Curva de calibração ou curva padrão espectrofotométrica

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Espectrofotometria e curvas de calibração: introdução, 
finalidades, principais usos, cuidados... 
A principal finalidade de uma medida 
espectrofotométrica, nas regiões do 
ultravioleta e visível é avaliar quantidades em 
amostras desconhecidas. Avaliações 
qualitativas, entretanto, também podem ser 
realizadas. 
Assim, é extremamente importante efetuar 
uma rigorosa calibração visando obter 
resultados precisos 
Para se obter uma curva de calibração, alguns 
aspectos devem ser considerados: a escolha de 
uma solução padrão (albumina no nosso caso), 
o estabelecimento de um branco adequado e a 
seleção da área espectral. 
Curva de calibração ou curva padrão 
espectrofotométrica 
Para se descobrir a concentração de uma determinada substância em 
solução é necessário estabelecer uma relação entre a absorbância desta 
solução em diferentes concentrações. Isto se chama curva de calibração. 
Utilizaremos albumina (10 mg/mL) e suas respectivas diluições. 
Concentrações 
Conhecidas (padrões) 
Respectivas 
absorbâncias 
Além de padrões utiliza-se os brancos 
As medidas de absorção de luz devem ser feitas em relação a um branco, 
uma solução que contém todos os componentes do experimento, exceto 
o composto que está sendo medido. Ou seja, um simples sistema para 
eliminar a absorbância dos reagentes e das cubetas. 
O nosso branco será constituído por 
água e pelo reagente de Biureto, 
utilizado na detecção e quantificação de 
proteínas.. 
Como o reagente de biureto atua? 
 O reagente de biureto é um reagente analítico feito de hidróxido de potássio (KOH) e 
sulfato de cobre (II) (CuSO4), junto com tartarato de sódio e potássio 
(KNaC4H4O6·4H2O). Este reagente de coloração azul torna-se violeta na presença de 
proteínas quando em meio alcalino. 
 
Os íons cúpricos liberados formam complexos com os átomos de nitrogênio das ligações 
peptídicas. Este complexo possui coloração violeta e pode ser lido em 540 nm. 
É um método colorimétrico e os resultados 
São visualmente perceptíveis. 
Por que utilizar o comprimento de onda de 540 nm? 
Quando se realiza uma medida 
fotométrica deve-se utilizar uma faixa 
do espectro na qual a energia radiante 
seja absorvida ao máximo, a fim de se 
obter o mais alto grau de sensibilidade. 
 
O melhor processo consiste no preparo 
do “espectro de absorção”, que 
consiste nas medidas das absorbâncias 
nos respectivos comprimentos de 
onda. No nosso caso, de 400 – 700 nm. 
 
Podemos avaliar os espetros de 
absorção do Reativo de Biureto apenas 
e do Reativo de biureto + albumina (10 
mg/mL). Eles nos indicarão que a 
melhor faixa de trabalho se encontra 
entre 540 - 550 nm. Trabalharemos 
com 540 nm (feixe de luz 
monocromático). 
Reação albumina-biureto: absorção máxima 
próximo aos 540-550 nm 
Prática: enumerar os tubos e preparar diferentes diluições da solução de 
albumina 10 mg/mL, tendo como volume final 1,0 mL, como na tabela abaixo 
Tubo Concentração 
(mg/mL) 
Albumina 10 
mg/mL (mL) 
Água (mL) Biureto (mL) Absorbância 
1 2,0 0,2 0,8 4,0 
2 4,0 0,4 0,6 4,0 
3 6,0 0,6 0,4 4,0 
4 8,0 0,8 0,2 4,0 
5 10,0 1,0 ------ 4,0 
6 ------ ------ 1,0 4,0 
-O tubo 6 será o nosso branco; 
-Acrescentar primeiramente albumina e água, em seguida o biureto; 
-Aguardar 5 minutos para reação se completar; 
-Zerar o equipamento com o branco (F1) e traçar o espectro de absorção com a 
solução mais concentrada; 
-Selecionar o comprimento de onda adequado e realizar as demais leituras no 
modo fotométrico; 
-Anotar as absorbâncias. 
 
Prática: enumerar os tubos e preparar diferentes diluições da solução de 
albumina 10 mg/mL, tendo como volume final 1,0 mL, como na tabela abaixo 
Tubo Concentração 
(mg/mL) 
Albumina 10 
mg/mL (mL) 
Água (mL) Biureto (mL) Absorbância 
1 2,0 0,2 0,8 4,0 
2 4,0 0,4 0,6 4,0 
3 6,0 0,6 0,4 4,0 
4 8,0 0,8 0,2 4,0 
5 10,0 1,0 ------ 4,0 
6 ------ ------ 1,0 4,0 
-Caso preferirem podem utilizar a equação “C1V1 = C2V2” para calcular as 
concentrações menores de albumina, sempre respeitando o volume final de 1 
mL; 
 
-Opcional: preparar um sétimo tubo com soro humano diluído 20x (1,9 mL 
água + 0,1 mL de soro humano). Coletar 1 mL e acrescentar 4,0 mL do reativo 
de biureto. Esperar 5 minutos, realizar a leitura e anotar a absorbância. Ao final 
da construção da curva de calibração calcular a concentração de proteínas 
nesta amostra. Fator de diluição = Vf/Vi = 20/0,1 = 20 
Traçando os dados no papel milimetrado: Curva de calibração de albumina, cálculo 
do fator de calibração (Fc) e cálculo da concentração de uma amostra desconhecida 
Para traçar a curva, partir do zero (origem) e tentar interpolar o maior número de pontos 
X1 X2 
Y1 
Y2 
20 mm 20 mm 
𝐹𝑐 = 
𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎çã𝑜 𝑑𝑜 𝑝𝑎𝑑𝑟ã𝑜
𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏â𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑑𝑜 𝑝𝑎𝑑𝑟ã𝑜
 OU 𝐹𝑐 = 
𝑐𝑎𝑡𝑒𝑡𝑜 𝑎𝑑𝑗𝑎𝑐𝑒𝑛𝑡𝑒 (𝑥2−𝑥1)
𝑐𝑎𝑡𝑒𝑡𝑜 𝑜𝑝𝑜𝑠𝑡𝑜 (𝑦2−𝑦1)
 OU 
→Atentar-se para as 
Sugestões de escala 
 
→Programas gráficos 
Podem facilitar 
estes cálculos 
𝐹𝑐 = 
1
𝑡𝑔
 
𝐴𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎 = 𝐴𝑏𝑠 𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎 𝐹𝑐  𝐹𝑑 
Bom estudo!