Relatório . TÉCNICA DE CONTAGEM DE CÉLULAS VIÁVEIS ATRAVÉS DE PLAQUEAMENTO POR SPREAD PLATE

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ 
CENTRO DE CIÊNCIAS 
DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA 
MICROBIOLOGIA GERAL 
PROF. DRA. VÂNIA MARIA MACIEL MELO 
 
 
 
CAROLINY SOARES SILVA 
GABRIELA ALVES VALENTIM 
LAÍS BELMINO RÉGIS 
NATANAEL COSTA REBOUÇAS 
 
 
TÉCNICA DE CONTAGEM DE CÉLULAS VIÁVEIS ATRAVÉS DE 
PLAQUEAMENTO POR SPREAD PLATE 
 
 
 
Fortaleza 
2016 
INTRODUÇÃO 
Um fator fundamental para compreender um microrganismo, é o 
crescimento. O crescimento é medido através da análise de variações no número de 
células, ou seja, com base na alteração da população de uma espécie e não em 
relação a um indivíduo isolado. 
O crescimento pode ser analisado de diversas formas, como, por exemplo, 
por contagem de células totais, contagem de células viáveis, turbidimetria, 
determinação da massa celular ou por determinação do peso seco. A contagem de 
células totais é um método que visa a contagem de células vivas e mortas por área 
em uma câmara de contagem com auxílio de um microscópio de luz. O método da 
contagem de células viáveis trata da contagem de colônias em uma placa de Petri 
com o auxílio de uma lupa. A turbidimetria é uma técnica que permite a medição da 
turbidez da massa total de células com o auxílio de um espectrofotômetro. A 
determinação da massa celular é uma técnica de avaliação do conteúdo de nitrogênio 
presente na célula. Por fim, a determinação do peso seco é uma técnica de 
determinação do peso seco de células após desidratação por liofilização. 
A técnica de contagem de células viáveis em placa pode ser executada por 
meio de diferentes métodos de plaqueamento, um dos métodos mais utilizados é o 
spread plate, também conhecido como método de semeadura por espalhamento, que 
consiste no espalhamento de forma homogênea de uma amostra líquida na superfície 
de uma placa de meio sólido com o auxílio de um instrumento conhecido como alça 
de Drigalski. Após a incubação é possível visualizar o crescimento de colônias na 
superfície do meio. Esse método é recomendado para o cultivo de microrganismos 
aeróbios restritos ou anaeróbios facultativos, já que a amostra permanece exposta ao 
ar na superfície do meio (MADINGAN et al., 2010). 
Outro método comumente utilizado é o pour plate, também conhecido como 
método de semeadura em profundidade. Diferente do spread plate, no pour plate a 
amostra é depositada em uma placa estéril antes do meio de cultura ser adicionado e 
somente após a inoculação da amostra que o meio estéril e com temperatura próxima 
de 50°C é vertido e misturado ao inóculo. A mistura da amostra no meio de cultura é 
realizada a partir de movimentos circulares da placa sobre a bancada. Após a 
solidificação e a incubação é possível visualizar o crescimento de colônias em 
diferentes profundidades, informação que pode auxiliar a classificar os micro-
organismos de acordo com a presença de oxigênio. Contudo, o método é inadequado 
à microrganismos sensíveis ao calor, devido o contato do meio estéril ainda quente 
com o inóculo (MADINGAN et al., 2010). 
Nos métodos de contagem de células viáveis em placa é importante que o 
número de colônias desenvolvidas na placa não seja muito elevado, nem muito baixo. 
O intervalo comumente recomendado é o de 30 a 300 colônias por placa. Essa 
recomendação deve-se ao fato de que os métodos de contagem não expressam 
número exatos. A contagem é, na realidade, uma mensuração e para que essa 
estimativa seja válida, o valor numérico necessita está dentro de um intervalo padrão 
para que tenha significância estatística (MADINGAN et al., 2016; TORO, 2005). 
Para obter o número apropriado de colônias, a amostra a ser analisada deve, 
quase sempre, ser diluída. Considerando que dificilmente é possível prever o número 
aproximado de células viáveis, normalmente é necessário realizar mais de uma 
diluição, sendo empregadas frequentemente várias diluições decimais da amostra, 
como, por exemplo, as diluições 10−1 ,10−2 ,10−3 ,10−4 ,10−5 e 10−6 (MADINGAN et al., 
2010). 
Levando em consideração que todos os métodos de contagem são valores 
estimados, para aumentar a significância estatística é vantajoso o uso da metodologia 
científica das replicatas, pois duplicando ou triplicando o espaço amostral, é possível 
fazer uma média dos valores obtidos e assim garantir que o valor estimado está 
próximo ao valor real. Outro motivo relevante para utilizar a metodologia de replicatas 
é o fato de que apesar das vantagens, a técnica de contagem de células viáveis é 
suscetível ao erro, colônias sobrepostas podem ser contabilizadas como uma única 
colônia, um espalhamento ou uma pipetagem que contenham erros em sua realização 
podem comprometer a homogeneidade da colônia e outras fontes de erros, que fazem 
necessário o uso de réplicas para validar estatisticamente a contagem (MADINGAN 
et al., 2010). 
A técnica de contagem de células viáveis em placa é considerada de alta 
sensibilidade, pois diferente da contagem de células totais, apenas as células que 
possuem metabolismo ativo serão contabilizadas. Essa técnica se baseia na premissa 
de que uma célula isolada, quando em condições favoráveis, se replica e dá origem a 
uma colônia macroscópica, sendo a contagem expressa em unidades formadoras de 
colônias (UFC), inferindo que cada colônia foi formada por uma célula bacteriana 
(SOARES et al., 1987). 
Contudo, as contagens em placa podem ser pouco confiáveis quando 
utilizadas na avaliação do número total de células em amostras naturais, como solo 
ou água, devido ao fato de que diferentes organismos podem necessitar de diferentes 
recursos e condições de crescimento em culturas laboratoriais. Por exemplo, se as 
populações microbianas existentes em uma mesma amostra necessitarem de tempos 
diferentes de incubação, mas o tempo de incubação em que a amostra foi exposta só 
for satisfatório para uma parcela dessas populações, o valor estimado de células da 
amostra não será fiel ao valor em condições naturais (MADINGAN et al., 2010). 
Um meio muito utilizado para a técnica de contagem de células viáveis em 
placa quando o objetivo é detectar a presença de coliformes em água, lácticos e 
alimentos é o Lauryl Tryptose Broth, também conhecido como Caldo Lauril Triptose 
que é um meio seletivo que funciona de acordo com os padrões da Associação 
Americana de Saúde Pública (APHA). Esse meio de cultura fornece lactose como 
fonte de carbono (SPLABOR, 2011). O Caldo Lauril Triptose é usado principalmente 
para detecção e cultivo de coliformes (NEOGEN, 2011). 
Diante disso, os objetivos da realização dessa pratica foram discutir sobre 
as diferentes técnicas de contagem de placa e estimar o número de células contido 
em colônias de diferentes microrganismos através do método de contagem de células 
viáveis através de plaqueamento por spread plate, exercitando a técnica de diluição e 
a contagem de colônias. Além disso, a prática buscou estimular os alunos a pensar 
sobre as aplicações da determinação da concentração de células bacterianas por 
mililitro. Os objetivos serão alcançados através do contato dos alunos com os 
instrumentos utilizados na semeadura de microrganismos, análise das placas 
incubadas e realização dos cálculos de estimativa, além da fundamentação teórica 
fornecida em sala e discussão realizada sobre as possíveis aplicações do 
conhecimento obtido. 
 
 
METODOLOGIA 
Nos dias 4 e 6 de maio de 2016, a prática aqui descrita foi realizada no 
Laboratório Didático de Microbiologia (LADMI), localizado no bloco 906, Departamento 
de Biologia, na Universidade Federal do Ceará (UFC), durante as aulas da disciplina 
de Microbiologia Geral, lecionadas pela Prof. Dra. Vânia Maria Maciel Melo, com oauxílio dos monitores Paulo Ricardo Santos de Sousa e Fernando César Araújo 
Moreira. 
Durante a aula prática, para realizar o método de contagem de células 
viáveis, foram usadas bactérias Gram-negativas: Escherichia coli e Serratia 
marcescens, e bactérias Gram-positivas: Staphylococcus epidermitis e Bacillus 
subtilis, todas tidas como culturas puras. 
Os materiais necessários para a realização da prática foram a cultura de 
Escherichia coli; placas de Petri contendo meio de cultura Lauryl Tryptose Broth, 
composto por ágar, triptose, lactose, cloreto de sódio, fosfato dipotássico, e dodecil-
sulfato de sódio; alça de Drigalski, utilizada para espalhar amostras líquidas sobre 
meios de cultura sólidos; alça de inoculação descartável estéril, utilizada para coletar 
amostra de microrganismos e inocular meios de cultura; tubos contendo 9mL de 
solução salina fisiológica 0,9% estéril; estufa bacteriológica, para incubação das 
culturas; agitador de tubos ou vórtex, para agitar a amostra, dispersando as unidades 
celulares das bactérias na solução líquida; canetas de tinta permanente, para 
identificação dos tubos; bico de Bunsen e pipetas, como observado na figura 1. 
 
Figura 1 - Materiais utilizados para realização 
da técnica de contagem de células viáveis. 
Fotografia por: Caroliny Soares. 
Figura 2 - Placa contendo colônia destacada 
que será escolhida para dar origem a solução 
mãe. Fotografia por: Caroliny Soares 
Na prática realizada pelos alunos Caroliny Soares Silva, Gabriela Alves 
Valentim, Laís Belmino Régis e Natanael Costa Rebouças, a bactéria utilizada para 
estudo foi Escherichia coli. Antes de iniciar os processos de diluição e plaqueamento 
do microrganismo, todos os tubos e placas de Petri, foram devidamente identificados 
com o nome, data, turma, número da diluição e o microrganismo utilizado. A partir 
desse ponto iniciaram-se as diluições. 
Durante a realização das diluições e plaqueamento, todos os utensílios e 
vidrarias foram manipulados em acordo com as técnicas assépticas recomendadas. 
Para criar uma amostra líquida, chamada de solução mãe, contendo uma 
colônia de células foi utilizada uma alça de inoculação descartável e devidamente 
estéril, foi coletada de uma placa de Petri uma colônia isolada de Escherichia coli, de 
uma cultura pura, como observado na figura 2. A colônia foi transferida para em 1mL 
de solução salina, contida em um tubo de Falcon, onde a alça foi agitada para que 
todas as células presas à alça fossem dispersas na solução. Depois da inoculação, o 
tudo foi levado ao agitador de tubos, para garantir que as células se mantiveram 
dispersas de forma homogênea na solução. O tubo foi colocado na estante, e a alça 
utilizada foi descartada. 
Em seguida, foram realizadas diluições de 10-1 a 10-6 da solução mãe. Para 
a preparação da diluição 10-1, 9mL de solução salina foram tornados no tubo de Falcon 
contendo a solução mãe, respeitando todas as técnicas assépticas. O tubo com a 
diluição 10-1 foi levado ao agitador, para garantir a homogeneidade das células dentro 
da solução. 
Para a preparação da diluição 10-2, foi utilizada uma pipeta para retirar 1mL 
da diluição 10–1 e foi depositado em outro tubo contendo 9mL de solução salina, sendo 
também levada ao agitador, originando uma solução com diluição de 10-2. 
Seguindo a mesma metodologia para preparar as outras diluições, a 
diluição 10-3 foi preparada a partir da deposição de 1mL da diluição 10-2 em outro tubo 
de Falcon contendo 9mL de solução salina, respeitando todas as técnicas assépticas. 
No preparo da diluição 10-4, foi coletada uma quantidade de 1mL da diluição 
de 10-3 e colocada em um tubo com 9 ml de solução salina, sendo levada ao agitador, 
formando, assim, a solução de diluição 10-4. 
Na preparação da diluição de 10-5, foi utilizado 1mL da solução de diluição 
10-4 e para misturar-se a 9mL de solução salina. Posteriormente, o tubo foi 
levado ao agitador, dando origem a solução de diluição 10-5. Assim como nas outras 
diluições, todas as recomendações das técnicas foram respeitadas, minimizando o 
risco de contaminação. 
As diluições 10-3, 10-4 e 10-5, foram escolhidas para realizar a análise e 
estimativa do número de colônias viáveis presentes na colônia original. As diluições 
foram plaqueadas em Agar Count Plate, em duplicata, com o auxílio de uma pipeta de 
100µL (microlitros) em placas de Petri, previamente identificadas. Durante todo o 
procedimento as técnicas assépticas foram cuidadosamente seguidas. 
 O primeiro plaqueamento realizado foi o da diluição 10-3, onde foram 
colhidos 100µL da solução diluída para serem inoculados sobre o meio de cultura 
sólido contido na primeira placa. O mesmo volume foi inoculado sobre a segunda 
placa de Petri. As placas foram colocadas sobre a bancada enquanto aguardavam o 
espalhamento. 
O mesmo procedimento foi realizado com a diluição de 10-4. Seguindo o 
mesmo método, foram colhidos do tubo de Falcon contendo a diluição desejada dois 
volumes de 100µL da solução, inoculando o conteúdo no meio de cultura. As placas 
aguardaram sobre a bancada. 
Da solução de diluição 10-5 foram coletados dois volumes de 100 µL. Estes 
foram inoculados sobre o meio de cultura contido nas placas de Petri, com cuidado 
para que o líquido não respingasse sobre o manipulador dos materiais. As duas placas 
aguardaram o plaqueamento sobre a bancada. 
Após a deposição das soluções sobre o meio de cultura contido em placa 
de Petri, com auxílio de uma alça de Drigalski descartável, o volume depositado foi 
espalhado por toda a área da placa de Petri. O espalhamento foi realizado da maior 
diluição para a menor, ou seja, primeiramente foi espalhada a solução da diluição de 
10-5, passando pelas placas contendo a amostra de 10-4 e, por último, as amostras de 
diluição de 10-3. Durante o espalhamento dos volumes em todas as placas as técnicas 
assépticas foram respeitadas. 
 
 
Após incubação na estufa bacteriológica, a uma temperatura de 
aproximadamente 36°C, durante 48 horas, as placas foram analisadas. Buscou-se 
placas que possuíssem um número de colônias entre 30 e 300. As placas que 
respondiam aos requisitos para a contagem de colônias foram analisadas com o 
auxílio de uma lupa, para facilitar a visualização de colônias menores, instrumento 
observado nas figuras 5 e 6. Após a contabilização de uma determinada colônia ela 
era marcada utilizando uma caneta de tinta permanente, como observado na figura 7. 
Os valores contabilizados foram anotados. 
Para realizar a estimativa entre os números de colônias a média dos 
números obtidos foi realizada. Para estimar o número de unidades formadoras de 
colônias por mililitro (mL) foi realizada uma regra de três para obter o valor desejado 
em função do número de colônias encontrado a partir da inoculação de 100µL da 
solução. 
Figura 3 - Preparo das diluições 
com amostra de cultura da 
bactéria Escherichia coli. 
Fotografia por: Caroliny Soares. 
: 
Figura 4 - Processo de semeadura 
dos volumes das diluições de 
cultura da Bactéria Escherichia 
coli. Fotografia por: Caroliny 
Soares. 
 
 
 
Figura 5 - Contador de colônias 
manual. Fotografia por: Caroliny 
Soares. 
Figura 6 - Contagem manual de 
colônias. Fotografia por: Caroliny 
Soares. 
Figura 7 - Placa com marcações após contagem das 
colônias. Fotografia por: Caroliny Soares. 
RESULTADOS E DISCUSSÃO 
A placa onde foi inoculada a amostra de diluição 10-3, como observado na 
figura 08, apresentou número de colônias superior a 300, inviabilizando a estimativa 
do número de células viáveis da colônia analisada. A diluição permitiu a visualização 
da maior parte das colônias da placa de forma individualizada.No entanto, a 
quantidade de colônias que cresceram mostra-se visivelmente superior ao número 
máximo recomendado para estimativa de 300 colônias por placa. 
A placa inoculada com a diluição 10-4, como observado na figura 09, 
apresentou um número elevado de colônias e regiões onde estas colônias se uniam 
em grandes massas, impedindo a individualização das colônias e por consequência 
sua contagem. As colônias apresentaram tamanho pouco maior que a diluição 
anterior. O número de colônias observado por unidade de área pareceu menor. Ainda 
assim, em regiões próximas ao centro da placa as células cresceram de forma 
desorganizada e muito próximas umas das outras, gerando um amontoado de células 
que impediu a contagem. 
A placa inoculada com a diluição 10-5, como observado na figura 10, 
apresentou colônias individualizadas na periferia. No entanto, no centro da placa, as 
colônias se uniram em uma massa de células que impedia sua individualização e 
impedia a contagem do número de colônias. Apesar de se esperar que a diluição não 
oferecesse possibilidade de estimativa, devido ao alto número de colônias e pequenas 
regiões onde pudesse haver união delas, o centro da placa apresentou uma região 
consideravelmente extensa onde não era possível observar as colônias 
Figura 8 - Placas inoculadas com amostra de 
cultura da bactéria Escherichia coli diluída a 10-
3, plaqueadas a partir do método Spread Plate. 
Fotografia por: Caroliny Soares. 
Figura 9 - Placas inoculadas com amostra de 
cultura da bactéria Escherichia coli diluída a 10-
4, plaqueadas a partir do método Spread Plate. 
Fotografia por: Caroliny Soares 
individualmente. Este problema pode ter sido motivado por erro no espalhamento da 
amostra, que ficou concentrada no centro da placa, gerando o crescimento 
desordenado de colônias nesta região. 
Devido à impossibilidade de contagem das colônias originadas a partir do 
método spread plate, a professora Dra. Vânia Maria Maciel Melo forneceu a bancada 
duas placas preparadas a partir do plaqueamento de uma diluição 10-5 de cultura do 
mesmo organismo analisado inicialmente, Escherichia coli, por meio do mesmo 
método, como observado na figura 11. A estimativa do número de células viáveis foi 
realizada utilizando estas duas placas. 
Na primeira placa analisada foram encontradas 512 colônias, enquanto na 
segunda foi observado um número de 139. A média entre as duas quantidades é, 
então, de 325,5 colônias. O cálculo da estimativa foi realizado como descrito abaixo: 
 
325,5 × 105 → 3,25 × 107 
 
3,25 × 107 − 100𝜇𝐿 𝑜𝑢 102 
𝑥 − 1000𝜇𝐿 𝑜𝑢 103 
 
𝑥 =
3,25 × 107 × 103
102
 = 𝟑, 𝟐𝟓 × 𝟏𝟎𝟖 𝑼𝑭𝑪/𝒎𝑳 
 
Figura 10 - Placas inoculadas com amostra de cultura da 
bactéria Escherichia coli diluída a 10-5, plaqueadas a 
partir do método Spread Plate. Fotografia por: Caroliny 
Soares. 
Figura 11 - Placas inoculadas com amostra de cultura 
da bactéria Escherichia coli diluída a 10-5, plaqueadas a 
partir do método Spread Plate. Fotografia por: Caroliny 
Soares 
O número de unidades formadora de colônias estimados por mililitro (ml) 
torna-se pouco preciso devido a contagem de uma placa que possuía um número de 
colônias superior ao máximo de 300 colônias sugerido usualmente na literatura 
(MADIGAN et al., 2016). 
A discrepância entre o número de células contabilizadas nas duas placas 
analisadas pode ter origem em falhas ocorridas durante o plaqueamento, onde a 
amostra pode não ter sido bem homogeneizada ou distribuída uniformemente sobre o 
meio (MADIGAN et al., 2016). 
Uma cultura do mesmo microrganismo foi analisada por outra equipe de 
alunos durante a realização da prática. A equipe realizou diluições de 10-4, 10-5 e 10-6 
da amostra bruta, relatando que a contagem das colônias pode ser realizada apenas 
nesta última diluição, onde o número de colônias permaneceu entre 30 e 300. Esta 
equipe estimou o número de 4,3 x 108 UFC/mL. Torna-se interessante observar que, 
apesar do comprometimento da precisão do método, quando comparados os 
resultados, as duas equipes que trabalharam com culturas de uma mesma linhagem 
de Escherichia coli conseguiram chegar a estimativas semelhantes. 
Não foi identificada a presença de contaminantes em nenhuma das placas 
analisadas. Visualmente, todas as colônias possuam as mesmas características 
morfológicas, como cor e textura, podendo-se inferir que não houve contaminação. 
Contudo, seria necessária a realização de outras análises bioquímicas, como, por 
exemplo, teste de fermentação de lactose, para confirmação da pureza da cultura. 
 
CONCLUSÃO 
Com a realização da prática de contagem de células viáveis em placa, foi 
possível discutir sobre as várias técnicas de contagem e estimativa de células e suas 
aplicações. A prática também possibilitou a aprendizagem do método para realizar a 
contagem de colônias utilizando o método de plaqueamento por spread plate, 
podendo estimar o número de células bacterianas existente em uma colônia 
originalmente estudada. Além disso, foi perceptível a importância do processo de 
diluição para que as colônias fossem vista de forma individualizada, permitindo, assim, 
a contagem das células viáveis presentes na placa. 
 A técnica estudada torna-se relevante no cotidiano de um 
microbiologista, pois permite a ele a possibilidade estimar a densidade de células 
bacterianas por mililitro (mL) existente em uma amostra analisada. Esse método pode 
ser utilizado para realizar análises de água, alimentos e análises clínicas. 
 
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 
MADIGAN, M. T., MARTINKO, J. M., DUNLAP, P. V., CLARK, D. P. Microbiologia de 
Brock. 14. ed. Porto Alegre: Artmed, 2016. 
MADIGAN, M. T., MARTINKO, J. M., DUNLAP, P. V., CLARK, D. P. Microbiologia de 
Brock. 12. ed. Porto Alegre: Artmed, 2010. 
NEOGEN. Acumedia Products. Lauryl Tryptose Broth (7324). 2011. Disponível em: 
<http://www.neogen.com/Acumedia/pdf/ProdInfo/7324_PI.pdf>. Acesso em: 12 abr. 
2016. 
SOARES, J. B., CASIMIRO, A. R. S., ALBUQUERQUE, L. M. B. de. Microbiologia 
Básica. Fortaleza: Edições UFC, 1987. 
SPLABOR. Meios de Cultura. Meios para Análise de Água. Caldo Lauril Triptose - 
Modelo M080. 2011. Disponível em: <http://www.splabor.com.br/meios-de-
cultura/meios-para-analise-de-gua/caldo-lauril-triptose-modelo-m080.html>. Acesso 
em: 12 abr. 2016. 
TORO C., D. R. Manual de introducción al laboratorio de microbiología. 
Manizales: Universidad de Caldas, 2005.