CITO- Aula 1 - Métodos de Estudo em Biologia Celular

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Profa Dra Jaqueline Dias Oliveira
Medicina 2013-1
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Material biológico examinado por transparência  luz atravessa os tecidos  imagens
Confecção de cortes para microscópios óptico e eletrônico:
 Fixação dos tecidos  Inclusão  Cortes  Coloração  Montagem Lâminas (Preparados permanentes)
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Fixação:
Endurecer as células
Evitar autólise
Impedir atividade e proliferação de bactérias
Aumentar afinidade de estruturas celulares pelos corantes
Formol: estabiliza a estrutura quaternária das proteínas
Tetróxido de ósmio e glutaraldeído  coagulam as proteínas  ME
Misturas fixadoras
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Formol. Grupo aldeídico único (representado à esquerda por ponto negro). Não fixa o microtúbulo.
Glutaraldeído. Molécula em bastão com dois grupos aldeídicos. Fixa o microtúbulo.
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Microtomia
Cortes em finas espessuras
Inclusão de tecidos em parafina ou resinas  espessura de 1 a 6 µm (MO) e 0,02 a 0,1 µm (ME)
Navalhas de aço, vidro ou diamante
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Coloração
Organelas transparentes e incolores
Corantes se comportam como base (catiônicos) ou ácido (aniônicos)  moléculas basófilas ou acidófilas
Azul de toluidina, azul de metileno e hematoxilina (corantes básicos)  DNA e RNA
Eosina, orange-G e fucsina ácida (corantes ácidos)  ptns citoplasmáticas
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Montagem das lâminas
O corte é desidratado em concentrações crescentes de álcool  aumentar a sobrevida do preparado histológico
 Aplica-se meio de montagem sobre o corte e cobre-se com a lamínula
Após algumas horas, a lamínula estará firmemente aderida à lâmina de vidro, pela estabilização do meio de montagem. 
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Parte mecânica: suporte
Base, Braço, Tubos oculares, Revolver, Platina, Charriot, Parafuso Macrométrico, Parafuso Micrométrico
Parte óptica
Sistema de Iluminação: 
Fonte luminosa, Diafragma, Condensador
Sistema de Ampliação: 
Objetivas e Oculares
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Ductos coletores de urina dos rins – coloração HE
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Ampliação total = aumento da objetiva X aumento da ocular
Poder de resolução = capacidade de separar detalhes
Limite de resolução – menor distância entre dois pontos 
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Poder/limite de resolução 
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Escala entre células vivas e átomos
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Microscópio de Polarização
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Microscópio de Polarização
Feixe luminoso se divide em dois ao passar por estruturas cristalinas ou moléculas alongadas e paralelas (birrefringentes ou anisotrópicas)
Detecta presença cristais, corpos estranhos ou proteínas fibrilares anômalas.
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Microscópio de Contraste de Fase
Estudo de células vivas em cultivo
crescimento 
divisão mitótica
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Fase negativa - clara 
Fase positiva - escura 
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Microscópio Confocal
 Estágio de gástrula de embrião de Drosophila corado com sonda fluorescente para filamentos de actina. 
  Grãos de Pólen
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 Microscópio Eletrônico de Transmissão (MET)
 Microscópio Eletrônico de Varredura (MEV)
 Alto poder resolutivo  ultra-estruturas biológicas
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Microscópio Eletrônico de Transmissão
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Feixes de elétrons acelerados por diferença de potencial de 60 a 100 mil volts
 Aquecimento de filamento de tungstênio (cátodo)
 Trajeto de elétrons no vácuo  desvios ao atravessar objetos  projeção sobre uma tela fluorescente ou filme fotográfico
Microscópio eletrônico de Transmissão
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Material biológico para MET  ultramicrótomos com fio da navalha de vidro ou de diamante
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Microscópio Eletrônico de Varredura 
Exame da superfície das estruturas
Feixe de elétrons percorre o espécime ponto por ponto (varredura)
Os espécimes não cortados
Objetos de 1 cm ou mais podem ser examinados inteiros
Material após fixação é recoberto por delgada camada condutora de eletricidade (ouro ou platina)
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Estereocílios do ouvido interno de rã-gigante. 
A- MEV; 
B- Microscópio de interferência e C- MET
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Vorticella oceanica: microorganismo muito comum em águas costeiras presos sobre a superfície de algas.
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Detalhe de formiga - Hylomyrma 
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 Identificação e localização das moléculas 
 Preparações examinadas em MO e ME
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DNA  se cora em vermelho (Reação de Feulgen)
RNA – 2 lâminas  1 tratada com ribonuclease  cora-se as 2 com azul de toluidina
Proteínas – identificação de aminoácidos
 Tirosina
 Triptofano
 Arginina
Polissacarídeos – glicogênio  2 lâminas  1 tratada com alfa-amilase  cora-se as lâminas
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Enzimas – cortes de tecidos não fixados  congelados
Determinação do local onde se processa a reação enzimática
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 Localização precisa de proteínas específicas
 Reação antígeno-anticorpo
 Imunocitoquímica direta
Pouco sensível e pouco usada
 Imunocitoquímica indireta
Mais sensível e mais utilizada
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Imunocitoquímica direta
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Imunocitoquímica Indireta
Maior sensibilidade e mais usada
Utilização de um anti-anticorpo marcado
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Células epiteliais cultivadas. A – eletromicrografia e B – imunocitoquímica indireta com anticorpos anti-tubulinas
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Centrifugação fracionada ou diferencial
Frações de organelas
Tamanho, forma e densidade da partícula 
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Cultura de Tecidos animais e vegetais
Meios de cultura: aminoácidos, glicídeos, sais minerais, vitaminas e fatores de crescimentos
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Cultura de célula animal
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		“O homem é o produto da sua vontade. Então, antes de mais nada,
ele será resultado de seu próprio progresso”.
Jean-Paul Sartre