Métodos de Estudo da Célula

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Métodos de Estudo da Célula
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
DEPARTAMENTO DE HISTOLOGIA E EMBRIOLOGIA
CITOLOGIA
 Profa. Rosa Valéria S. Amorim
(rosavaleria@ufpe.br)
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Preparados Temporários (Estudos de Células Vivas)
	Corantes supravitais;
Ex. Cultura de células e de tecidos (in vitro); Cultivo de protozoários; Células vegetais( películas de folhas); Células em atividade e/ ou em circulação, no organismo de pequenos animais.
 
Preparados Permanentes (Células Mortas)
	Fixação e Coloração;
Preparados permanentes... Vantagem! 
Células preservadas melhor demonstração 
(fixadas e coradas) de seus componentes. 
Como as Células podem ser Estudadas?
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Quatro tipos de Microscopia óptica - Imagem de uma célula cultivada de fibroblasto. A) Microscopia de campo-claro. B) Microscopia de contraste de fase; c) Microscopia de contraste de Interferência diferencial; d) Microscopia de campo escuro.
Microscopia Óptico
TIPOS DE MICROSCOPIA
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TIPOS DE MICROSCOPIA
Microscopia Eletrônica 
Microscopia Eletrônica de Transmissão 
Microscopia Eletrônica de Varredura 
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As unidades de medida atualmente usadas em biologia celular e em histologia são as seguintes: 
 
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Técnicas de Coleta
	Existem métodos específicos para coleta de material distintos.
 Decalque ou imprint – Para visualizar os núcleos de órgãos de consistência mole (fígado, baço, rins);
 Esfregaço: Células livres presentes nos fluidos corpóreos (sangue, linfa, sêmem, líquor, hemolinfa); 
 Espalhamento: Consiste em promover uma raspagem das camadas superficiais das mucosas Ex.: mucosas vaginais ou bucais;
 Montagem total (à fresco ou não): 	Ex.: Órgão inteiro de insetos;
 Corte histológico: cortes extremamente finos (micrômetros) ;
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Preparação de Lâminas Permanentes para a observação em Microscopia de Luz
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Processamento de Material Biológico
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	Fixação do material
 
“A fixação imobiliza os componentes químicos celulares”
 
· Proteínas;
· Ácidos Nucléicos;
· Polissacarídeos;
· Lipídeos
Finalidades:
1. 	Evitar autólise;
2. 	Impedir a atividade e proliferação de bactérias;
3.	Preparar células para etapas seguintes das técnicas 	histológicas;
4. Aumentar a afinidade das estruturas celulares pelos 	corantes usados na microscopia óptica 
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Existe pouco conteúdo dentro das
células que impedem a passagem da
luz, assim células fixadas e
seccionadas vistas ao Microscópio
Óptico são transparentes, com exceção:
células vegetais – cloroplastos
Célula animal – hemácias
Uma maneira de tornar as células
visíveis é a utilização de corantes!!!
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“Diferentes componentes celulares podem ser seletivamente corados” 
“A coloração acentua a absorção de luz pelo material”
 
Corantes - moléculas orgânicas que apresentam em sua estrutura duplas ou triplas ligações, as quais interagem com a luz dotando os corpos de capacidades absortivas: Grupo Cromofórico.
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Corantes Ácidos = aniônicos (Eosina, Orange G, Fucsina):
Grupo iônico carregado negativamente;
Liga-se a moléculas básicas (+);
Ex: Proteínas ricas em aa básicos (NH2)
Eosina 
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Corantes Básicos = catiônicos (Azul de toluidina, Azul de metileno, Hematoxilina): 
Grupo iônico carregado positivamente;
Liga-se a moléculas ácidas
Ex: radicais fosfato -H2PO4 (DNA e RNA), carboxilas -COOH, Hidroxila –OH, sulfatos –HSO4 
Azul de metileno
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Reações de Acidofilia e Basofilia
Afinidade por corantes ácidos (proteínas básicas citoplasmáticas)  ACIDÓFILAS
Afinidade por corantes básicos (DNA, RNA, glicoproteínas ácidas, Pectatos e polissacarídeos ácidos)  BASÓFILAS
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Células de Allium cepa coradas com Azul de Metileno.
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OS MÉTODOS DE COLORAÇÃO PODEM SER GERAIS OU CITOQUÍMICOS
 
 
COLORAÇÃO GERAL
 
 Os métodos gerais são aqueles cujo pH final da solução permite a coloração de uma ampla gama de substratos, não havendo possibilidade de se quantificar os compostos corados. 
Ex.: Hematoxilina e Eosina
 
 
COLORAÇÃO CITOQUÍMICA
 
Os métodos citoquímicos apresentam alta especificidade para seus substratos, havendo técnicas que permitem a quantificação destes após a coloração. Ex. Corantes citoquímicos:  
Ex. Azul de Tuluidina e Xylidine Ponceau
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FRACIONAMENTO CELULAR
 
 
“POR CENTRIFUGAÇÃO É POSSÍVEL OBTER ORGANELAS CELULARES EM ESTADO DE PUREZA E, EM SEGUIDA ESTUDAR SUAS PROPRIEDADES QUÍMICAS, FÍSICAS E BIOLÓGICAS”
 
CENTRIFUGAÇÃO FRACIONADA – Consiste de uma série de centrifugações a velocidades crescentes.  
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Etapas:
1.Homogeneização do tecido;
2. Centrifugação fracionada;
O isolamento da organela depende de seu COEFICIENTE DE SEDIMENTAÇÃO (Tamanho, forma e densidade)
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O isolamento da organela ocorre por DIFERENÇAS DE DENSIDADE
Força centrífuga das partícula
X
Concentração local do gradiente
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Citoquímica / Histoquímica
“COMPREENDE TÉCNICAS DIVERSAS PARA A IDENTIFICAÇÃO E LOCALIZAÇÃO DAS MOLÉCULAS QUE CONSTITUEM AS CÉLULAS”
·       Proteínas;
·       Ácidos Nucléicos;
·       Polissacarídeos;
·       Lipídeos;
·       Íons (Ex. Ca+2);
·       Enzimas;
 
Métodos Especiais de Estudo
Deve ser:
Específicas - Reações químicas só deve ocorrer com o componente pesquisado;
Sensível - Capaz de detectar quantidades muito pequenas do componente;
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Citoquímica / Histoquímica
Para se localizar uma determinada substância, a reação citoquímica deve resultar:
 
 
As reações citoquímicas podem ser mediadas por:
Interações Eletrostáticas;
Ligações Covalentes;
Interações Hidrofóbicas;
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REAÇÃO DE P.A.S. ( Periodic Acid Schiff): muito útil na detecção de polissacarídeos neutros (glicogênio, amido e celulose) e de radicais glicídicos de glicoproteínas;
 
A reação de P.A.S. (ácido periódico/reativo de Shiff), também consiste de duas etapas: 
1 Oxidação com ácido periódico, de grupamentos OH vizinhos formando grupamentos aldeídos;
2 Coloração com reativo de Shiff, restaurando o grupo cromofórico e gerando um composto corado (Magenta).
 
Reações Citoquímicas (Ligações Covalentes)
OBS.: a fixação do material não pode ser feita com formaldeído, paraformaldeído e Glutaraldeído. 
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APLICAÇÃO: Fígado (acúmulo de glicogênio); Estômago (camada de revestimento – glicosaminoglicanos); 
Depósito de polissacarídeos nos tecidos = Amiloidoses e outras patologias.
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CITOQUÍMICA ENZIMÁTICA
 
“DETECTA ENZIMAS ASSOCIADAS COM ESTRUTURAS SUBCELULARES”
 
FUNDAMENTO: O método emprega um substrato que é especificamente clivado por uma enzima na célula para liberar um produto, o qual é transformado em um precipitado visível. 
Ex.: A atividade da fosfatase ácida (lisossomos) foi determinado pela incubação das células com -glicerofosfato de sódio e revelada em presença do chumbo fosfato de chumbo, precipitado elétron-denso .
Requisitos: 1.Preservação da integridade molecular
		(Fixadores brandos ou congelamento)
		2. Ambiente de incupação adequado (pH
	 	e temperatura)
 
 
Figura -Micrografia Eletrônica mostrando a localização da enzima fosfatase ácida em lisossomos. 
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 IMUNOCITOQUÍMICA ou IMUNOHISTOQUÍMICA
 
“AS TÉCNICAS IMUNOCITOQUÍMICAS PERMITEM O ESTUDO DA LOCALIZAÇÃO INTRACELULAR DE PROTEÍNAS ESPECÍFICAS”
 
 
É BASEADA NA REAÇÃO: ANTÍGENO - ANTICORPO
ANTÍGENO: Qualquer substância estranha que pode induzir uma resposta imune em um hospedeiro e reage especificamente com anticorpos.
 
ANTICORPO: Proteínas que se ligam fortemente aos seus alvos, sintetizadas pelas células brancas do sangue.
 
 
O complexo antígeno-anticorpo pode ser revelado por meio de marcadores especiais ou sondas (corantes fluorescente, enzimas, esferas de ouro coloidal) e podem se visualizados sob diferentes microscopias.
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PODE SER DE DOIS TIPOS:
 	IMUNOCITOQUÍMICA DIRETA - O anticorpoé marcado por um marcador (sonda), ex.: enzima, proteína.
 	IMUNOCITOQUÍMICA INDIRETA - O anticorpo é marcado por um segundo anticorpo (anticorpo secundário), ao qual será inserido um marcador (sonda).
 
IMUNOCITOQUÍMICA ou IMUNOHISTOQUÍMICA
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IMUNOFLUORESCÊNCIA
 
“QUANDO O COMPOSTO UTILIZADO NA MARCAÇÃO DO ANTICORPO É UM FLUOROCROMO”
 
	 Isotiocianato de Fluoresceína (FITC) – Emite fluorescência VERDE.
 
	 Isotiocianato de Tetrametilrodamina (TRITC) - Emite fluorescência VERMELHA.
 
EQUIPAMENTO UTILIZADO: MICROSCÓPIO DE FLUORESCÊNCIA.
Marcação por fluorescência. Em vermelho: actina; em verde: microtúbulos; em azul: núcleo 
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Aplicações:
 Identificar subpopulações de linfócitos;
 Identificar espécies bacterianas;
 localização de hormônios;
 Detecção complexos ag-ac em doenças auto-imunes
Detecção anticorpos anti-DNA
 Teste qualitativo;
Fc
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 Método cada vez mais utilizado que consiste em cultivar células isoladas fora do organismo onde existe.
 Há dois tipos de cultura celular:
Cultura primária: cultura preparada directamente de tecidos de um organismo, com ou sem passo inicial de fracionamento das células.
Cultura secundária: as células cultivadas foram retiradas de uma cultura primária, elas podem ser repetidamente subcultivadas desta forma, por semanas ou meses.
CULTIVO DE CÉLULAS IN VITRO
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 Exemplos de cultura de células
 Fig. 4 – Células em cultura
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 Placa de cultura
Ao contrário das bactérias, a maior parte das células de tecidos não estão adaptadas para viverem em suspensão e necessitam de uma superfície sólida para crescerem e dividirem-se, que é agora usualmente a superfície plástica de uma placa de cultura de tecidos; 
Certas culturas celulares incluem:
 
 Factores de crescimento + Transferrina
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estimulam a proliferação celular transporta ferro para a célula
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Composição de um Meio Típico Adequado para o Cultivo de Células de Mamíferos
Fig.9 – Tabela de componentes de um meio típico
 Algumas células não crescem nem se diferenciam se a placa não estiver coberta com componentes específicos da matriz extracelular 
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Vantagens da Cultura Celular
Possibilidade de estudar fenómenos,inacessíveis em tecidos intactos; 
Controlo das condições ambientais (pH, temperatura, concentração de O2 e CO2, etc);
Obtenção de células com boa homogeneidade e bem caracterizadas;
Economia de reagentes, tempo, etc.
Conhecimento de comportamento e função de uma população isolada de células;
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Desvantagens da Cultura Celular
Gasto elevado de material; 
Condição de crescimento da cultura; 
Instabilidade de cultura celular;
Perda de características;
Dificuldade de extrapolação para o modelo de organismo intacto.
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Limitações
Necessidade de operadores experientes (com conhecimentos da técnica em condições assépticas, etc);
Perda de características fenotípicas;
Necessidade do uso de marcadores devido à perda de características fenotípicas;
Instabilidade das células (sobretudo em linhas celulares imortais).
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Aplicações gerais da cultura celular
Estudos funcionais;
Ensaio toxicológico;
Desenvolvimento de novos fármacos;
Citogenética (determinação do cariótipo);
Produção de vacinas anti-virais;
Compreensão de fenómenos de neoplasia;
Estudo da Imunologia;
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As células apresentam as propriedades associadas à sua origem com por exemplo células nervosas estabelecem sinapse com outras, células derivadas do musculo esquelético contraem espontaneamente na placa de cultura Citar exemplos:
células derivadas do músculo esquelético embrionário fundem-se para formar fibras musculares gigantes, que contraem espontaneamente na placa de cultura; células nervosas lançam axônios que são electricamente excitáveis e fazem sinapse com outra célula nervosa;
células epiteliais que formam extensas lâminas com muitas das propriedades de um epitélio intacto.
Dadas as condições apropriadas a maior parte das células animais e vegetais poderão viver, multiplicar-se até mesmo expressar propriedades diferenciadas numa placa de cultura de tecidos. As células podem ser observadas num microscópio ou analisadas bioquimicamente e os efeitos da adição ou remoção de moléculas específicas, tais como hormonas ou factores d crescimento, podem ser explorados
Células da pele humana, por exemplo, duram por vários meses em cultura, dividindo-se apenas 50 a 100 vezes antes de morrerem. Tem sido sugerido que este limite de tempo de vida está relacionado com o limite de tempo de vida do animal do qual a célula se derivou.
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A- fibroblastos em cultura
B- mioblastos
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Por foto da placa
Tais células apresentam frequentemente muitas propriedades diferenciadas apropriadas à sua origem:
ex.: fibroblastos que continuam a segregar colagénio; 
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Tabela..dos requerimentos
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