Métodos de Estudo da Célula
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Métodos de Estudo da Célula


DisciplinaTópicos de Biologia Celular e Histologia8 materiais115 seguidores
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Métodos de Estudo da Célula
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
DEPARTAMENTO DE HISTOLOGIA E EMBRIOLOGIA
CITOLOGIA
 Profa. Rosa Valéria S. Amorim
(rosavaleria@ufpe.br)
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\uf03ePreparados Temporários (Estudos de Células Vivas)
	Corantes supravitais;
Ex. Cultura de células e de tecidos (in vitro); Cultivo de protozoários; Células vegetais( películas de folhas); Células em atividade e/ ou em circulação, no organismo de pequenos animais.
 
\uf03ePreparados Permanentes (Células Mortas)
	Fixação e Coloração;
Preparados permanentes... Vantagem! 
Células preservadas melhor demonstração 
(fixadas e coradas) de seus componentes. 
Como as Células podem ser Estudadas?
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Quatro tipos de Microscopia óptica - Imagem de uma célula cultivada de fibroblasto. A) Microscopia de campo-claro. B) Microscopia de contraste de fase; c) Microscopia de contraste de Interferência diferencial; d) Microscopia de campo escuro.
Microscopia Óptico
TIPOS DE MICROSCOPIA
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TIPOS DE MICROSCOPIA
Microscopia Eletrônica 
Microscopia Eletrônica de Transmissão 
Microscopia Eletrônica de Varredura 
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As unidades de medida atualmente usadas em biologia celular e em histologia são as seguintes: 
 
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Técnicas de Coleta
	Existem métodos específicos para coleta de material distintos.
 Decalque ou imprint \u2013 Para visualizar os núcleos de órgãos de consistência mole (fígado, baço, rins);
 Esfregaço: Células livres presentes nos fluidos corpóreos (sangue, linfa, sêmem, líquor, hemolinfa); 
 Espalhamento: Consiste em promover uma raspagem das camadas superficiais das mucosas Ex.: mucosas vaginais ou bucais;
 Montagem total (à fresco ou não): 	Ex.: Órgão inteiro de insetos;
 Corte histológico: cortes extremamente finos (micrômetros) ;
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Preparação de Lâminas Permanentes para a observação em Microscopia de Luz
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Processamento de Material Biológico
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	Fixação do material
 
\u201cA fixação imobiliza os componentes químicos celulares\u201d
 
· Proteínas;
· Ácidos Nucléicos;
· Polissacarídeos;
· Lipídeos
Finalidades:
1. 	Evitar autólise;
2. 	Impedir a atividade e proliferação de bactérias;
3.	Preparar células para etapas seguintes das técnicas 	histológicas;
4. Aumentar a afinidade das estruturas celulares pelos 	corantes usados na microscopia óptica 
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Existe pouco conteúdo dentro das
células que impedem a passagem da
luz, assim células fixadas e
seccionadas vistas ao Microscópio
Óptico são transparentes, com exceção:
células vegetais \u2013 cloroplastos
Célula animal \u2013 hemácias
Uma maneira de tornar as células
visíveis é a utilização de corantes!!!
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\u201cDiferentes componentes celulares podem ser seletivamente corados\u201d 
\u201cA coloração acentua a absorção de luz pelo material\u201d
 
Corantes - moléculas orgânicas que apresentam em sua estrutura duplas ou triplas ligações, as quais interagem com a luz dotando os corpos de capacidades absortivas: Grupo Cromofórico.
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Corantes Ácidos = aniônicos (Eosina, Orange G, Fucsina):
Grupo iônico carregado negativamente;
Liga-se a moléculas básicas (+);
Ex: Proteínas ricas em aa básicos (NH2)
Eosina 
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Corantes Básicos = catiônicos (Azul de toluidina, Azul de metileno, Hematoxilina): 
Grupo iônico carregado positivamente;
Liga-se a moléculas ácidas
Ex: radicais fosfato -H2PO4 (DNA e RNA), carboxilas -COOH, Hidroxila \u2013OH, sulfatos \u2013HSO4 
Azul de metileno
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Reações de Acidofilia e Basofilia
Afinidade por corantes ácidos (proteínas básicas citoplasmáticas) \uf0e0 ACIDÓFILAS
Afinidade por corantes básicos (DNA, RNA, glicoproteínas ácidas, Pectatos e polissacarídeos ácidos) \uf0e0 BASÓFILAS
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Células de Allium cepa coradas com Azul de Metileno.
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OS MÉTODOS DE COLORAÇÃO PODEM SER GERAIS OU CITOQUÍMICOS
 
 
COLORAÇÃO GERAL
 
 Os métodos gerais são aqueles cujo pH final da solução permite a coloração de uma ampla gama de substratos, não havendo possibilidade de se quantificar os compostos corados. 
Ex.: Hematoxilina e Eosina
 
 
COLORAÇÃO CITOQUÍMICA
 
Os métodos citoquímicos apresentam alta especificidade para seus substratos, havendo técnicas que permitem a quantificação destes após a coloração. Ex. Corantes citoquímicos:  
Ex. Azul de Tuluidina e Xylidine Ponceau
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FRACIONAMENTO CELULAR
 
 
\u201cPOR CENTRIFUGAÇÃO É POSSÍVEL OBTER ORGANELAS CELULARES EM ESTADO DE PUREZA E, EM SEGUIDA ESTUDAR SUAS PROPRIEDADES QUÍMICAS, FÍSICAS E BIOLÓGICAS\u201d
 
\uf03fCENTRIFUGAÇÃO FRACIONADA \u2013 Consiste de uma série de centrifugações a velocidades crescentes.  
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Etapas:
1.Homogeneização do tecido;
2. Centrifugação fracionada;
O isolamento da organela depende de seu COEFICIENTE DE SEDIMENTAÇÃO (Tamanho, forma e densidade)
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O isolamento da organela ocorre por DIFERENÇAS DE DENSIDADE
Força centrífuga das partícula
X
Concentração local do gradiente
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Citoquímica / Histoquímica
\u201cCOMPREENDE TÉCNICAS DIVERSAS PARA A IDENTIFICAÇÃO E LOCALIZAÇÃO DAS MOLÉCULAS QUE CONSTITUEM AS CÉLULAS\u201d
·       Proteínas;
·       Ácidos Nucléicos;
·       Polissacarídeos;
·       Lipídeos;
·       Íons (Ex. Ca+2);
·       Enzimas;
 
Métodos Especiais de Estudo
Deve ser:
Específicas - Reações químicas só deve ocorrer com o componente pesquisado;
Sensível - Capaz de detectar quantidades muito pequenas do componente;
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Citoquímica / Histoquímica
Para se localizar uma determinada substância, a reação citoquímica deve resultar:
 
 
As reações citoquímicas podem ser mediadas por:
Interações Eletrostáticas;
Ligações Covalentes;
Interações Hidrofóbicas;
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REAÇÃO DE P.A.S. ( Periodic Acid Schiff): muito útil na detecção de polissacarídeos neutros (glicogênio, amido e celulose) e de radicais glicídicos de glicoproteínas;
 
A reação de P.A.S. (ácido periódico/reativo de Shiff), também consiste de duas etapas: 
1 Oxidação com ácido periódico, de grupamentos OH vizinhos formando grupamentos aldeídos;
2 Coloração com reativo de Shiff, restaurando o grupo cromofórico e gerando um composto corado (Magenta).
 
Reações Citoquímicas (Ligações Covalentes)
OBS.: a fixação do material não pode ser feita com formaldeído, paraformaldeído e Glutaraldeído. 
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APLICAÇÃO: Fígado (acúmulo de glicogênio); Estômago (camada de revestimento \u2013 glicosaminoglicanos); 
Depósito de polissacarídeos nos tecidos = Amiloidoses e outras patologias.
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CITOQUÍMICA ENZIMÁTICA
 
\u201cDETECTA ENZIMAS ASSOCIADAS COM ESTRUTURAS SUBCELULARES\u201d
 
FUNDAMENTO: O método emprega um substrato que é especificamente clivado por uma enzima na célula para liberar um produto, o qual é transformado em um precipitado visível. 
Ex.: A atividade da fosfatase ácida (lisossomos) foi determinado pela incubação das células com \uf062-glicerofosfato de sódio e revelada em presença do chumbo fosfato de chumbo, precipitado elétron-denso .
Requisitos: 1.Preservação da integridade molecular
		(Fixadores brandos ou congelamento)
		2. Ambiente de incupação adequado (pH
	 	e temperatura)
 
 
Figura -Micrografia Eletrônica mostrando a localização da enzima fosfatase ácida em lisossomos. 
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 IMUNOCITOQUÍMICA ou IMUNOHISTOQUÍMICA
 
\u201cAS TÉCNICAS IMUNOCITOQUÍMICAS PERMITEM O ESTUDO DA LOCALIZAÇÃO INTRACELULAR DE PROTEÍNAS ESPECÍFICAS\u201d
 
 
É BASEADA NA REAÇÃO: ANTÍGENO - ANTICORPO
ANTÍGENO: Qualquer substância estranha que pode induzir uma resposta imune em um hospedeiro e reage especificamente com anticorpos.
 
ANTICORPO: Proteínas que se ligam fortemente aos seus alvos, sintetizadas pelas células brancas do sangue.
 
 
O complexo antígeno-anticorpo pode ser revelado por meio de marcadores especiais ou sondas (corantes fluorescente, enzimas, esferas de ouro coloidal) e podem se visualizados sob diferentes microscopias.
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PODE SER DE DOIS TIPOS:
 	\uf03fIMUNOCITOQUÍMICA DIRETA - O anticorpo