Microscópio e tecnicas histologicas

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Partes do Microscópio
Lente ocular é constituída por duas lentes que ampliam a imagem formada pelas objetivas e ajusta possíveis deficiências ópticas. Contêm as lentes oculares, as quais fornecem um poder de aumento de 10x a 15x, geralmente.
Tubo ou canhão serve de suporte para as lentes oculares.
Revólver utensílio giratório que tem como função portar as lentes objetivas.
Lentes Objetivas são um sistema de lentes com diferentes aumentos e seu número varia de acordo com o microscópio. Geralmente, há três ou quatro lentes em um microscópio, com de poderes de aumento de 4x, 10x, 40x e 100x.
Braço ou coluna está fixado à base e serve de estruturação para o restante do aparelho de microscopia.
Platina ou mesa serve como apoio para o material a ser observado, possui uma passagem de vidro por onde os raios de luz atravessam e também é dotada de parafusos dentados permitindo o deslocamento do material pela mesma.
Condensador e diafragma são responsáveis pela uniformidade da iluminação e redução ou ampliação da região a ser iluminada.
Lâmpada embutida é a fonte de luz do sistema.
Pé ou base trata-se do apoio e do ponto de fixação do microscópio.
Parafuso macrométrico é um objeto passível de rotação e permite a movimentação vertical da mesa.
Parafuso micrométrico por sua vez é responsável pelos movimentos verticais e sutis da mesa, permitindo aperfeiçoar a focagem.
Charriot é responsável pela movimentação lateral da lâmina em observação, sendo possível analisá-la de forma totalitária.
Procedimentos para preparação de lâminas histológicas
O material deve ser cortado e colocado no cassete para iniciar o procedimento Identificação do material no cassete.
Fixação: Para esse procedimento utiliza-se solução Bouin (mantem a integridade do tecido evitando qualquer alteração da estrutura celular; para ou inibi a autólise, impede a proliferação bacteriana, preserva e endurece os tecidos, com o intuito de favorecer as etapas seguintes da técnica histológica, coagular e tornar difusíveis substâncias insolúveis, além de facilitar o processo de coloração). A quantidade da solução deve ser de 10 a 30 vezes maior que o tamanho da amostra que deve permanecer na solução de 8 a 24 horas.
Reagentes: Ácido pícrico, Formaldeído e Ácido Acético Glacial.
Ácido Pícrico (solução aquosa saturada)..................750ml
Formaldeído 37-40%................................................250ml
Ácido Acético Glacial..................................................50ml
Descalcificação: Esse procedimento tem por objetivo remover os sais de cálcio. Após a fixação o material deve ser lavado durante 30 minutos para retirar o excesso do fixador e, só então, submetido à descalcificação. Para esse procedimento utiliza-se solução de EDTP
Reagentes: EDTA dissódico, hidróxido de sódio e água destilada.
Sal de EDTA dissódico..........................................250g
Água destilada..................................................1750ml
OBS: A solução fica esbranquiçada e deve ser neutralizada (PH=7) pela adição de aproximadamente 25g de hidróxido de sódio.
Desidratação: Consiste na remoção da água dos tecidos, pois as substâncias previamente utilizadas para inclusão em parafina não se combinam homogeneamente com a água. Para esse procedimento utiliza-se uma bateria de álcoois como mostrado a seguir:
Álcool 70%............................1 hora
Álcool 80%............................1 hora
Álcool 90%............................1 hora
Álcool absoluto I...................1 hora
Álcool absoluto II..................1 hora
Clarificação o diafanização: a clarificação visa remover completamente o álcool do interior dos tecidos. A parafina não se mistura com água e nem com álcool, de modo que ambos devem ser completamente removidos para que a parafina possa penetrar eficientemente no tecido. Para esse procedimento utiliza-se o Xilol que devem estar em quantidade superior a 30 vezes o tamanho da amostra:
Xilol I.................................40 minutos
Xilol II................................40 minutos
Infiltração: A infiltração dos elementos teciduais em parafina é importante, pois a parafina também é um meio de inclusão tecidual. Para infiltração ela deve ter sido previamente aquecida, pois a parafina é líquida somente em temperatura entre 56 °C e 60 °C, sendo sólida a temperatura ambiente. Após a clarificação as amostras devem ser incluídas em parafina como descrito a seguir:
Parafina I............................................1 hora
Parafina II...........................................1 hora
Inclusão: A inclusão se baseia em colocar com auxílio de uma pinça, previamente aquecida, os tecidos que foram previamente infiltrados na parafina no interior de um molde que já contém parafina líquida com a superfície a ser seccionada (a ser cortada ao micrótomo) para baixo.
Procedimentos de inclusão
Abrir o cassete e verificar o número de fragmentos contidos no cassete.
Selecionar o molde a ser utilizado de acordo com as dimensões dos fragmentos a serem incluídos.
Preencher o molde com parafina líquida pré-aquecida.
Com o auxílio de uma pinça selecionar o fragmento, sem deixá-lo esfriar, e colocá-lo no modelo preenchido previamente com parafina.
Colocar a base do cassete, sobre o molde de maneira que a parafina entre em contato com o cassete.
Levar o molde com material incluindo para placa resfriado.
Após o resfriamento, retirar o bloco do molde.
Microtomia: Para permitir a análise dos tecidos ao microscópio de luz, eles devem ser seccionados em fatias bem finas e uniformes. A espessura ideal varia de acordo com o objeto de estudo, recomenda-se a espessura de 4 a 6 micrômetros.
Execução dos cortes 
Com auxílio de uma navalha bem afiada, um micrótomo bem aferido e um bloco contendo material condizentemente incluído é possível iniciar a microtomia.
Material e Equipamento necessário
Micrótomo 
Pinça histológica com ponta curva
Banho Maria 
Cuba com gelo 
Pincel (opcional)
Bloco de tecido
Navalha bem afiada
Suporte para lâminas 
Lâminas com adesivo
Estufa 58°C
Procedimento para microtomia
Fixar o bloco no micrótomo
Colocaram maior eixo do bloco verticalmente ao fio da navalha. Se o órgão possuir capsulada, essa deve ficar no lado superior do bloco 
Acertaram o bloco para que sua superfície fique paralela a navalha
Colocar no microtomo uma navalha já utilizada para retirar o excesso de parafina até se alcançar o material 
Aparar o bloco 
Substituir a navalha velha por nova e afiada
Resfriar o bloco para endurecer mais a parafina e umedecer a superfície do tecido. Observação pode se utilizar um cubo de gelo o qual deve ter na superfície lisa para entrar em contato com a superfície do material 
Secar a navalha e o bloco com cuidado para não atingir o fio da navalha sem causar ranhuras 
Efetuar a microtomia propriamente dita obtendo os cortes com auxílio de uma pinça a qual auxilia na manipulação da fita formada 
Retirar a fita do microtomo com auxílio da pinça e transportá-la para o banho maria para realizar a distensão dos cortes. A temperatura do banho-maria deve estar em torno de 40 °C para que os cortes se distendem sobre a superfície da água evitando a formação de pregas. Pode-se, também, após a execução dos cortes coloca-los em banho-maria em temperatura ambiente e distende-los em placa aquecedora com a temperatura em torno de 40°C a 45°C 
Se o tecido formar dobras ainda no banho maria elas devem ser removidas com auxílio de uma pista curva, pois tais dobras interferem na análise histológica
Coletar o corte com lâminas limpas e identificadas
Levar a lâmina a estufa aquecida a 60°C para retirar o excesso de parafina e melhorar a adesão do corte a lâmina
Preparo prévio das lâminas 
As lâminas devem ser muito bem limpa e desengorduradas para que os cortes não se desprendam da lâmina durante as etapas subsequentes 
Marcação: As lâminas devem ser identificadas com o número de registro correspondente ao bloco, o que pode serfeito com lápis.
Coloração dos tecidos: A utilização de corantes é fundamental para visualizar os tecidos ao microscópio de luz. Após a microtomia as células e o material extracelular são habitualmente transparentes e os corantes melhoram a visualização das estruturas teciduais. Os corantes aplicados para corar tecidos que foram previamente fixados são chamados corantes não vitais, como a hematoxilina/eosina, entre outros. Para corar as lâminas deve-se deixar na estufa a 50°C por 25 minutos. Passe-as para o suporte dos banhos e em seguida na sequência descrita a seguir:
Xilol.......................................1 hora
Álcool absoluto I...................1 hora
Álcool absoluto II..................1 hora
Álcool 95%............................1 hora
Álcool 80%............................1 hora
Álcool 70%............................1 hora
OBS: Antes que o corte seja corado, a parafina em que ele foi incluído deve ser removida (desparafinização). O corte, que já foi aderido à lâmina de vidro por ‘pescagem’ em banho-maria, é banhado no xilol para dissolver a parafina. Devido ao fato de muitos corantes serem solúveis em água, torna-se necessário remover o xilol do tecido e substituí-lo por água (hidratação). O corte é imerso em uma série de concentrações decrescentes de álcool etílico (álcool mais concentrado → álcool menos concentrado), até que esteja hidratado. Depois que o corte estiver hidratado, procede-se à coloração propriamente dita.
Água destilada: somente colocar e tirar as lâminas uma única vez.
Hematoxilina(azul-púrpura)........................3 minutos
Água destilada.............................................5 minutos
Eosina (avermelhada)..................................6 minutos
Álcool 70%.................................................10 segundos
Álcool 80%.................................................10 segundos
Álcool 90%.................................................10 segundos
Álcool absoluto I.........................................10 segundos
Álcool absoluto II........................................1 minuto
Xilol.............................................................1 minuto
OBS: A maioria dos corantes se comporta como substâncias ácidas ou básicas, formando sais (ligações eletrostáticas) com radicais ionizados que estejam presentes nos componentes teciduais. Seguindo este princípio, os componentes teciduais que se coram melhor com corantes básicos, são denominados basófilos, e os que se coram com corantes ácidos, por sua vez, denominam-se acidófilos. Os constituintes celulares que reagem com os corantes básicos o fazem principalmente por meio de ácidos nucléicos, glicoproteínas ácidas e glicosaminoglicanas. Já os corantes básicos reagem principalmente com proteínas citoplasmáticas, grânulos citoplasmáticos, mitocôndrias e colágeno. Nas células coradas com HE, os ácidos nucléicos presentes no núcleo são corados pela hematoxilina, corante básico, dando ao núcleo um tom azul-arroxeado. A eosina, por sua vez, um corante ácido, é atraída pelos elementos básicos das proteínas do citoplasma da célula, corando-os de róseo a vermelho.
Retire a lâmina do xilol, coloque para secar em papel toalha, em seguida pingue Balsamo do Canadá e imediatamente coloque a lâmina cobrindo a região.