Relatório 1 - Tratamento da Enzima e Atividade Enzimática

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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
	FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS	
QBQ0316 N - Bioquímica Experimental
RELATÓRIO 01
Déborah F. Rigo, Nº USP 8021252
Pedro H. S. Medeiros N° USP: 5899281
Tarik K. Andrade N° USP 8072472
Grupo 10
São Paulo, 2013
1.0 Introdução:
As leveduras são fungos unicelulares que têm como principal função para os humanos a fermentação. Mais especificamente a levedura saccharomyces cerevisiae, é usada na fabricação de pães e bebidas alcoólicas, sendo uma das mais antigas aplicações de um microrganismo no cotidiano (1). Seu uso como modelo biotecnológico já é consagrado (2, 5), sendo um organismo robusto para experimentos na área de bioquímica e biologia molecular. 
	
Figura 1: estrutura tridimencional da alfa-glucosidase
	A enzima alpha glucosidase (figura1) é a enzima responsável por hidrolisar dissacarídeos na porção não redutora com ligação alfa, liberando uma alpha glicose (figura2) (3). Ela está presente em diversos organismos, tendo papel, junto a outras enzimas (4, 5), de degradar açúcares complexos em monossacarídeos que possam ser processados na geração de ATP e formação de produtos metabólicos secundários.
 
Figura 2: mecanismo de hidrolise da sacarose
2.0 Objetivos
Prática 1: Romper céluas de Saccharomyces cerevisiae
Prática 2: Dosar colorimetricamente proteínas no lisado de Saccharomyces cerevisiae.
Prática 3: Determinar a atividade da α-glicosidase no lisado de Saccharomyces cerevisiae
Prática 4: Determinar o efeito do pH na atividade catalítica da α-glicosidase.
3.0 Materiais e Métodos
3.1 Prática 1:
	Foi ressuspenso 1g de células da levedura Saccharomyces cerevisiaeem 4 ml de tampão de lise, e em seguida foram adicionados 40 μl de solução de PMSF em etanol 100mM, homogeneizando-se a mistura com o auxílio de um agitador. Adicionou-se pérolas de vidro (aprox. 8mL) e agitou-se a mistura por 1 minuto, seguido de 1 minuto de repouso em banho de gelo. Repetiu-se o ciclo por mais 4 vezes. 
	A mistura foi centrifugada a 850 G por 2 minutos, coletando-se a porção líquida sobrenadante em tubo Falcon identificado como “Lisado”. Ao precipitado sólido foi adicionado mais 4 ml de tampão de lise, 40 μl da solução em etanol 100 mM de PMSF, homogeneizando-se em agitador e centrifugando-se novamente, repetindo–se a adição de PMSF mais duas vezes. Ao fim, recolheu-se a porção líquida e esta foi guardada em freezer a -20ºC. 
3.2 Prática 2:
	Seguindo a tabela 1 da página 3 do protocolo (6) fez-se uma curva de calibração com um tubo de ensaio como branco e 8 tubos de ensaio com concentrações variadas de albumina. Adicionou-se o reagente de Bradford e homogeneizou-se em vórtice.
	Fez-se a diluição do lisado. Seguindo a tabela 3, p.4 (6) fez-se 1 tubo de ensaio com o branco e adicionou-se volumes variados do lisado diluído a outros 4 tubos de ensaio. Estes procederam para a leitura de absorbância a 595nm.
3.3 Prática 3:
	Mantendo-se sempre os tubos de ensaio em gelo, transferiu-se 0,2 ml do lisado para um tubo identificado como L10X, adicionou-se 1,8 ml de água destilada para completar 2ml e homogeneizou-se levemente; transferiu-se então 0,4mL do L10X para outro tubo identificado como L50X, adicionando-se em seguida 1,4mL de água destilada, seguida de leve homogeneização; para a última diluição transferiu-se 0,2mL do L50X para mais um tubo identificado como L500X adicionando-se então 1,8mL de água destilada, novamente homogeneizando a mistura.
Feitas as diluições, deu-se prosseguimento, seguindo a tabela 1 na página 6 do protocolo (6), para as incubações com as devidas triplicatas. Para cada diluição foram preparadas suas triplicatas e a cada uma delas foi adicionada 0,1ml do substrato, 0,1ml do tampão fosfato e 0,2ml do lisado diluído. Após os tempos de incubação determinados no banho a 30ºC, adicionou-se 2ml do tampão carbonato/bicarbonato (pH11) para interromper a reação enzimática. 
Após agitação manual, prosseguiu-se para a preparação da microplaca de 96 poços; onde cada poço foi preenchido com 100μl de solução de acordo com o diagrama 1 abaixo. A microplaca foi então levada para leitura a 405nm.
Diagrama 1 – Disposição das diluições na Microplaca
3.4 Prática 4:
Para este procedimento, utilizou-se a diluição L50X. Para a determinação da atividade enzimática da NPαGlc, foram preparados conjuntos de 4 tubos de ensaio para cada um dos tampões, seguindo a tabela 1, p.8 (6) do protocolo. Adicionando primeiro a enzima, seguida do lisado diluído, e mantendo os tubos incubados em banho a 30º por diferentes períodos de tempo. Após serem retirados do banho, a reação enzimática em cada tubo era interrompida pela adição de 2ml de tampão carbonato-bicarbonato. 
Depois de recuperados todos os tubos, preparou-se outra microplaca, com adição de 100ml de solução a cada poço de acordo com o diagrama 2 abaixo. Esta placa então prosseguiu para a leitura das absorbâncias a 405nm.
Diagrama 2 - Disposição das diluições na microplaca
4.0 Resultados e Discussão
4.1 Resultados:
4.1.1 Prática 2: Os resultados da leitura de absorbância a 595nm(A595) estão dispostos na tabela 1 abaixo.
Tabela 1 - Absorbâncias a 595nm e respectivas massas de proteína
	Amostra
	Massa de Proteína
	Absorbância
	1
	2000
	0,1257
	2
	4000
	0,175
	3
	6000
	0,2653
	4
	8000
	0,2697
	5
	10000
	0,3043
	6
	12000
	0,3686
	7
	14000
	0,3855
	8
	16000
	0,5193
	A1
	---------
	0,8664
	A2
	---------
	0,6249
	A3
	15,06882591
	0,4514
	A4
	10,22267206
	0,3317
4.1.2 Prática 3: Os resultados das leituras da microplaca do diagrama 1 a 405nm estão apresentadas na tabela 2 abaixo:
Tabela 2 - Leitura das absorbâncias dos poços da microplaca a 405nm
	Diluição
	Tubos
	Réplica 1
	Réplica 2
	Réplica 3
	Média
	L10X
	Tubo 1
	2,066
	1,221
	1,488
	1,592
	L10X
	Tubo 2
	2,668
	1,299
	1,738
	1,902
	L10X
	Tubo 3
	2,592
	2,448
	2,848
	2,629
	L10X
	Tubo 4
	3,121
	2,532
	2,805
	2,819
	L50X
	Tubo 1
	0,301
	0,240
	0,317
	0,286
	L50X
	Tubo 2
	0,611
	0,364
	0,521
	0,499
	L50X
	Tubo 3
	1,139
	0,905
	0,970
	1,005
	L50X
	Tubo 4
	1,795
	1,504
	1,097
	1,465
	L500X
	Tubo 1
	0,062
	0,066
	0,075
	0,068
	L500X
	Tubo 2
	0,085
	0,119
	0,096
	0,100
	L500X
	Tubo 3
	0,058
	0,041
	0,034
	0,044
	L500X
	Tubo 4
	0,233
	0,210
	0,208
	20,217
	Branco do
Substrato
	----------
	0,048
	0,030
	0,043
	0,040
	Branco L10X
	----------
	0,082
	0,080
	0,095
	0,086
	Branco L50X
	----------
	0,047
	0,064
	0,056
	0,056
	Branco L500X
	----------
	0,044
	0,065
	0,062
	0,057
4.1.3 Prática 4: Os resultados das leituras da microplaca do diagrama 2 a 405nm estão apresentadas na tabela 3 abaixo:
Tabela 3 - Leitura das absorbâncias dos poços da microplaca a 405nm
	pH
	Tubo
	Réplica 1
	Réplica 2
	Réplica 3
	Média
	Média pH
	pH4
	Tubo 1
	0,128
	0,103
	0,095
	0,108
	0,124
	pH4
	Tubo 2
	0,098
	0,157
	0,163
	0,139
	
	pH4
	Tubo 3
	0,118
	0,119
	0,134
	0,123
	
	pH4
	Tubo 4
	0,125
	0,127
	0,130
	0,127
	
	pH5
	Tubo 1
	1,804
	1,386
	1,740
	1,772
	2,586
	pH5
	Tubo 2
	2,742
	2,489
	2,759
	2,663
	
	pH5
	Tubo 3
	3,111
	2,954
	3,113
	3,059
	
	pH5
	Tubo 4
	2,724
	2,829
	3,005
	2,852
	
	pH6
	Tubo 1
	1,377
	2,720
	2,972
	2,356
	2,549
	pH6
	Tubo 2
	2,792
	2,692
	2,525
	2,669
	
	pH6
	Tubo 3
	2,538
	2,181
	2,562
	2,427
	
	pH6
	Tubo 4
	2,727
	2,096
	2,759
	2,743
	
	pH8
	Tubo 1
	2,213
	2,079
	2,268
	2,186
	2,418
	pH8
	Tubo 2
	3,046
	2,794
	2,648
	2,829
	
	pH8
	Tubo 3
	1,068
	2,682
	2,616
	2,122
	
	pH8
	Tubo 4
	2,645
	2,470
	2,495
	2,536
	
	pH9
	Tubo 1
	0,175
	0,297
	0,321
	0,264
	0,261
	pH9
	Tubo 2
	0,256
	0,255
	0,278
	0,263
	
	pH9
	Tubo 3
	0,234
	0,281
	0,287
	0,267
	
	pH9
	Tubo 4
	0,240
	0,245
	0,265
	0,250
	
	Branco
	----------
	0,047
	0,0490,050
	0,048
	0,053
	Branco
	----------
	0,052
	0,053
	0,077
	0,060
	
	Branco
	----------
	0,053
	0,061
	0,049
	0,054
	
	Branco
	----------
	0,054
	0,046
	0,053
	0,051
	
4.2 Discussão:
4.2.1 Prática 1:
	Ao executar a lise celular da levedura Saccharomyces cerevisiae, expõem-se os componentes internos à célula ao meio externo e põem-se em contato diversas substâncias que estariam a princípio separadas em diversas organelas e compartimentos. Como é de nosso interesse preservar certos elementos, foi necessário tomar certas medidas.
	A primeira delas foi a adição de PMSF ao lisado. PMSF é um inibidor de proteases(7), mais especificamente um inibidor de proteases de serina. Este inibidor impede que as proteases clivem as proteínas que irão ser analisadas após a lise. Por fim, o lisado foi mantido em gelo para tanto diminuir a atividade de enzimas que não são inibidas pelo PMSF, como para impedir a desnaturação das enzimas de interesse analítico. Abre-se ainda a possibilidade de frear a atividade de possíveis contaminantes que possam se aproveitar dos nutrientes disponíveis
	O sucesso e validade do experimento pode ser inferido com base nas medidas analíticas das práticas seguintes. No entanto, para uma maior certeza a respeito de sua eficiência quanto à quão disponível os compostos de interesse se tornaram e qual a real efetividade do uso do PMSF e da manutenção do mesmo congelado, seriam necessárias repetições do mesmo com um estoque uniforme de leveduras.
4.2.2 Prática 2:
Ao relacionar os dados obtidos com a curva padrão, notou-se que apenas 2 deles encaixavam-se no intervalo da mesma. Descartaram-se então os resultados que não estavam dentro da curva e relacionou-se as suas absorbâncias a uma concentração de proteínas em mg/ml e determinou-se a média dos dois resultados. 
Foi feita uma observação por parte dos professores que a amostragem de proteínas estaria abaixo do normal para a quantidade de células lisadas. Essa variação, no entanto, pode ter origem na própria variabilidade da população da qual a amostra foi retirada ou ser fruto de algum erro metodológico no procedimento de lise, porém, como não há uma média estabelecida para a amostra utilizada pelos diversos grupos e os resultados estavam dentro da curva de calibração, não há porque invalidá-los.
4.2.3 Prática 3:
	*As medidas realizadas para as práticas 3 e 4 utilizando nosso lisado extrapolaram a curva de calibração, impossibilitando a utilização dos dados. Para fins de exercício de análise de dados foram utilizados dados de outro grupo.
Foram tirados medidas de branco da enzima e do substrato pois no meio reacional complexo vários constituintes que absorvam o mesmo comprimento de onda. Dessa maneira, o branco da enzima e do substrato somados deve ser retirado dos resultados experimentais.
	Nos dados analisados, a diluição de 50X adequou-se à curva de calibração da concentração de NPαGlc(y=0,0049x + 0,014) e foi utilizada para medição de proteínas. As demais curvas, de 10X e 500X apresentam distorções importantes que podem prejudicar a análise, como dados fora da curva de calibração e um R2 baixo, indicando pouca linearidade.
	Calculando então o coeficiente angular do gráfico, resultando em um valor equivalente de um e adequando-o às diluições executadas, temos os seguinte resultados para atividades enzimáticas: 
4.2.4 Prática 4:
	Na prática quatro foram feitos ensaios enzimáticos semelhantes à prática 3 em diversos pHs.
	Os resultados observados revelam uma maior atividade em uma faixa de pH de 5 a 8. Há pouca diferença entretanto entre as medições relativas a estes pHs, o que impossibilita a afirmação de qual pH medido está mais próximo àquele de ótima atividade da enzima. As referências desta enzima em sua versão comercial, no entanto (8) revela pHs que giram em torno de 6,8 para certos tipos de alpha glucosidades comerciais de Saccharomyces cerevisiae.
Conclusões
Prática 1:
As células foram rompidas com sucesso, possibilitando o uso do lisado para análises posteriores nas práticas seguintes no nível de quantificação de proteínas e ação das enzimas.
Prática 2:
A curva padrão de albumina com Bradford mostrou-se válida no modelo, possibilitando a estimativa da quantidade de proteínas no interior das células
Prática 3:
A alpha-glicosidase analisada mostrou-se presente no nosso lisado e sua atividade foi constatada por meio da adição de seu substrato.
Prática 4:
O pH ótimo pode ser estimado analisando-se a atividade da enzima em diferentes pHs e, com a ajuda da literatura, estima-se que seja por volta de 6, apesar de, em nossos testes, a atividade ótima não poder ser estimada com precisão. 
Referências
LEGRAS, JL; MERDINOGLU, D; CORNUET, J-M; KARST, F. Bread, beer and wine: Saccharomyces cerevisiae diversity reflects human history. Molecular Ecology 16. 2007. p.2091–2102.
Ostergaard, S; Olsson, L; Nielsen, J. Metabolic Engineering of Saccharomyces cerevisiae. Microbiology and Molecular Biology Reviews. Vol. 64, n.10. 2000. p. 34–50.
ExPASy – Bioinformatics Resource Portal. Aplha-Glucosidase. Disponível em: http://enzyme.expasy.org/EC/3.2.1.20. Acesso em 14/09/2013.
DEZSO, Z; OLTVAI, Z.N.; BARABÁSI, A-L. Bioinformatics Analysis of Experimentally Determined Protein Complexes in the Yeast Saccharomyces cerevisiae. Department of Physics, University of Notre Dame, Notre Dame.
KARATHIA, H; VILAPRYNIO, E; SORRIBAS, A; ALVES, R. Saccharomyces cerevisiae as a Model Organism: A Comparative Study. PLoS ONE Vol. 6, n.2. 2011.
Carlos Hotta Lab. Apostila de Exercícios. Disponível em: http://www.carloshotta.com.br/storage/2013_qbq0316n/apostila_protocolos_Bioq_Exp.pdf. Acesso em 13/09/2013
GÁRCIA-CARREÑO, FL. Protease inhibition in theory and pratice.Biotechnology Education 3. 4. 1992. p 145-150
Alpha-Glusidase de Saccharomyces cerevisiae comercial: disponível em: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g5003?lang=pt&region=BR.
Acesso em 13/09/2013
7.0 Anexo: Questões complementares
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1. A concentração de proteínas no lisado (mg/ml) e a quantidade total de proteínas obtidas (mg). Para obter esta informação será necessário calcular: 
a) Plotar a curva padrão da concentração de proteína pela Abs595nm:
Figura 3: gráfico plotado com a curva padrão obtida e a concentração das amostras.
b) Calcular a equação da reta para o gráfico plotado:
Equação da reta: y = 2*10^-5x + 0,0792
Tabela 1: valores utilizados na curva padrão (1 à 8) e valores obtidos a partir da medição das amostras (A1 à A4)
c) A concentração de proteínas (mg/ml) no L100X:
A diluição utilizada foi L20X, pois nosso lisado apresenta menor concentração de enzimas do que o esperado.
Como foi demonstrado no gráfico e na tabela de resultados nossa curva padrão abrange resultados entre 0,1257 e 0,5193. Portanto podemos utilizar apenas dois dos valores obtidos da medição das amostras (A3 e A4).
Concentração no L20X = 12,645748985mg (média das massas válidas) / 1,1mL(volume) = 11,4961354409mg/ml
d) A concentração de proteínas (mg/ml) no lisado inicial:
CV(inicial)=CV(final) → 11,4961354409/1,1 * 1,1= C(inicial) 15mL → C(inicial) = 0,7664090294mg/mL
2. A concentração da atividade enzimática (mU/ml) e no lisado em pH 7,0. Para obter esta informação será necessário calcular:
a) Converter a Abs420nm em concentração de NPαGlc (mM)
A tabela a seguir mostra as absorções em 405nm e as concentrações da α-glucosidase nos quatro tubos em pH7, foi utilizado o lisado diluído em 50X:
	
	Absorção em 420nm
	Branco
	Concentração(mMol)
	Tubo 1
	0,317
	0,056
	5,538*10^-5
	Tubo 2
	0,521
	
	9,885*10^-5
	Tubo 3
	0,97
	
	2,021*10^-4
	Tubo 4
	1,097
	
	2,960*10^-4
b) Plotar um gráfico com a concentração de NPαGlc (mM) pelo tempo para cada concentração de lisado.
c) Calcular a equação da reta para o gráfico plotado 
L10X - y = 17.992x + 208.47
L50X - y = 16.502x - 43.187L500X - y = 1.5959x - 1.0154
	
d) Utilizar a equação da reta para calcular a atividade enzimática (mU) de cada concentração de lisado.
	Utilizando o coeficiente angular da reta e lembrando que foi utilizado 0,4 mL de lisado, tem-se que a atividade enzimática do gráfico de diluição 50X foi de 41,255 mU
e) Calcular a concentração da atividade enzimática (mU/ml) do lisado original, não se esqueça de corrigir pela diluição.
	Retirando-se o efeito da diluição (50X), temos que que a atividade enzimática do lisado original utilizado para análise era de 2062,75 mU.
f) Calcular a atividade específica do lisado (mU/mg)
	Levando-se em conta que foi utilizado 0,4 mL do lisado, sendo a contração do lisado 0,7664090294mg de proteínas/mL, temos que a atividade específica é: 6732 um/mg
3. O gráfico com a concentração a atividade enzimática (mU/ml) em diversos pH. Para obter esta informação será necessário calcular:
a) Converter a Abs420nm em concentração de NPαGlc para cada pH.
pH 4:
	
	Concentração (nmol/ml)
	Atividade enzimática (mU)
	Tubo 1
	19,319
	0,164
	Tubo 2
	25,578
	
	Tubo 3
	22,380
	
	Tubo 4
	23,129
	
pH 5:
	
	Concentração (nmol/ml)
	Atividade enzimática (mU)
	Tubo 1
	358,775
	14,849
	Tubo 2
	540,680
	
	Tubo 3
	621,496
	
	Tubo 4
	579,319
	
pH 6:
	
	Concentração (nmol/ml)
	Atividade enzimática (mU)
	Tubo 1
	478,027
	0,374
	Tubo 2
	541,972
	
	Tubo 3
	492,448
	
	Tubo 4
	556,938
	
pH 8:
	
	Concentração (nmol/ml)
	Atividade enzimática (mU)
	Tubo 1
	443,401
	1,398
	Tubo 2
	574, 557
	
	Tubo 3
	430,204
	
	Tubo 4
	514,829
	
pH 9:
	
	Concentração (nmol/ml)
	Atividade enzimática (mU)
	Tubo 1
	51,088
	0,157
	Tubo 2
	50,816
	
	Tubo 3
	51,700
	
	Tubo 4
	48,163
	
b) Plotar o gráfico do aumento da concentração de NPαGlc ao longo do tempo para cada pH.
c) Calcular a equação da reta para o gráfico plotado 
	pH4 - y = 0.1646x + 20.544
	pH5 - y = 14.849x + 339.46
	pH6 - y = 3.7442x + 470.54
	pH8 - y = 1.3986x + 473.27
	pH11 - y = -0.1578x + 52.415
d) Utilizar a equação da reta para calcular a atividade enzimática em cada pH
pH4 = 0,164
pH5 = 14,849
pH6 = 3,744
pH8 = 1,398
pH11 = -0,157
	
e) Calcular a atividade enzimática relativa em cada pH. A atividade enzimática relativa é a porcentagem da atividade enzimática em cada pH em relação à maior atividade enzimática observada (incluir as medidas da P3 em pH 7,0 na análise).
	pH4 = 1,104%
	pH5 = 100%
	pH6 = 25,213%
	pH8 = 9,414%
	pH11 = 1,057%
	
f) Plotar um gráfico com a atividade enzimática relativa pelo pH do tampão
Além disso, o relatório deverá conter as respostas das seguintes perguntas: 
a) Qual a razão de se manter o lisado em gelo?
Sabe-se que as reações enzimáticas apresentam uma faixa ótima de ação, sabe-se também que ao lisar-se uma célula as enzimas de apoptose celular são ativadas e essas por sua vez “destroem” as demais enzimas, e para que isso não ocorra nós retiramos as enzimas de apoptose de sua faixa de atuação para que possamos extrair a enzima desejada. O gelo então é utilizado para manter a atividade enzimática reduzida. 
Por que foi adicionado 100 mM PMSF ao tampão de lise?
O PMSF é largamente utilizado como Inibidor enzimático que inativa as enzimas de apoptose.
Disponível em: http://www.lookfordiagnosis.com/mesh_info.php?term=Fluoreto+De+Fenilmetilsulfonil&lang=3. Acesso 17/09/2013
c) Qual é a razão de se usar um branco ao utilizar o espectrofotômetro?
	O branco é importante para que a medida seja relativa somente à concentração de enzimas na amostra e de substrato adicionado à mesma, uma vez que ele tenta retirar o interferente relativo aos demais componentes da solução, impedindo assim que uma condição prévia ao experimento interfira nos resultados.
Por que se utiliza NPαGlc para medir a atividade enzimática da α-glicosidase?
O NPαGlc é um substrato à enzima provavelmente não presente ou não presente em quantidades significativas no lisado. Desta maneira, podemos, portanto, inferir que a atividade detectada por meio da degradação do mesmo corresponde exatamente à ação da α-glicosidase sobre ele. Temos então uma medida confiável.
Qual é a razão de se utilizar um branco do substrato e um branco da enzima?
O branco tem como finalidade minimizar os erros decorrentes da absorção da luz pela solução onde a amostra está contida, porém nesse caso não é a amostra sozinha que nos fornece a medição, ela ainda precisa reagir com o substrato. Para manter então os erros experimentais baixos procura-se subtrair não só a absorção do substrato como também a da amostra de enzimas (Disponível em: http://www.infoescola.com/quimica/espectrofotometria/. Acesso em 17/09/2013).
f) Em qual pH a atividade da enzima deve ser máxima? Como o pH de um tampão pode influenciar na atividade enzimática?
	A atividade máxima da enzima deve ocorrer por volta de pH 5 e 6, conforme foi detectado nas medições. O pH tem influência vital na atividade da enzima pois a forma que esta irá assumir esta ligada à suas cadeias laterais protonadas ou desprotonadas. Dependendo do balanço de cargas de suas cadeias laterais, a enzima assumirá conformações diferentes, podendo afetar seus sítios ativos de maneira quer não mais consigam catalisar a reação.