Mutação e reparo no DNA

Prévia do material em texto

Mutabilidade e reparo no DNA 
Os erros na replicação e as lesões no DNA têm duas consequências: 
- Consiste na alteração permanente do DNA (mutações), que alteram a sequência codificadora 
de um gene ou suas sequências reguladoras. 
- É que algumas alterações químicas no DNA impedem sua utilização como molde para a 
replicação e a transcrição. 
Os efeitos das mutações geralmente se manifestam apenas na progênie da célula na qual a 
alteração da sequência ocorreu, mas as lesões no DNA ou alterações na estrutura do DNA que 
impedem a replicação ou a transcrição podem ter efeitos imediatos no funcionamento e na 
sobrevivência celular. 
O desafio para a célula é duplo. Primeiro, ela deve vasculhar o genoma para detectar erros de 
síntese e lesões no DNA. Segundo, ela deve corrigir as lesões de maneira que, se possível, 
restaure a sequência de DNA original. 
1. Erros de replicação e seu reparo 
1.1 A natureza das mutações: 
As mutações incluem praticamente todas as alterações permanentes concebíveis na sequência 
de DNA. As mutações mais simples são as substituições de uma base por outra. Existem dois 
tipos: 
Transições – que são substituições de uma pirimidina (T com C) por outra, e de uma purina (G 
com A) por outra. 
Transversões – que são substituições de uma pirimidina por uma purina ou vice-versa. 
Outras mutações simples são as inserções ou deleções de um nucleotídeo ou de um número 
reduzido de nucleotídeos. As mutações que alteram um único nucleotídeo são chamadas 
mutações de ponto, ou mutações pontuais. 
Outros tipos de mutações causam alterações mais drásticas no DNA como inserções extensas e 
deleções e rearranjos grosseiros da estrutura cromossômica. Essas alterações podem ser 
causadas, por exemplo, pela inserção de um transposon, que geralmente posiciona vários 
milhares de nucleotídeos de DNA exógenos nas sequências codificadora ou reguladora de um 
gene ou pelas ações aberrantes dos processos de recombinação celular. 
Obs.: Alguns cromossomos têm “hot spots” (pontos quentes) onde mutações ocorrem com 
mais frequência e outros sítios sofrem alterações com menor frequência. 
 Microssatélites de DNA – são sequencias propensas a mutação, tem repetições de sequencias 
simples de di-, tri- ou tetranucleotídeos. 
1.2 Alguns erros de replicação escapam da revisão de leitura: 
A maquinaria de replicação utiliza um mecanismo de revisão de leitura, o componente de 
exonuclease 3’  5’ do replissomo, que remove os nucleotídeos incorporados erroneamente. 
Alguns nucleotídeos erroneamente incorporados escapam da detecção e geram um 
malpareamento entre a fita recém-sintetizada e a fita-molde. Se o nucleotídeo mal 
incorporado não for subsequentemente detectado e substituído, a alteração de sequências se 
tornará permanente no genoma: durante um segundo ciclo de replicação, o nucleotídeo mal 
incorporado, agora parte da fita-molde, dirigirá a incorporação de seu nucleotídeo 
complementar na fita recém-sintetizada. A essa altura, o malpareamento não existirá mais; em 
vez disso, ele terá resultado em uma alteração permanente (uma mutação) na sequência de 
DNA. 
1.3 O reparo de malpareamentos remove os erros que escapam da revisão de leitura: 
Existe um mecanismo para detectar os malpareamentos e corrigi-los. 
A responsabilidade final da fidelidade da replicação do DNA se apoia nesse sistema de reparo 
de malpareamentos, o qual aumenta a precisão da síntese de DNA em duas ou três ordens de 
magnitude adicionais. O sistema de reparo encontra dois desafios. Primeiro, ele deve verificar 
o genoma por malpareamentos. Como os malpareamentos são temporários, ou seja, eles 
desaparecem no ciclo de replicação subsequente, quando resultam em mutações, o sistema de 
reparo deve encontrar e reparar logo os malpareamentos. Segundo, o sistema deve corrigir o 
malpareamento de maneira precisa, ou seja, ele deve substituir o nucleotídeo erroneamente 
incorporado da fita recém-sintetizada e não o nucleotídeo correto da fita parental. 
Em Escherichia coli, os malpareamentos são detectados por um dímero da proteína de reparo 
de malpareamento MutS. A chave para a especificidade de MutS é que o DNA que contém um 
malpareamento pode ser muito mais facilmente torcido do que o DNA corretamente pareado. 
Então a MutS reconhece essa distorção no esqueleto do DNA que esta malpareado e induz 
uma acentuada dobra no DNA e uma alteração conformacional na própria MutS. Esse 
complexo de MutS e DNA que contém o malpareamento recruta MutL, uma segunda proteína 
que compõe o sistema de reparo. A MutL ativa MutH, uma enzima que promove uma quebra 
em uma das fitas, próximo ao sítio do malpareamento. A clivagem é seguida pela ação de uma 
helicase específica (UvrD) e de uma de três exonucleases. A helicase desenrola o DNA, 
começando pela incisão e movendo-se na direção do sítio de malpareamento, e a exonuclease 
digere progressivamente a fita simples deslocada, estendendo para além do sítio do 
nucleotídeo malpareado. Essa ação produz uma lacuna de fitas simples, que é, a seguir, 
preenchida pela DNA-polimerase III (Pol III) e fechada pela DNA-ligase. O efeito geral é a 
remoção do malpareamento e sua substituição pelo nucleotídeo que forma corretamente o 
par de bases. 
A enzima de E. coli Dam metilase metila resíduos A em ambas as fitas da sequência 5’-GATC-3’. 
A sequência GATC é amplamente distribuída ao longo de todo genoma e todos os sítios são 
metilados pela Dam metilase. O que acontece basicamente é que a fita parental/molde possui 
todos esses sítios metilados enquanto a fita filha é hemimetilada (não possui todos esses sítios 
metilados). Então essa situação meio que funciona como uma marcação (pois a fita recém-
sintetizada não possui o grupo metil) e, portanto, pode ser reconhecida como a fita para o 
reparo. 
A proteína MutH que se liga aos sítios hemimetilados, mas sua endonuclease está 
normalmente latente. A MutH só funciona quando em contato com MutS e MutL, posicionadas 
em um malpareamento próximo. Uma vez ativada, MutH cliva seletivamente a fita não 
metilada, de maneira que apenas o DNA recém-sintetizado nas proximidades do 
malpareamento seja removido e substituído. A metilação é, portanto, um dispositivo de 
“memória”, que possibilita que o sistema de reparo de E. coli encontre a sequência correta a 
partir da fita parental, caso tenha sido cometido um erro durante a replicação. 
Exonuclease I – degrada DNA na direção 3’  5’ 
Exonuclease VII – degrada o DNA na direção 5’  3’ 
As células eucarióticas apresentam proteínas homólogas a MutS (chamadas proteínas MSH 
para “homólogas da MutS”) e MutL (Chamada MLH e PMS) para corrigir malpareamentos. Na 
verdade, os eucariotos apresentam diversas proteínas semelhantes à MutS, com 
especificidades diferentes. 
As células eucarióticas não têm MutH e nem usa a hemimetilação para marcar a fita parental, 
encontrados em E. coli. 
Em eucariotos, não se sabe ao certo como a maquinaria de reparo de mal-pareamento 
distingue as duas fitas de DNA. No entanto, há evidencias de que as novas fitas de DNA recém-
replicadas – tanto a líder como a retardada – são clivadas preferencialmente, e parece que 
essas quebras (quebras de fita simples) fornecem o sinal que direciona o sistema de reparo de 
malpareamento a fita adequada. 
2. Lesões no DNA 
2.1 O DNA sofre lesões espontâneas por hidrólise e por desaminação: 
As mutações não surgem apenas por erros na replicação, mas também por lesões no DNA. 
Algumas lesões são causadas, como será visto, por fatores ambientais, como radiação e os 
agentes químicos (agentes mutagênicos) e também por ação da água. 
O tipo mais frequente e importante de lesões hidrolítica é a desaminação da base citosina. Sob 
condições fisiológicasnormais, a citosina sofre desaminação espontânea, originando a base 
que não é natural (no DNA), a uracila. A adenina e a guanina também estão sujeitas a 
desaminação espontânea. A desaminação converte a adenina em hipoxantina, que faz ligações 
de hidrogênio com a citosina, em vez da timina; a guanina é convertida em xantina, que 
continua a parear com a citosina, embora apenas por duas ligações de hidrogênio. O DNA 
também sofre depurinacação pela hidrólise espontânea da ligação N-glicosílica, e isso produz 
um sítio abásico no DNA. 
Obs.: Se o DNA possuísse naturalmente a uracila, em vez de timina, a desaminação da citosina 
produziria uma base natural, dificilmente reconhecida pelos sistemas de reparo. 
2.2 O DNA é danificado por alquilação, oxidação e radiação: 
O DNA é vulnerável a danos por alquilição, oxidação e radiação. Na alquilação, grupos metil ou 
etil são transferidos aos sítios reativos das bases e aos fosfatos no esqueleto do DNA. 
O DNA também está sujeito ao ataque por espécies reativas de oxigênio. Esses agentes 
oxidantes potentes são gerados por radiação ionizante e por agentes químicos que produzem 
radicais livres. A mutação que oxida a guanina e gera oxoG é a mais comum encontrada nos 
cânceres humanos. Assim, talvez os efeitos carcinogênicos da radiação ionizante e dos agentes 
oxidantes sejam parcialmente causados pelos radicais livres que convertem guanina em oxoG. 
Há, ainda, outro tipo de lesão de bases provocado pela luz ultravioleta. A radiação com 
comprimento de onda de cerca de 260 nm é intensamente absorvida pelas bases, e uma 
consequência disso é a fusão fotoquímica de duas pirimidinas em posições adjacentes na 
mesma cadeia polinucleotídica. 
A radiação Y e os raios X (radiação ionizante) são particularmente perigosas, porque provocam 
quebras na dupla-fita do DNA, as quais são difíceis de corrigir. Se estas fitas quebradas não 
forem corrigidas, as quebras de dupla-fita poderão ser letais para as células. 
2.3 As mutações também são causadas por análogos de base e agentes intercalantes: 
As mutações também são causadas por compostos que substituem as bases normais (análogos 
de base) ou se inserem entre as bases (agentes intercalantes), provocando erros na 
replicação. Os análogos de base são estruturalmente semelhantes às bases corretas, mas 
diferem em determinadas maneiras que os tornam prejudiciais às células. Portanto, os 
análogos de base são semelhantes o suficiente para serem absorvidos pelas células, 
convertidos em nucleosídeos trifosfatados e incorporados ao DNA durante a replicação. No 
entanto, devido ás diferenças estruturais entre esses análogos e as bases corretas, os análogos 
realizam um pareamento de bases errôneo, levando a erros frequentes durante a replicação. 
Como os agentes intercalantes provocam pequenas inserções ou deleções? Uma possibilidade 
no caso de inserções é que, por deslizarem entre as bases na fita-molde, esses agentes 
mutangênicos façam a DNA-polimerase inserir um nucleotídeo extra oposto à posição da 
molécula intercalada. (Quando intercaladas, estas moléculas aproximadamente duplicam o 
espaço entre duas bases.) Ao contrário, no caso de deleções, a distorção do molde causada 
pela presença de uma molécula intercalada pode fazer a polimerase “pular” um nucleotídeo. 
3. Reparo e tolerância de lesões no DNA 
As lesões no DNA podem apresentar duas consequências. Alguns tipos de lesões, como os 
dímeros de timina ou quebras no esqueleto do DNA, criam impedimentos para a replicação e a 
transcrição. Outros tipos de lesões criam bases alteradas que não apresentam consequência 
estrutural imediata para a replicação, mas provocam malpareamentos; estes por sua vez, 
resultam na alteração permanente da sequência de DNA após a replicação. 
 
Agora serão abordados os sistemas de reparo de malpareamnetos que corrige estes 
malpareamentos ocorridos durante a replicação. No mais direto desses sistemas (que 
representa um reparo verdadeiro), uma enzima de reparo simplesmente reverte (desfaz) a 
lesão. Um sistema mais elaborado é o reparo por excisão, no qual o nucleotídeo danificado 
não é corrigido, mas sim removido do DNA. Nos sistemas de reparo por excisão, a outra fita, 
que não foi danificada, serve como molde para a reincorporação do nucleotídeo correto pela 
DNA-polimerase. Como será visto, existem dois tipos de reparo por excisão, um que envolve a 
remoção apenas do nucleotídeo danificado e o outro, a remoção de um pequeno segmento de 
DNA de fita simples que contém a lesão. 
Ainda mais sofisticado é o reparo por recombinação, que é utilizado quando ambas as fitas 
estão danificadas, como acontece quando o DNA é quebrado. Nessa situação, uma fita não 
pode servir de molde para o reparo da outra. Por isso, no reparo por recombinação (reparo de 
quebras na dupla-fita), a informação da sequência é extraída de uma segunda cópia, não 
danificada, do cromossomo. 
3.1 Reversão direta da lesão no DNA: 
Um exemplo de reparo pela simples reversão da lesão é a fotorreativação. 
A fotorreativação reverte diretamente a formação dos dímeros de pirimidinas que resultam da 
irradiação ultravioleta. Na fotorreativação, a enzima DNA-fotoliase captura a energia luminosa 
e a utiliza para quebrar as ligações covalentes que ligam as duas pirimidinas adjacentes. Em 
outras palavras, as bases danificadas são corrigidas diretamente. 
Remoção de grupo metil. A metiltranferase catalisa a transferência do grupo metil da O6-
metilguanina para um resíduo de cisteína da enzima, restaurando a base G normal no DNA. 
3.2 As enzimas de reparo por excisão de bases removem as bases danificadas por um 
mecanismo de deslocamento: 
No reparo por excisão de bases, uma enzima chamada glicosilase reconhece e remove a base 
danificada pela hidrólise da ligação glicosídica. O açúcar abásico resultante é removido do 
esqueleto de DNA em uma etapa posterior endonucleolítica. A clivagem endonucleolítica 
também remove açucares apurínicos ou apirimidínicos que surgem pela hidrólise espontânea. 
Após a remoção completa do nucleotídeo danificado do esqueleto, uma DNA-polimerase de 
reparo e a DNA-ligase restabelecem uma fita intacta usando a fita não danificada como molde. 
A retirada de bases danificadas do genoma é um problema extraordinário, porque as bases 
estão localizadas na parte interna da hélice de DNA. Como a DNA-glicosilase detecta as bases 
danificadas ao verificar o genoma? As evidencias indicam que essas enzimas se difundem 
lateralmente ao longo da fenda menor do DNA até que um tipo específico de lesão seja 
detectado. 
3.3 As enzimas de reparo por excisão de nucleotídeos clivam o DNA danificado em ambos os 
lados da lesão: 
Ao contrário do reparo por excisão de bases, as enzimas de reparo por excisão de nucleotídeos 
não reconhecem uma lesão em particular. Em vez disso, esse sistema utiliza o reconhecimento 
de distorções causadas por um dímero de timinas ou pela presença de um aduto químico 
volumoso sobre uma base. Essas distorções desencadeiam uma série de eventos que levam à 
remoção do pequeno segmento de fita simples que inclui a lesão. Essa remoção origina uma 
lacuna de fita não danificada como molde, restaurando, desta forma, a sequência nucleotídica 
original. 
O reparo por excisão de nucleotídeos na E. coli é realizado basicamente por quatro proteínas: 
UvrA, UvrB, UvrC e UvrD. 
 
 
UVR são necessárias para corrigir as lesões provocadas pela luz ultravioleta; os mutantes dos 
genes uvr são sensíveis à luz ultravioleta e não são capazes de remover adutos timina-timina e 
timina-citosina. 
Reparo acoplado à transcrição – envolve o recrutamento de proteínas de reparo por excisão 
de nucleotídeos para a RNA-polimerase que se encontra bloqueada. A importânciado reparo 
acoplado à transcrição é que ele concentra enzimas de reparo sobre o DNA (genes) que está 
sendo ativamente transcrito. De fato, a RNA-polimerase atua como outra proteína capaz de 
identificar lesões na célula. 
3.4 A recombinação corrige quebras no DNA recuperando a informação da sequência a partir 
de um DNA não danificado: 
O reparo por excisão utiliza a fita de DNA não danificada como molde para substituir um 
segmento de DNA danificado na outra fita. Como as células reparam as quebras de dupla-fita 
no DNA quando as fitas do dúplex estão quebradas? Isso é feito por vias de reparo de quebra 
de dupla-fita (DSB). 
O tipo de dano mais perigoso é uma quebra do DNA. O reparo de DSB por recombinação é 
uma via que corrige quebras onde a sequência ao longo da quebra é copiada de um dúplex 
diferente, porém, homólogo. Se não houver nenhum molde para a síntese de reparo 
disponível, as quebras no DNA são corrigidas por NHEJ, que une as extremidades, mas de 
maneira sujeita a erro. Se a célula precisar replicar DNA danificado, a síntese translesão 
permite que a célula tolere a lesão. A síntese translesão possibilita que a replicação prossiga 
sobre uma lesão que esteja bloqueando a progressão de uma DNA-polimerase em processo de 
replicação. A síntese translesão é predominantemente difundida de DNA-polimerases, que são 
capazes de realizar a síntese de DNA de uma maneira sujeita a erros e independente do 
pareamento de bases. 
3.5 A síntese de DNA translesão permite que a replicação prossiga pela lesão do DNA: 
Um mecanismo de tolerância de dano ao DNA é a síntese translesão. Esse mecanismo é 
altamente sujeito a erro e, portanto, capaz de introduzir mutações, a síntese translesão poupa 
a célula de um destino pior, causado por um cromossomo replicado incompletamente. Uma 
característica essencial da tolerância ao dano no DNA é que a lesão no DNA permanece no 
genoma. As vias de reparo do DNA podem, subsequentemente, corrigir a lesão. 
Uma característica importante das polimerases que participam do processo é que, embora elas 
dependam de um molde, elas podem incorporar nucleotídeos independentemente do 
pareamento de bases. Isso explica como as enzimas podem sintetizar DNA sobre a lesão da 
fita-molde. 
3.6 vias de reparo: sistema SOS 
Genes SOS: induzidos por um erro que é suficientemente severo para bloquear a síntese de 
DNA (mais do que uma alteração de bases) 
Mutações severas, geradas por UV, por exemplo. 
Sistema complexo de reparo: muitas vezes envolve a ativação por proteínas do tipo RecA 
(recombinação homóloga) e atividade de DNA polimerase V (baixa fidelidade) 
RecA: reparo da mutação por recombinação - pode também promover a indução de 
aproximadamente 15 genes SOS. 
Entre eles, genes relacionados com os reparos por excisão (uvrABC) e recombinação e de 
proteínas de replicação de DNA (são superexpressos após a indução do sistema SOS) 
Sistema SOS: muitas vezes causa mutações! 
Conhecido como mecanismo de reparo mutagênico: Inserção de bases inespecíficas em 
regiões lesionadas (permitem ao menos a duplicação do DNA) 
Operam somente quando as lesões no DNA são tão extensivas que não podem ser reparadas 
por outros mecanismos de reparo! 
4. Recombinação 
Alto índice de similaridade entre o DNA doador e o DNA hospedeiro. 
Pareamento e crossing-over (doador X hospedeiro). 
Hidrólise da região substituída. 
Realizada por proteínas do sistema Rec bacteriano.