e Câncer:
Modificação nas histonas: acetilação ou desacetilação erradas. Também pode haver ametilação errônea dos promotores.
Células Tronco no câncer:
- Células de câncer reativam a TERT (repositora de telômeros) ou células tronco sofrem mutações e viram cancerígenas. E as células cancerígenas, mesmo sem reativação de TERT, encontram meios pra evitar o desgaste do telômero.
Supressores de Tumor x Oncogenes:
- p53: corrige danos na células ou induz a apoptose. Mdm2 leva a degradação de p53 e caso haja sua duplicação, pode levar ao câncer. O p19ARF controla a ação de mdm2.
- Ras (GTP) : ativo -> Propicia a proliferação, diferenciação e sobrevivência celular e sua mutação pode levar ao câncer. 
- myc: Em mutação, o gene do myc passa a ser transcrito junto do gene de linfócitos B e acaba levando a formação de linfoma.
Redundância celular: Para ocorrer o câncer, tem que haver diversos erros, já que há diversos mecanismos de correção para tentar impedí-lo.
Passos pra oncogênese:
Aumento proliferativo
Invasão da lâmina basal
Entrada nos vasos
Aderência a parede dos vasos
Saída dos vasos
Colonização do novo tecido
Diferenciação Celular no Sistema Hematopoético
Conceitos:
Histológicos: 
- Homotópico: Em um transplante, as células tem o mesmo destino de sua origem.
- Heterotópico: Em um transplante, as células tem destino diferente de sua origem.
Imunológicos:
- Autólogo: Doador/Receptor são a mesma pessoa.
- Singênico: Doador/Receptor possuem a mesma característica gênica (gêmeos univitelinos).
- Alogênico: Transplante entre indivíduos da mesma espécie.
- Xenogênico: Transplante entre indivíduos de espécies diferentes.
Ecologia:
- Nicho
- Dinâmica de população
Genética:
- Genótipo
- Fenótipo
Divisão Assimétrica
Maturação: 
- Comprometimento: As informações no DNA são voltadas pra diferenciação de determinado tecido.
- Determinação: A célula virará algum tipo de cél. específica, porém sem comprometer com a gama de opções que ela pode ainda virar (ex: Linfócito B).
- Especificação: A célula vira um tipo específico da gama antes existente (ex: Linfócito B1).
Senescência
Reposição/Reparo
Regeneração
Organização: 
Órgãos Linfóides:
Primários: gerencia a formação das células hematopoéticas (medula e timo).
Secundários: órgãos auxiliares na manutenção das células
Só formam após o nascimento: linfonodo, baço, fígado e apêndice
Terciários: órgãos onde as células vão agir. 
Células: 
Linfóides: Específicas. Gerada por vacina.
Mielóides: Células imune natas. Não específicas. Tem afinidade por um padrão de antígeno generalizado, ex: bacteriano, fúngico e viral.
Elementos figurados: Proteínas do soro -> Sist. Completo, Imunoglobulinas.
COMO OCORRE:
A hematopoiese acontece no interior dos ossos, junto dos vasos sanguíneos, formando microambientes bem diversificados. Para promover a formação das células diferenciadas, fatores específicos atuam nelas, em diferentes nichos da medula e, no caso dos linfócitos T, sua parte final de maturação ocorre no timo.
~> Diferenciação das células no desenvolvimento embrionário:
Primeiramente, são formadas no saco vitelínico -> Fígado fetal/timo --- depois do nascimento------ Medula óssea/baço.
Recirculação e endereçamento: 
Células circulando no sangue se ligam a células/matrizes específicas que indicam a direção para onde devem migrar (ligação com receptores). Os sistemas sanguíneo e linfoide são essenciais para isso, visto que servem como ponte para os locais onde são necessárias (especialmente o linfoide).
Células tronco hematopoéticas estão intimamente ligadas com o MEC da medula. Elas geralmente ficam perto do osso (nicho endostial), por causa dos fatores presentes nos osteoblastos que as mantem pluri/multipotentes. No centro da medula há fatores necessários para ocorrer há diferenciação (há muitos vasos). 
O gradiente de concentração dos fatores nos diferentes nichos influencia muito na diferenciação das células.
Ex: Linfócitos T começam sua diferenciação na medula. Depois elas migram pro timo, onde terminam de maturar e sofrem diferenciação em tipos específicos (linfócitos T citotóxicos; auxiliadores; etc).