Manual de Práticas de Hematologia

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UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA 
FACULDADE DE FARMÁCIA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Roteiros do Laboratório 
de Hematologia Clínica 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Versão – Outubro 2008 
Índice 
 
 
Preparo do material de coleta............................................................................................. 03 
Coleta de sangue capilar.................................................................................................... 05 
Coleta de sangue venoso................................................................................................... 06 
Confecção de lâminas........................................................................................................ 07 
Coloração de esfregaços.................................................................................................... 08 
Hematócrito......................................................................................................................... 10 
Contagem de eritrócitos...................................................................................................... 11 
Contagem de leucócitos..................................................................................................... 14 
Coloração de reticulócitos................................................................................................... 15 
Contagem de reticulócitos.................................................................................................. 16 
Contagem de plaquetas...................................................................................................... 17 
Dosagem de hemoglobina.................................................................................................. 19 
Velocidade de hemossedimentação – VHS........................................................................ 20 
Teste de falcização............................................................................................................. 22 
Determinação do tempo de protombina – técnica manual................................................. 23 
Determinação do tempo de protombina – técnica semi-automatizada............................... 24 
Determinação do tempo de tromboplastina parcial ativada – técnica semi-automatizada 26 
Tempo de coagulação (TC)................................................................................................ 27 
Tempo de sangramento (TS).............................................................................................. 28 
Prova do laço (Resistência capilar).................................................................................... 29 
Retração do coágulo........................................................................................................... 30 
Determinação do grupo sanguíneo (ABO) e fator Rh......................................................... 31 
Determinação de fator Du................................................................................................... 31 
Fragilidade osmótica (Resistência globular)....................................................................... 32 
Teste de HAM..................................................................................................................... 34 
Teste de sacarose.............................................................................................................. 35 
Coombs direto..................................................................................................................... 36 
Coombs indireto.................................................................................................................. 37 
Demonstração de células “LE”............................................................................................ 40 
 
 
 
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PREPARO DO MATERIAL DE COLETA 
 
 
A) TUBOS DE COLETA: 
 
1. Deverão estar bem limpos antes de receber a solução anticoagulante (EDTA). 
2. A proporção de anticoagulante é de 50 µL (1 gota) para 5 mL de sangue total, preparado 
na proporção de 10%. 
3. Os tubos devem ser rotulados antes de irem para a sala de coleta, convenientemente 
fechados com tampas. 
4. A quantidade de sangue não precisa ser exata e sim aproximada. A homogeneização 
deve ser imediata. 
 
B) LÂMINAS – ESFREGAÇOS: 
 
1. Deverão estar rigorosamente desengorduradas, sem corrosão ou mofo e secas. 
2. Uma ou duas lâminas novas, de preferência laminadas, com bordos íntegros e marcados 
com uma fita adesiva para fazer os esfregaços. 
3. Após a confecção dos esfregaços, secá-los imediatamente e colocar o nome do paciente 
com lápis no extremo oposto á franja. 
 
C) TUBOS DE HEMÓLISE: 
 
Devem estar quimicamente limpos. Para os testes de coagulação, além da limpeza 
rigorosa, a falta de arranhões deve ser observada. Evitar restos de sabões ou detergentes. 
 
D) AGULHAS: 
 
As agulhas devem ser descartáveis, 25/8 ou 30/9. 
 
E) PUNÇÃO DIGITAL: 
 
Para a coleta de punção digital, usar lancetas descartáveis. 
 
 
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F) PAPEL FILTRO: 
 
O papel de filtro usado para o tempo de sangramento deverá estar dividido em pequenas 
tiras e guardados em caixa limpa com tampa ou placa de PETRI. 
 
G) ALGODÃO: 
 
O algodão para a coleta deverá estar cortado em pequenos pedaços em vasilhame próprio 
com tampa. 
 
H) ANTISSEPSIA: 
 
Deverá ser feita com algodão embebido em álcool a 70o ou álcool iodado. 
 
I) GARROTE: 
 
O garrote deverá estar limpo (lavado) após cada coleta diária. A laçada é a última coisa a 
ser feita antes da coleta. Retirar o garrote antes de retirar a agulha. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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COLETA DE SANGUE CAPILAR 
 
 
1. O sangue capilar pode ser utilizado para a preparação de esfregaços e também em alguns 
casos para a obtenção de pequena quantidade de sangue destinada à execução de exames 
isolados como contagem de glóbulos ou hematócrito ou ainda dosagem de hemoglobina. 
2. O sangue capilar é obtido da face lateral da polpa digital, do lóbulo da orelha ou ainda, 
em recém-nascidos, do calcanhar. 
3. A região não deve apresentar cianose ou edema. 
4. Feita a assepsia da região, friccioná-la superficialmente evitando o traumatismo intenso. 
Puncionar com lanceta descartável. Enxugar a primeira gota, utilizando as seguintes para 
a confecção de esfregaços ou para as dosagens. 
5. É necessário que o sangue flua facilmente qualquer que seja a região escolhida. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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COLETA DE SANGUE VENOSO 
 
 
1. O paciente deve estar bem acomodado e psiquicamente preparado. 
2. O material a ser utilizado deve ser limpo (esterilizado), e se possível descartável. 
3. A escolha do local para a punção deve ser feita em função da quantidade necessária, do 
material a ser utilizado e do calibre do vaso a ser puncionado. 
4. Colocar o garrote de tal maneira que possa ser solto facilmente e aperte o suficiente para 
bloquear o retorno venoso sem bloquear o fluxo arterial. A estase prolongada altera o 
material colhido provocando hemoconcentração. 
5. Realizar a assepsia da região e puncionar com o bisel da agulha voltado para cima 
procurando fazer a penetração com golpe seco, evitando movimentos de rotação ou 
lateral da agulha para não dilacerar tecidos. A penetração da agulha traumatizando em 
excesso ostecidos possibilita a aspiração de suco tissular junto ao sangue facilitando a 
sua coagulação, mesmo que parcial. 
6. Manter a seringa imóvel e aspirar lentamente o sangue sem provocar espuma. A espuma 
formada durante a coleta ou durante a colocação no tubo provoca hemólise e agregação 
das plaquetas, alterando a sua concentração no sangue colhido. 
7. O garrote deve ser solto logo após a punção, mas sempre antes do término da coleta. 
8. Após a retirada da agulha, comprimir a região com algodão durante alguns minutos. 
9. Antes da distribuição do sangue em frascos ou tubos, colocar gotas em lâminas 
destinadas à confecção dos esfregaços. As gotas são colocadas com a seringa, com 
auxilio da agulha. 
10. O material deve ser transferido imediatamente da seringa para o frasco contendo 
anticoagulante sem agulha e deixando correr suavemente o sangue pela parede do frasco, 
evitando sempre a formação de espuma. Em seguida, distribuir o restante de sangue para 
os demais frascos, se forem requisitados. Todos os frascos e tubos devem estar 
previamente identificados com as iniciais e número de registro do paciente. 
 
 
 
 
 
 
 
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CONFECÇÃO DE LÂMINAS 
 
 
TÉCNICA: 
 
1. Após a punção, desprezar as primeiras gotas e colocar uma pequena gota na extremidade 
da lâmina. 
2. Tocar o rebordo de uma lâmina de bordo íntegro, de preferência lapidada, na gota de 
sangue, formando um ângulo de 45o, deixando o sangue se espalhar por capilaridade. 
3. Impelir a lâmina, guardando sempre o mesmo ângulo, da direita para a esquerda com um 
movimento firme e uniforme sem separar uma lâmina da outra. Forma-se então uma 
delgada camada de sangue. Secar. Identificar a lâmina. 
 
OBSERVAÇÃO: 
a) O esfregaço deve ser feito rapidamente para se evitar a formação de coágulos. 
b) A rapidez do deslizamento: quanto mais lento, mais fino. 
c) Variação do ângulo: quanto menor, mais fino. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Técnicas para confecção de lâminas. 
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COLORAÇÃO DE ESFREGAÇOS 
 
 
COLORAÇÃO: 
 
Corante: WRIGHT 
 
Wright pó............................................. 2,4 g 
Álcool metílico……………………… 1000 mL 
 
1. As lâminas devem estar perfeitamente secas, quando forem coradas. 
2. Quando guardadas, devem ficar em lugar seco e arejado e distante de emanações 
químicas. 
3. A maioria dos corantes são alcoólicos servindo como fixadores, não havendo 
necessidade de fixação prévia. 
4. Após decorrido o tempo inicial de fixação, o corante é diluído com água destilada 
colocada sobre a lâmina. O sopro é desaconselhável por provocar em excesso de 
evaporação do metanol com a conseqüente precipitação do corante. 
 
TÉCNICA: 
 
1. Cobrir o esfregaço com corante por 2 a 3 minutos (observar o tempo do corante). Fase de 
fixação. 
2. Colocar o mesmo volume de água destilada, gotejando sobre a lâmina sem derramar. 
Marcar de 8 a 9 minutos. Fase de coloração. 
3. Lavar com água corrente. 
4. Limpar o fundo da lâmina e deixar secar 
5. Observar ao microscópio. 
 
 
 
 
 
 
 
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CARACTERÍSTICAS DA BOA COLORAÇÃO: 
 
1. Para a contagem especifica ou diferencial dos leucócitos, é necessário se obter resultados 
reprodutíveis, que os esfregaços estejam tecnicamente perfeitos e que a coloração seja 
nítida. 
2. O esfregaço não deve ser excessivamente fino e a franja deve ser homogênea, 
proporcionando uma área ampla entre o corpo e a franja 
3. Normalmente na área do corpo da lâmina encontramos uma concentração maior de 
linfócitos e nas bordas e na franja mais neutrófilos e monócitos. Em lâminas finas 
realizadas com lâminas de bordos irregulares, aumenta o acúmulo de neutrófilos e 
monócitos na periferia. 
4. A contagem deverá ser feita na área entre o corpo e a franja, onde existem ligeiro 
empilhamento das hemácias, seguindo um curso em zigue-zague (preferencialmente 
vertical) sempre orientando em função das hemácias devendo-se evitar áreas onde as 
hemácias estiverem empilhadas ou completamente isoladas. 
5. Deve ser feito obrigatoriamente uma inspeção em toda a lâmina para uma apreciação das 
condições técnicas do esfregaço, evidenciando os elementos anômalos, estimativa do 
número global de leucócitos e localização de eosinófilos ou basófilos que por seu baixo 
número podem faltar na contagem das células. 
6. Recomenda-se a contagem de 200 células, lembrando que um aumento da amostra 
contada a tornará mais significante. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Leitura do esfregaço 
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HEMATÓCRITO 
 
 
TÉCNICA MACRO: 
 
• Homogeneizar o sangue e encher o tubo de Wintrobe até a marca 00 com uma pipeta 
capilar. Centrifugar a 3.000 rpm durante 30 minutos. Fazer a leitura. 
 
 
TÉCNICA MICRO: 
 
• Homogeneizar o sangue e encher o tubo capilar, vedar com cera ou em chama. 
Centrifugar na microcentrifuga por 5 minutos. Fazer a leitura com o auxílio do cartão de 
leitura. 
 
 
VALORES DE REFERÊNCIA: 
 
• HOMEM: 45 a 50% 
• MULHER: 40 a 45% 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Microcentrifuga – detalhe. 
Leitura do hematócrito. Tubo capilar 
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CONTAGEM DE ERITRÓCITOS 
 
 
Consiste numa diluição precisa do sangue (com anticoagulante) que é colocada numa 
câmara de contagem de volume determinado e contado através do microscópio. 
 
MATERIAL: 
 
1. Pipeta automática 
2. Câmara de contagem do tipo Neubauer 
3. Microscópio ótico comum 
 
DILUENTE: 
 
 Reagente de GOWER 
 
Sulfato de sódio anidro........................ 62,5 g 
Ác. Acético glacial………………….. 166,5 mL 
Água destilada qsp............................... 1000 mL 
 
TÉCNICA: 
 
1. Em um tubo longo, adicionar 4 mL de líquido diluidor (GOWER). 
2. Adicionar 20 µL de sangue (bem homogeneizado), com pipeta automática, ao tubo 
contendo o líquido diluidor. 
3. Ter atenção na homogeneização, ajuste e limpeza da pipeta. 
4. Encher a câmara por capilaridade, deixando-a repousar durante 3 a 5 minutos para a 
sedimentação. 
5. Colocar no microscópio e realizar a contagem de pelo menos 1/5 de mm2 (80 
quadradinhos) da área central da câmara de Neubauer e multiplicar por 10.000 e será 
obtido o número de hemácias. 
 
CÁLCULO: 
 
 Número de hemácias / mm3 = n x 5 x v x d 
 
 v = altura da câmara 
d = diluição 
n = No de hemácias encontradas na contagem 
5 = área contada: 1/5 mm2 
Câmara de Neubauer 
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CAUSAS DE ERRO: 
 
1. Devido à coleta – sangue capilar: 
 
• Excesso de pressão local (fluxo espontâneo). 
• Massagem excessiva. 
• Edema e cianose. 
 
 
2. Devido à coleta – sangue venoso: 
 
• Estase prolongada devido ao garrote. 
• Edema, cianose. 
• Aglutinação das células ou pequeno coágulo devido á demora na mistura com o 
anticoagulante. 
• Mistura inadequada da amostra sanguínea. 
• Hemólise devido a trauma na agitação. 
 
 
 
Retículo da câmara de Neubauer. 
Sistematização da contagem de 
células. 
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3.Erro técnico: 
 
• Falta de limpeza do material (pipeta e câmara). 
• Aglutinação das células, na diluição. 
• Diluição mal feita. 
• Falha por não limpar a ponta da pipeta. 
• Partículas em suspensão no líquido diluidor. 
• Homogeneização mal feita da diluição na hora do enchimento da câmara. 
• Enchimento incorreto da câmara. 
• Evaporação do líquido da câmara. 
• Colocação incorreta da lamínula, mudando a profundidade da câmara. 
• Erro na contagem. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
4. Erro do equipamento: 
 
• Pipeta 
• Lamínula 
• Câmara de contagem 
 
Distribuição de células sobre o retículo. 
Enchimento da câmara de Neubauer. 
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CONTAGEM DE LEUCÓCITOS 
 
 
Consiste numa diluição precisa do sangue (com anticoagulante) em um diluente, que destrói 
as hemácias, sendo depois colocada na câmara de contagem de volume determinado e contado 
através de microscópio ótico. 
 
MATERIAL: 
 
1. Pipeta automática 
2. Câmara de contagem do tipo Neubauer 
3. Microscópio ótico comum 
 
DILUENTE: 
 
 Reagente de TURK 
 
Violeta de genciana 1%....................... gotas 
Ác. Acético glacial………………….. 1,0 mL 
Água destilada qsp............................... 100 mL 
 
TÉCNICA: 
 
1. Em um tubo longo, pipetar 0,4 mL de líquido diluidor (TURK). 
2. Adicionar 20 µL de sangue, com pipeta automática, ao tubo contendo o líquido diluidor. 
3. Ter atenção na homogeneização, ajuste e limpeza da pipeta. 
4. Encher a câmara por capilaridade, deixando-a repousar durante 3 a 5 minutos para a 
sedimentação. 
5. Colocar no microscópio e realizar a contagem em 4 mm2 (área lateral) da câmara e o 
resultado multiplicado por 50, fornecerá o número de leucócitos por mm3. 
 
CÁLCULO: 
 
 Número de leucócitos / mm3 = n x 1/4 x v x d 
 
 
 
v = altura da câmara 
d = diluição 
n = No de leucócitos encontradas na contagem 
1/4 = área contada: 4 mm2 
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COLORAÇÃO DE RETICULÓCITOS 
 
 
COLORAÇÃO SUPRAVITAL: Consiste na coloração de células, após a morte somática e 
antes da ocorrência da morte celular, ou seja, depois de removidas do organismo vivo, mas antes de 
cessarem as atividades celulares. 
Os reticulócitos são eritrócitos jovens (intermediários entre eritrócitos nucleados e os não 
nucleados), cuja estrutura reticulofilamentosa, remanescente do ácido ribonucléico, só é revelada 
pela coloração supravital. 
O corante mais usado é o azul-de-cresil brilhante, usado em soluções diversas nas numerosas 
variações técnicas. Ultimamente, vem-se utilizando o novo azul-de-metileno N, com a mesma 
finalidade. 
Com esses métodos, a substância reticulofilamentosa dos reticulócitos cora-se de azul ou 
vermelho-violáceo. 
 
CORANTES: 
 
1. Solução de azul-de-cresil brilhante 
 
Azul-de-cresil brilhante....................... 1,0 g 
Citrato de sódio.................................... 0,4 g 
Salina 0,85%........................................ 100 mL 
 Obs.: Em lugar do azul-de-cresil brilhante, pode ser usado o novo azul-de-metileno N. 
 
2. Solução alcoólica de azul-de-cresil brilhante 
 
Azul-de-cresil brilhante....................... 1,0 g 
Álcool a 96 graus q.s.p........................ 100 mL 
 
TÉCNICA - Corante salino: 
 
1. Colocar partes iguais de corante e sangue em tubos de ensaio (gotas). 
2. Agitar e colocar em banho-maria á 37o C por 15 minutos 
3. Agitar e retirar uma gota para fazer os esfregaços. 
4. Aguardar a secagem. Contra corar ou não. Se quiser que a preparação demore mais de 24 
horas, sempre contra corar. 
 
 
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CONTAGEM DE RETICULÓCITOS 
(Método indireto) 
 
1. Levar a lâmina ao microscópio na objetiva de imersão 
2. Contar o número de eritrócitos do 1° quadrante do campo 
3. Multiplicar o número de eritrócitos por 4 
4. Contar o número de reticulócitos em todo o campo 
5. Mudar aleatoriamente de campo 
6. Contar vários campos até que obtenha 1.000 eritrócitos e anotar o no de reticulócitos 
encontrados nestes campos. 
 
CÁLCULOS: 
 
• Percentual: 100 x no de reticulócitos contados 
 1000 
 
 
 
• Contagem de Reticulócitos corrigida: % Reticulócitos X HT paciente 
 HT normal 
 
OBSERVAÇÃO: Considerar HT normal 45% (Homem) e 40% (Mulher) 
 
 
 
• Índice de produção de Reticulócitos – IPR : Contagem de Reticulócitos corrigida 
 Tempo de maturação em dias 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Reticulócitos 
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CONTAGEM DE PLAQUETAS 
(Método de Fônio) 
 
 
Os métodos para contagem de plaquetas dividem-se em diretos e indiretos: 
 
1. DIRETOS: Empregam-se o hemotímetro, contando-se as plaquetas diretamente na 
câmara de contagem. 
2. INDIRETO: Consiste em verificar a proporção entre plaquetas e os eritrócitos em um 
esfregaço de sangue corado e relacionar estes dados com o número de eritrócitos / 
mm3 de sangue. 
 
Entre os métodos indiretos o mais usado é o de Fônio, devido a sua simplicidade e exatidão 
para as necessidade clínicas habituais. O número aproximado de plaquetas pode ser avaliado pelo 
exame do esfregaço corado, embora seja sujeito a erros permitindo revelar se estes elementos se 
acham em um número normal, aumentado ou diminuído. 
Os esfregaços são feitos normalmente, de maneira imediata, com a finalidade de se evitar 
agregação plaquetária. Pode-se usar uma solução de sulfato de magnésio á 14% (que evita a 
agregação plaquetária). 
 
 
TÉCNICA: 
 
1. Corar os esfregaços normalmente, deixar secar e examinar com objetiva de imersão. As 
plaquetas devem apresentar-se isoladas e mais uniformemente distribuídas. 
2. Contar 1.000 eritrócitos em vários campos de esfregaço, anotando o número de plaquetas 
encontradas nos diferentes campos. 
 
 
CÁLCULO: 
 
 
 X = (No de plaquetas encontradas x No de eritrócitos encontrado) / 1.000 
 
 
 X = No de plaquetas por mm3 de sangue 
 
 
 
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OBSERVAÇÕES FEITAS EM RELAÇÃO AO ESFREGAÇO: 
 
1. Avaliar de modo aproximado o número de plaquetas. 
2. A capacidade de auto-aglutinação. A presença de plaquetas inteiramente livres é 
indicativa de uma perturbação de agregação plaquetária, como na Doença de 
Glanzmann. 
3. Coloração das plaquetas: as plaquetas devem exibir uma porção central mais corada, o 
cronômetro. Plaquetas pálidas, quase invisíveis são observadas em condições 
trombocitopáticas familiares. 
4. Volume plaquetário: plaquetas volumosas surgem es estados de solicitação excessiva, 
com nas hemorragias e principalmente em condições mieloproliferativas, especialmente 
na metaplasia mielóide agnogênica e na trombocitopenia hemorrágica. Nestas condições 
é freqüente a observação de fragmento de megacariócitos em circulação. Nos indivíduos 
esplenectomizados os aspectos patológicos plaquetários tornam-se ainda mais nítidos 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Plaquetas 
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DOSAGEM DE HEMOGLOBINA 
 
 
MÉTODO DA CIANOMETAHEMOGLOBINA• PRINCÍPIO: Consiste este método em adicionar sangue total a uma solução contendo 
ferricianeto de potássio (Reativo de Drabkin). O ferricianeto transforma o ferro da 
hemoglobina de estado ferroso (bivalente) ao estado férrico (trivalente), formando 
metahemoglobina, que por sua vez, combina com o cianeto de potássio, para produzir 
um pigmento estável, a cianometahemoglobina. A intensidade da cor é medida 
espectrofotometricamente. 
 
DILUENTE: 
 
 Reativo de DRABKIN 
 
Bicarbonato de sódio........................... 1,0 g 
Cianureto de potássio........................... 0,05 g 
Ferricianeto de potássio....................... 0,2 g 
Água destilada qsp............................... 1000 mL 
 
TÉCNICA: 
 
1. Colocar em tubo de ensaio 5 mL do reativo de DRABKIN. 
2. Colocar 20 µL de sangue total, devidamente homogeneizado, lavando a pipeta com o 
próprio reativo. 
3. Homogeneizar, deixar em repouso por 3 a 5 minutos e ler contra o tubo branco de água 
destilada, em 540 ηm ou filtro verde. 
4. Multiplicar a densidade ótica pelo fator = conc. de Hb na amostra (Hb g / 100mL) 
 
DETERMINAÇÃO DO FATOR: 
 
 F = concentração do padrão de Hb / Média da D. O. do padrão. 
 
 
 Obs.: O padrão de hemoglobina deve ter uma concentração conhecida. 
A média da densidade ótica do padrão é obtida realizando-se pelo menos 3 dosagens 
consecutivas pelo método da cianometahemoglobina, usando o padrão no lugar do 
sangue. 
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VELOCIDADE DE HEMOSSEDIMENTAÇÃO – VHS 
 
 
Contribui para o diagnóstico dos processos infecciosos – especialmente as artropatias 
reumáticas e a tuberculose – por auxiliar na verificação da atividade e evolução dessas afecções e 
ser um elemento de importância na avaliação do prognóstico e do sucesso terapêutico. 
 
PRINCÍPIO: 
 
- Consiste em avaliar, ou seja, medir a velocidade de separação entre os glóbulos 
vermelhos e o plasma, no sangue com anticoagulante. 
- A objeção mais séria a tal método, prende-se ao anticoagulante empregado: o citrato de 
sódio que, especialmente em solução, provoca apreciável retardamento na velocidade de 
eritrossedimentação. Essa causa de erro poderia ser afastada substituindo-se o citrato de 
sódio pela mistura de oxalato de Paul-Heller. A heparina acelera. 
- O tempo de sedimentação é fixo e a distância é variável (velocidade de sedimentação). 
 
MÉTODOS MAIS USADOS: 
 
- Westergueen 
- Wintrobe 
 
VALORES DE REFERÊNCIA: 
 
- Após 1 hora: 
HOMEM: 3 a 5 mm 
MULHER: 4 a 7 mm 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
- Após 2 horas: 
HOMEM: 7 a 15 mm 
MULHER: 12 a 17 mm 
 
Tubo de Wintrobe VHS 
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VARIAÇÕES FISIOLÓGICAS: 
 
- Ligeira aceleração: nas crianças; nas mulheres; depois da puberdade (devido ao aumento 
do fibrinogênio plasmático, período menstrual, na gravidez), climas quentes é mais 
rápida que nos climas frios. 
 
 
VARIAÇÕES PATOLÓGICAS: 
 
- Acelerada: Estados patológicos acompanhados de uma inflamação ou destruição dos 
tecidos, variando a intensidade da aceleração de acordo com a natureza, o grau e a 
extensão do processo em atividade. Ocorre portanto, em todos os processos infecciosos 
agudos ou crônicos generalizados ou localizados, nas doenças colagênicas após 
ferimentos, fraturas, operações, irradiações, intoxicações. 
 
CAUSAS QUE INFLUEM NA ACELERAÇÃO: 
 
a) Número menor de eritrócitos; 
b) Tamanho dos eritrócitos: maior, mais acelerada; 
c) Teor de hemoglobima: maior, mais acelerada; 
d) Aumento no plasma das frações protéicas (fibrinogênio, globulina, albumina); 
e) Teoria elétrica: carga negativa dos eritrócitos produzem repulsão entre eles e 
contrabalaçam com as cargas positivas dos elementos plasmáticos. Uma diminuição das 
cargas negativas produz aceleração da sedimentação. 
f) Maior viscosidade – menor aceleração; 
g) Aglutinação (rouleaux) – maior aceleração; 
h) Aglomeração de eritrócitos; 
i) Estado coloidal do plasma; 
j) Maior quantidade de sais diminui a eritrossedimentação ou vice-versa; 
k) Gases do sangue modificam a eritrossedimentação: CO2 aumentado retarda a 
sedimentação; 
l) Concentração hidrogeniônica; 
m) Conteúdo de colesterol; 
n) Número de leucócitos; 
o) Número de plaquetas; 
p) Metabolismo basal. 
 
 
 
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22 
TESTE DE FALCIZAÇÃO 
 
MATERIAL: 
 
1. Pipeta graduada de 5,0 mL 
2. Lâmina e lamínula 
3. Solução de metabissulfito de sódio 
4. Vaselina sólida 
5. Microscópio ótico comum 
 
DILUENTE: 
 
 Solução de Metabissulfito de sódio (PREPARAR NO MOMENTO DO USO): 
 
Metabissulfito de sódio........................ 0,05 g 
Água destilada..................................... 2,5 mL 
 
TÉCNICA: 
 
1. Colocar 1 gota de sangue sobre a lâmina e adicionar 1 gota da solução de metabissulfito 
de sódio. 
2. Misturar com o canto da lamínula cobrindo com ela a preparação (Evitar a formação de 
bolhas, pois compromete a formação do meio redutor, necessário para o teste). 
3. Vedar os cantos da lamínula com a vaselina sólida (Não é recomendado vedar com 
esmalte, pois os solventes podem interferir no teste). 
4. Deixar repousar e realizar a primeira leitura após 2 horas. 
5. Examinar ao microscópio em objetiva de 10x. 
6. Realizar a segunda leitura após 24 horas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Teste de falcização positivo Teste de falcização negativo 
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23 
DETERMINAÇÃO DO TEMPO DE PROTOMBINA 
(Técnica manual) 
 
 
É a prova de escolha para a investigação do sistema extrínseco da coagulação sanguínea, 
permitindo revelar deficiências dos fatores que tomam parte neste sistema. O extrato de tecido 
(tromboplastina extrínseca), ao lado dos fatores VII, V, IX, na presença dos íons cálcio, age sobre a 
protombina para formar a trombina, que, por sua vez, conduz à formação do coágulo de fibrina. 
A prova é insensível ao fator IX (que é um dos fatores do grupo da protombina dependente 
da vitamina K) e os fatores que tomam parte na formação da tromboplastina intrínseca. 
Como o fator V é instável no plasma oxalatado, recomenda-se usar como anticoagulante o 
citrato de sódio. No qual este é relativamente estável. 
 
 
TÉCNICA: 
 
1. Colher por punção venosa 3,0 mL de sangue do paciente e colocar em um tubo de 
centrifuga já contendo 0,3 mL de citrato de sódio 0,1 M. Misturar bem. Obs.: Dê 
preferência a tubo de plástico. 
2. Centrifugar o tubo a 2.000rpm, durante 10 minutos, para separar o plasma. 
3. Colocar o tubo no banho-maria a 37o – 4 tubos – 2 para o plasma citratado do paciente e 
2 para o plasma citratado normal. 
4. Colocar 0,1 mL do plasma citratado do paciente em cada um dos 2 primeiros tubos e 0,1 
mL do plasma normal nos outros dois. 
5. Acrescentar 0,1 mL da suspensão de tromboplastina em cada um dos 4 tubos e agitá-los 
bem, para misturar o seu conteúdo. 
6. Deixar os tubos em banho-maria a 37o durante 2 minutos para estabilizar a temperatura 
no seu interior. Não deixar mais de 10 minutos. 
7. Adicionar rapidamente 0,1 mL da solução de clorato de cálcio 0,025 M ao primeiro tubo, 
soprando a pipeta, neste momento, por o cronômetro a funcionar. 
8. Depois de 5 a 10 segundos, retirar o tubo do banho-maria e agitá-lo suavemente, de 2 em 
2 segundos, até o aparecimento do coágulo, parando simultaneamente o cronômetro. 
Anotar o número gasto em segundos. 
9. Repetir a técnica com outros 3 tubos. Tirar a média dosresultados obtidos no plasma do 
paciente e no plasma normal. 
 
 
 
 
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24 
DETERMINAÇÃO DO TEMPO DE PROTOMBINA E 
TROMBOPLASTINA PARCIAL ATIVADA 
(Técnica semi-automatizada) 
 
PRINCIPIO: 
 
 O Thrombotimer é um coagulômetro operado manualmente, baseado no método de medição 
ótico-mecânico. Suas funções são controladas por um microprocessador. 
 Sistema de medição: Uma bilha de metal é colocada em movimento pela circulação de um 
ímã magnético abaixo da estação de leitura. O resultado da mistura da amostra favorece a formação 
de uma rede de fibrina homogênea, quando a coagulação inicia. Este método permite um sinal 
seguro de detecção, mesmo nos casos em que há baixa concentração de fibrinogênio. 
 
EQUIPAMENTO: 
 
� Thrombotimer 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Incubação dos 
reagentes 
Canal de leitura 
Incubação de 
amostras 
Thrombotimer. Thrombotimer – Elementos funcionais. 
Dispensador de bilhas. 
Cubetas – Reagentes (à esquerda) 
e amostras (à direita). 
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25 
TÉCNICA PARA TP (TEMPO DE PROTOMBINA): 
 
1. Na posição reservada ao reagente, colocar o reativo de tromboplastina para aquecer por 
pelo menos 10 minutos antes de iniciar o teste. Somente colocar a quantidade suficiente 
para os teste, pois depois de aquecido, este não poderá ser reutilizado. 
2. Colocar as cubetas de amostra na posição de incubação (até 2 testes). 
3. Acrescentar uma bilha em cada cubeta, com o auxilio do dispensador. 
4. Apertar a tecla TEST até aparecer o teste PT. Esperar parar de piscar o display “Adjust”. 
5. Pipetar 100µL do primeiro plasma na cubeta. 
6. Apertar a cubeta com o plasma – a luz vermelha se acende, iniciando a cronometragem 
do tempo de incubação. 
7. Pipetar, sucessivamente os outros plasmas. 
8. Ao término do tempo, a luz vermelha pisca e apaga, indicando o final da incubação. 
9. Colocar a cubeta na posição de leitura (no centro), apertar e zerar. 
10. Pipetar 200µL da tromboplastina já aquecida na cubeta com o plasma (Pipetar de forma 
firme, sem introduzir a pipeta no orifício além de 10mm). 
11. Apertar repetidamente a tecla TEST para obter os valores de % e INR. 
 
 
PARA O EQUIPAMENTO LIBERAR OS RESULTADOS DA ATIVIDADE E DO INR, 
DEVE-SE ELABORAR A CURVA DE CALIBRAÇÃO. 
 
� Como programar a curva de calibração: 
 
Preparar um pool de plasmas normais de pelo menos 5 doadores entre 20 e 40 anos. Um 
exame preliminar deverá assegurar que os plasmas citratados forneçam valores na faixa 
normal antes da mistura deles. 
 
� Como preparar as diluições do pool de plasmas: 
 
Preparar uma diluição do pool, da seguinte forma: 
Tubo 1 – pool de plasma normal (100,0%) 
Tubo 2 – 0,5mL do tubo 1 + 0,5mL de solução fisiológica (50,0%) 
Tubo 3 – 0,1mL do tubo 1 + 0,2mL de sol. fisiológica (33,3%) 
Tubo 4 – 0,5mL do tubo 2 + 0,5mL de sol. fisiológica (25,0%) 
 
Testar cada uma destas diluições (em duplicata) como se fossem amostras, seguindo os 
itens 1 a 10 do procedimento do teste. Anotar os resultados. 
 
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26 
� Introdução da Curva do TP no equipamento: 
 
Apertar simultaneamente as teclas RESET e TEST (ao mesmo tempo). Aparecerá 
rapidamente no display “CALIBRAT” e em seguida o valor da primeira atividade. Caso 
os valores estejam corretos e você deseja verificá-los, apertar a tecla “TEST”, e o 
equipamento mostrará os valores memorizados. 
Se os valores não estiverem corretos, ou no caso de uma nova calibração onde serão 
introduzidos outros valores, deve-se apertar a tecla “RESET” até que o número que se 
deseja modificar esteja piscando. Apertar então a tecla “TEST” para modificar o número 
até aparecer o número que se deseja introduzir (este vai aumentando de 1 em 1). 
Continuar o processo até introduzir todos os valores de atividade e de segundos. 
Ao final, aparecerá os valores relativos ao tempo de normal (que deve ser igual ao 
100% da curva de calibração) e do ISI (índice característico do lote de tromboplastina 
que varia de 1 a 2 – acompanha o kit) 
Estes valores podem ser utilizados para o lote da tromboplastina a qual foi calibrada, 
devendo ser mudada sempre que houver mudança de lote. Ao final do procedimento, 
aparecerá “SAVEDATA” indicando que os valores foram memorizados no equipamento. 
 
 
TÉCNICA PARA TTPA (TEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL ATIVADA): 
 
1. Na posição reservada ao reagente, colocar o cloreto de cálcio para aquecer por pelo 
menos 10 minutos antes de iniciar o teste. Somente colocar a quantidade suficiente para 
os teste, pois depois de aquecido, este não poderá ser reutilizado. 
2. Colocar as cubetas de amostra na posição de incubação (até 2 testes). 
3. Acrescentar uma bilha em cada cubeta, com o auxilio do dispensador. 
4. Apertar a tecla TEST até aparecer o teste PTT. Esperar parar de piscar o display 
“Adjust”. 
5. Pipetar 100µL dos plasmas na cubeta. 
6. Apertar a cubeta com o plasma – a luz vermelha se acende, iniciando a cronometragem 
do tempo de incubação. Esperar que esta se apague. 
7. Acrescentar 100µL de cefalina ativada (Não utilizar reagentes com ativador Kaolin, 
pois este impede a leitura foto-ótica do equipamento devido à sua intensa turbidez). 
8. Apertar a cubeta novamente – a luz vermelha se acende, iniciando a cronometragem do 
tempo de incubação. Esperar que esta se apague. 
9. Colocar a cubeta na posição de leitura (no centro), apertar e zerar. 
10. Pipetar 100µL do cloreto de cálcio já aquecido na cubeta com o plasma (Pipetar de 
forma firme, sem introduzir a pipeta no orifício além de 10mm). 
11. O equipamento mostrará o resultado em segundos. 
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27 
TEMPO DE COAGULAÇÃO (TC) 
LEE E WHITE 
 
 
TÉCNICA: 
 
1. Colher o sangue por punção venosa com o mínimo de traumatismo local. 
2. Disparar o cronômetro. 
3. Colocar 1 mL de sangue em dois tubos (13x100). 
4. Colocar os tubos em banho-maria à 37o. 
5. Acompanhar a coagulação no 1o tubo inclinando-o minuto a minuto (a partir de cinco 
minutos) até que ocorra a coagulação. Marcar o tempo. 
6. Observar o 2o tubo e marcar o tempo. 
 
VALORES REFERÊNCIA: 
 
05 a 10 minutos. 
 
FATORES QUE ALTETAM O TC: 
 
a) Agitação e manuseio excessivo dos tubos. 
b) Diâmetro do tubo. 
c) Quantidade de sangue. 
d) Espuma. 
e) Coleta demorada. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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28 
TEMPO DE SANGRAMENTO (TS) 
DUKE 
 
 
TÉCNICA: 
 
1. Fazer a assepsia do lóbulo da orelha do paciente. 
2. Fazer uma incisão com lanceta (3mm). 
3. Disparar o cronômetro quando surgir o sangramento. 
4. Coletar de 30 em 30 segundos a gota de sangue formada. 
5. Parar o cronômetro quando cessar o fluxo. 
6. Observar o tempo (TS). 
 
VALORES DE REFERÊNCIA: 
 
 Até 3 minutos. 
 
O TS PODE SE ACHAR AUMENTADO: 
 
a) No de plaquetas inferior a 100.000 / mm3. 
b) Alteração na atividade funcional das plaquetas (Doença de von Willebrand) 
c) Pacientes em uso de ácido acetíl salicílico. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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29 
PROVA DO LAÇO (RESISTÊNCIA CAPILAR) 
RUMPEL – LEEDE 
 
 
TÉCNICA: 
 
1. Verificar se existem petéquias no braço do paciente (marcá-las).2. Colocar manguito do tensiômetro em pressão diastólica, mantendo inflado por cinco 
minutos. 
3. Retirar o manguito. 
4. Observar o aparecimento de petéquias. 
5. Fazer nova observação após 30 minutos (petéquias tardias). 
 
 
VALORES DE REFERÊNCIA: 
 
 Menos de 10, de tamanho inferior a 1 mm. 
 
 
INTERPRETAÇÃO: 
 
 Positivo + : 10 a 50 petéquias de 1 a 2 mm (região cubital). 
 Positivo ++ : mais de 50 petéquias de 2 mm (região cubital, antebraço, dorso da mão). 
 Positivo +++ : mais de 70 petéquias de 2 a 4 mm (idem). 
 Positivo ++++ : incontáveis petéquias de 5 ou mais mm. 
Obs.: Trombocitopenias intensas, tromboastenia hemorrágica hereditária de Glanzmann, 
trombopatia constitucional (von Willebrand), púrpura vasculares, púrpuras alérgicas 
(Schoelein – Henoch), púrpura senil, escorbuto, síndrome hemorrágica vascular hereditária 
(Ehlers – Danlos). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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30 
RETRAÇÃO DO COÁGULO (QUALITATIVO) 
 
 
TÉCNICA: 
 
1. Colher 3 mL de sangue e colocar em tubo de ensaio no banho-maria 37o C. 
2. Logo após a coagulação marcar o relógio e observar de hora em hora até 4 horas e após 
24 horas. 
3. Considera-se completa a retração, quando o coágulo se deslocar das paredes do tubo com 
a separação do soro. O coágulo reduz-se aproximadamente à metade do volume original. 
 
 
INTERPRETAÇÃO: 
 
 Normal: Quando a retração ocorre até 4 horas. 
 Reduzida (parcial): Retração depois de 4 horas, mas dentro das 24 horas. 
 Nula: quando não ocorre retração. 
Obs.: Trombocitopenias intensas < 50.000 plaquetas / mm3; Tromboastenia hemorrágica 
hereditária; Tromopatia constitucional (von Willebrand); Hiperfibrinogemia; Poliglobulias. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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31 
DETERMINAÇÃO DO GRUPO SANGUÍNEO (ABO) E 
FATOR Rh 
 
 
TÉCNICA EM TUBO: 
 
1. Lavar os glóbulos 3 vezes com salina (0,85%). Usar 2 gotas de sangue e +/- 2 mL de 
salina, centrifugar durante 3 minutos a 2.000 rpm (cada etapa). 
2. Após a última lavagem, desprezar o sobrenadante. 
3. Preparar uma suspensão a 5%, sobre a gota que sobrou (hemácia), adicionando 19 gotas 
de salina. 
4. Colocar nos tubos devidamente marcados ( A, B, Rh) uma gota da suspensão à 5%. 
5. Colocar os anti-soros A,B,Rh nos respectivos tubos (1 gota em cada) e centrifugar a 
2.000 rpm durante 2 a 3 minutos. 
6. Observar a aglutinação após delicada agitação. 
 
 
DETERMINAÇÃO DO FATOR Du 
 
 
Se após a observação (item 6) não houver aglutinação no tubo Rh, proceder da seguinte 
forma: 
 
1. Incubar à 37o C por 15 minutos. Centrifugar e observar. 
2. Lavar 3 vezes com salina (0,85%), centrifugando por 3 minutos a 2.000 rpm 
(cada etapa). 
3. Após a última lavagem, desprezar o sobrenadante. 
4. Acrescentar 2 gotas do soro de Coombs. Centrifugar e observar. 
 
HAVENDO AGLUTINAÇÃO: Fator Du positivo 
NÃO HAVENDO AGLUTINAÇÃO: Fator Du negativo 
 
 
 
 
 
 
 
 
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32 
FRAGILIDADE OSMÓTICA OU RESISTÊNCIA GLOBULAR 
(Método de Sanford) 
 
TÉCNICA: 
 
1. Solução de NaCl 0,5% feita volumetricamente em água destilada recente. 
2. Marcar 12 tubos e numerá-los de 25 a 14. 
3. No primeiro tubo colocar 25 gotas da salina e nos seguintes o número de gotas 
correspondente ao número do tubo. 
4. Completar para 25 gotas com água destilada (Ao colocar as gotas, manter a pipeta 
sempre na vertical para que elas tenham o mesmo volume). 
5. Acrescentar uma gota de sangue recém-colhido sem anticoagulante em cada tubo. 
Obs.: Caso não seja possível trabalhar com sangue recém colhido, lavar 3 vezes com 
salina 0,85% e preparar uma suspensão a 50%. 
6. Misturar por inversão. Deixar repousar por 2 horas à temperatura ambiente. 
7. Centrifugar a 1.500 rpm por 2 minutos. Observar. 
8. O resultado da curva de fragilidade osmótica deve ser comparado com a morfologia 
eritrocitária do paciente. 
 
• Hemólise inicial – sobrenadante róseo 
• Hemólise completa – vermelho com pouco ou nenhum sedimento 
 
VALORES DE REFERÊNCIA: 
 
 Inicial: 0,44% a 0,42% Completa: 0,34% 
 
TUBO SALINA 0,5% H2O DEST. SANGUE CONC. 
25 25 gts 00 gts 01 gt 0,50 % 
24 24 gts 01 gts 01 gt 0,48 % 
23 23 gts 02 gts 01 gt 0,46 % 
22 22 gts 03 gts 01 gt 0,44 % 
21 21 gts 04 gts 01 gt 0,42 % 
20 20 gts 05 gts 01 gt 0,40 % 
19 19 gts 06 gts 01 gt 0,38 % 
18 18 gts 07 gts 01 gt 0,36 % 
17 17 gts 08 gts 01 gt 0,34 % 
16 16 gts 09 gts 01 gt 0,32 % 
15 15 gts 10 gts 01 gt 0,30 % 
14 14 gts 11 gts 01 gt 0,28 % 
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33 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
FRAGILIDADE OSMÓTICA 
Reduzida Aumentada 
Hb S Talassemias Esferocitose 
Hb C Doenças hepáticas crônicas 
Hipocromia (HCM ↓) Pós-esplenectomia 
Anemias ferroprivas 
Curva de fragilidade osmótica – Paciente com fragilidade aumentada. 
Hemólise inicial: Tubo 23 (0,46%) 
Curva de fragilidade osmótica – Paciente com fragilidade normal. 
Hemólise inicial: Tubo 22 (0,44%) 
Curva de fragilidade osmótica – Paciente com fragilidade diminuída. 
Hemólise inicial: Tubo 19 (0,46%) 
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34 
TESTE DE HAM 
 
 A Hemoglobinúria Paroxística Noturna (HPN) é uma doença adquirida e rara, caracterizada 
pela mutação somática que inativa o gene PIG-A, ligado ao cromossomo X. A proteína produto 
deste gene, participa das fases iniciais de formação do glicosilfosfatidilinositol (GPI), que funciona 
como uma âncora a um grande número de proteínas, entre elas o CD55 e o CD59 que estão 
diretamente relacionadas com a patogenia da HPN, particularmente o CD59 que protege a célula do 
efeito lítico do complemento ativado. 
O teste de HAM fundamenta-se na ativação do complemento pela acidificação do soro a um 
pH de 6.2, condições em que as células HPN sofrem hemólise e as normais não. Este teste é 
bastante específico e a sensibilidade não é muito boa nos casos com pequeno número de células 
HPN. 
 
FASE PRELIMINAR: 
 
1. Lavar as hemácias por 3 vezes com salina (0,85%). Usar 2 gotas de sangue e +/- 2 mL de 
salina, centrifugar durante 3 minutos a 2.000 rpm (cada etapa). 
2. Após a última lavagem, desprezar o sobrenadante. 
3. Preparar uma suspensão a 50%, adicionando salina no mesmo volume das hemácias que 
ficaram no tubo. 
4. Inativação do soro: Incubar a 56o C por 30 minutos 
 
TÉCNICA: 
 
 TESTE CONTROLE 
REAGENTES / TUBOS 1 2 3 4 5 6 
Soro fresco normal 200 µµµµL 200 µµµµL -------- 200 µµµµL 200 µµµµL -------- 
Soro fresco inativado -------- -------- 200 µµµµL -------- -------- 200 µµµµL 
HCl 0,2 mol/L -------- 20 µµµµL 20 µµµµL -------- 20 µµµµL 20 µµµµL 
Hemácias do paciente a 50% 20 µµµµL 20 µµµµL 20 µµµµL -------- -------- -------- 
Hemácias normais a 50% -------- -------- -------- 20 µµµµL 20 µµµµL 20 µµµµL 
 
1. Incubar a 37oC por 60 minutos, centrifugar por 3 minutos a 1.500 rpm. 
2. Realizar a leitura. 
 
 
INTERPRETAÇÃO: 
 
 Se houver hemólise no Tubo 2: POSITIVO 
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35 
TESTE DE SACAROSE 
 
O teste da Sacarose também se baseia no principio da ativação do complemento, consistindo 
na mistura do soro com um meio de baixa força iônica. Esta prova é muito sensível para HPN, 
porém a especificidade ébaixa, pois outras doenças hematológicas podem ser positivas (anemia 
hemolítica auto-imune, leucemias, entre outras). 
 
SOLUÇÃO DE SACAROSE: 
 
Sacarose............................................... 0,5 g 
Água destilada qsp............................... 5,0 mL 
 
FASE PRELIMINAR: 
 
1. Lavar as hemácias por 3 vezes com salina (0,85%). Usar 2 gotas de sangue e +/- 2 mL de 
salina, centrifugar durante 3 minutos a 2.000 rpm (cada etapa). 
2. Após a última lavagem, desprezar o sobrenadante. 
3. Preparar uma suspensão a 50%, adicionando salina no mesmo volume das hemácias que 
ficaram no tubo. 
 
TÉCNICA: 
 
 TESTE CONTROLE 
REAGENTES / TUBOS 1 2 
Soro fresco normal 20 µµµµL 20 µµµµL 
Sacarose / Salina 340 µµµµL sacarose 340 µµµµL salina 
Suspensão de hemácias a 50 % 25 µµµµL (paciente) 25µµµµL (paciente) 
 
1. Incubar a 37oC por 30 minutos, centrifugar por 3 minutos a 1.500 rpm. 
2. Realizar a leitura. 
 
 
INTERPRETAÇÃO: 
 
 Se houver hemólise no Tubo 1: POSITIVO 
 
 
 
 
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36 
COOMBS DIRETO (PESQUISA DE ANTÍGENOS) 
 
 
TÉCNICA: 
 
1. Lavar as hemácias por 3 vezes com salina (0,85%). Usar 2 gotas de sangue e +/- 2 mL de 
salina, centrifugar durante 3 minutos a 2.000 rpm (cada etapa). 
2. Após a última lavagem, desprezar o sobrenadante. 
3. Preparar uma suspensão a 5%, sobre a gota que sobrou (hemácias), adicionando 19 gotas 
de salina. 
4. Colocar nos tubos, devidamente marcados, uma gota da suspensão a 5%. 
5. Em cada tubo adicionar 02 gotas de soro anti-humano. Homogeneizar bem. 
6. Centrifugar a 1.500 rpm por 1 minuto e fazer a leitura. 
7. Agitar suavemente os tubos para pesquisar aglutinação. 
8. Se não houver aglutinação ou hemólise visíveis a olho nu, será necessária a observação 
ao microscópio. 
 
 
RESULTADO: 
 
Se houver aglutinação ou hemólise: POSITIVO 
Se não houver aglutinação ou hemólise: NEGATIVO 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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37 
COOMBS INDIRETO 
 
TÉCNICA: 
 
FASE PRELIMINAR – PREPARAÇÃO DOS TUBOS I E II: 
 
1. Selecionar 2 indivíduos do grupo sanguíneo “O” Positivo. Identificar cada indivíduo 
como Tubo I e Tubo II. 
2. Lavar as hemácias por 3 vezes com salina (0,85%). Usar 2 gotas de sangue e +/- 2 mL de 
salina, centrifugar durante 3 minutos a 2.000 rpm (cada etapa). 
3. Após a última lavagem, desprezar o sobrenadante. 
4. Preparar uma suspensão a 5%, sobre a gota que sobrou (hemácias), adicionando 19 gotas 
de salina. 
5. Colocar em novos tubos, devidamente marcados (I e II), uma gota da suspensão a 5%. 
 
1° ETAPA: MEIO SALINO À TEMPERATURA AMBIENTE 
 
Esta etapa visa detectar anticorpos salinos (aglutininas salinas da classe IgM) reativos à temperatura 
ambiente (23°C) 
 
6. Adicionar, em cada um dos dois tubos de ensaio previamente identificados I e II, duas 
gotas do soro sob triagem para anticorpos irregulares. Homogeneizar bem, com o 
cuidado para não formar espuma. 
7. Centrifugar ambos os tubos durante 15 segundos a 3400 rpm ou 1 minuto a 1000 rpm. 
8. Ressuspender delicadamente o botão de hemácias, em cada tubo, observando a presença 
ou não de hemólise e/ou aglutinação. 
 
2ª ETAPA: MEIO PROTÉICO À TEMPERATURA AMBIENTE 
 
Esta etapa visa detectar anticorpos salinos (IgM) que têm sua ação intensificada em meio protéico e 
anticorpos incompletos albumínicos mais potentes (anticorpos da classe IgG) 
 
9. Adicionar em cada tubo 2 gotas de albumina bovina a 22%. MISTURAR BEM. 
10. Proceder como nas passagens 7 e 8. 
 
 
 
 
 
Laboratório de Hematologia Clínica – Faculdade de Farmácia - UFBA 
 
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3ª ETAPA: MEIO PROTÉICO À TEMPERATURA DE 37°C 
 
Esta etapa visa detectar anticorpos incompletos albumínicos reativos a 37°C, como os anticorpos do 
sistema Rh. 
 
11. Incubar ambos os tubos em banho-maria a 37°C durante 45 minutos. 
12. Proceder como nas passagens 7 e 8. 
 
4ª ETAPA: TESTE DA ANTIGLOBULINA HUMANA (COOMBS INDIRETO) 
 
Esta etapa visa detectar anticorpos incompletos reativos pelo teste de coombs indireto (Anticorpos 
de classe IgG das imunoglobulinas e anticorpos fixadores de componentes do complemento à 
membrana celular 
 
13. Lavar o conteúdo dos tubos I e II com solução salina por 3 vezes consecutivas. Decantar 
completamente a solução salina após a última lavagem. 
14. Adicionar a ambos os tubos 2 gotas de soro anti-humano monoespecífico (anti IgG 
humana). 
15. Proceder como nas passagens 7 e 8. 
16. Se não houver aglutinação ou hemólise visíveis a olho nu, será necessária a observação 
ao microscópio. 
17. Confirmando a positividade, realizar a titulação seriada do soro sob triagem, repetindo 
todas as etapas do teste (a partir do item 6). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
1/2 
Soro sob 
triagem 
200 µL 200 µL 200 µL 200 µL 200 µL 200 µL 
1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 
200 µL de salina 
(0,85%) 
... 
200 µL 
Titulação seriada do soro sob triagem 
Laboratório de Hematologia Clínica – Faculdade de Farmácia - UFBA 
 
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RESULTADO: 
 
Se houver aglutinação ou hemólise: POSITIVO, TITULAÇÃO 1/X 
Se não houver aglutinação ou hemólise: NEGATIVO 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Laboratório de Hematologia Clínica – Faculdade de Farmácia - UFBA 
 
40 
DEMOSTRAÇÃO DE CÉLULAS “LE” 
 
 
 As células “LE” foram descritas por Hargraves e Cols em 1948. Sua pesquisa é positiva na 
maioria dos pacientes de Lúpus eritematoso disseminado, bem como em alguns casos de artrite 
reumatóide e, raramente, em outras condições patológicas, como púrpura trombocitopênica, 
periartrite nodosa, esclereroderma, dermatomiosite, febre reumática, tuberculose miliar, erisipela e 
lúpus eritematoso discóide. 
 São de 2 ordens técnicas: diretas e indiretas. Nas técnicas diretas os elementos provêm do 
próprio paciente; nas indiretas o soro provém do paciente e os leucócitos de outras pessoas. 
 
TÉCNICA DIRETA DE ZIEMER E HARGRAVES: 
 
1. Colher 5 mL de sangue e deixar coágulo. Incubar a 37o durante 60 minutos. 
2. Decantar o soro expelido pelo coágulo. 
3. Passar o coágulo através das malhas de uma peneira com auxílio do fundo de um outro 
tubo seco ou bastão de vidro, com pequena pressão. 
4. O material recolhido num recipiente é transferido para um tubo de Wintrobe e 
centrifugado a 2.000 rpm durante 20 minutos. O creme leucocitário (camada entre os 
glóbulos vermelhos e o plasma hemolisado) é aspirado em pipeta e colocado em lâmina. 
5. Fazer a distensão do material sobre as lâminas e corar. 
6. Examinar o material principalmente nas bordas, à procura da presença de células. 
Obs.: Deverão ser examinadas as lâminas que se apresentarem ricas em leucócitos. 
 
 A incubação inicial poderá ser mais longa em casos com níveis mais baixos de anticorpos e 
casos muito evidentes por vezes dão preparações mais satisfatórias com tempos mais curtos de 
incubação. 
 A pesquisa de células LE deverá sempre que possível ser realizada em conjunto com a 
pesquisa de anticorpos antinucleares. 
 
 NORMAL: A ausência de células LE (podem estar presentes “tart cells” e resetas, devendo 
esse fato ser assinalado). 
 
 
 
 
 
Células “LE” – Marcadas com um X