mutações e sua detecção

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Mutações e sua detecção
Causas de mutação
Mutações induzidas  Químicas (quimioterapia), radiação ionizante (quebra de DNA), radiação não-ionizante (instabilidade das bases, levando a ligações incorretas)
Mutações espontâneas  Erros de pareamento ou erros de reparo que não são corrigidos antes da geração de uma prole, por mitose ou meiose
Causas da mutação
A taxa de mutação gira em torno de 10-9, ou seja, a cada 1 bilhão de bases aleatórias, 1 se altera entre uma geração e a próxima (para fins de comparação, o genoma humano tem por volta de 3 bilhões de bases)
Dentro dos genes, essa taxa é de 10-4 a 10-7 por locus por divisão. Essa diferença se deve ao:
Tamanho do gene
“Pontos quentes” de mutação
Pontos quentes de mutação
Regiões onde mutações tornam-se muito frequentes. Pode estar associado a sequências específicas ou repetições, que levam ao erro do alinhamento do DNA
Um exemplo é o dinucleotídeo CG, que são metilados (~80% das vezes). A citosina é metilada, e a deaminação da citosina é frequente, tornando-se uma timina
Defeitos genéticos relacionados a defeitos no reparo de DNA
Mutações monogênicas
Ao contrário dos distúrbios de aneuploidia, o erro nas sequências de DNA aumenta nos dois pais de acordo com a idade.
Isto deve-se à chance de um erro em uma única base ser passada à frente aumentar com o tempo, pois houve mais chances para a mutação ocorrer
Como identificar uma mutação?
Eletroforese de proteínas
Polimorfismos de comprimento de fragmento de restrição - RFLP
Amplificação por PCR
Polimorfismo de repetições em tandem
Sequenciamento
Eletroforese de proteínas
Separação das proteínas em um meio gelatinoso, feito de agarose ou poliacrilamida
As proteínas migram por dentro da trama de polímeros seguindo a ddp elétrica. De acordo com o tamanho da proteína e sua carga, a proteína migra em velocidades diferentes
Podem identificar alterações nos aminoácidos, que alteram a carga global da proteína e 
Anemia falciforme
Mutação pontual AT, levando à alteração de um ácido glutâmico para valina, hidrofóbica, o que causa a precipitação das cadeias beta da hemoglobina quando esta é deoxigenada
Mais frequente na África subsaariana, onde a heterozigose (traço falcêmico) confere vantagem seletiva contra a malária. Mais frequente nas populações negras, herdeiras de países subsaarianos. A homozigose normalmente resulta em morte precoce
A variação na carga da proteína pode ser identificada por eletroforese de proteínas
RFLP
Polimorfismos de comprimento de fragmento de restrição
O processo utiliza uma enzima de restrição: enzimas utilizadas por bactérias para impedir a entrada de DNAs estranhos, quebram o DNA em sequências específicas (ex: EcoRI cliva em G|AATTC)
O resultado da digestão pode ser isolado por eletroforese em gel de agarose
o DNA separado agora é transferido a uma membrana de nitrocelulose por uma corrente elétrica, em um processo denominado Southern blotting
RFLP
Uma sonda é feita para os fragmentos, marcada com elemento radioativo ou fluorescente, e um filme de raios-X ou fotográfico é utilizado.
Se a sonda se aderir ao DNA, serão identificados os fragmentos, quantos são, e quais os seus tamanhos.
Esta técnica entrou em desuso pelo seu custo elevado em relação ao PCR, mas foi essencial para a descoberta das mutações na anemia falciforme, doença de Huntington e Fibrose Cística
Fibrose cística
Mutação no gene CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator), localizado no q31.2 do cromossomo 7
Resulta de +1500 mutações no gene, sendo a mais comum uma deleção de três nucleotídeos na posição 508, excluindo uma fenilalanina da sequência de aa.
Recessivo
Amplificação por PCR
Reação da polimerase em cadeia
Desenvolvida em 1985 por Kary Mullis, consiste em ciclos de aquecimento e resfriamento, fazendo com que a dupla-fita de DNA se separe e a DNA polimerase possa copiar a fita molde
Permite a amplificação de fitas de tamanhos variados, e por isso é a técnica atualmente mais utilizada em estudos de biologia molecular
Utiliza: Dois primers de DNA diferentes (um para cada sentido), DNA polimerase de Termiphilus, nucleotídeos livres.
Elongação pela polimerase
Separação das cadeias
Ligação dos iniciadores (oligonucleotídeos)
Amplificação por PCR
Depois de amplificado, o DNA é separado por eletroforese, onde os fragmentos são separados por tamanho, do mesmo jeito que a eletroforese de proteínas.
Como o DNA possui a mesma carga (pois todos os nucleotídeos têm praticamente a mesma carga), são separados apenas pelo tamanho
Polimorfismo de repetições em tandem
Regiões satélite do DNA  regiões de repetições em sequência, entre 5 e 50 repetições, onde a quantidade de repetições pode variar.
Comumente chamadas de VNTR (repetições de número variável em tandem)
Podem ser identificados por sítios de restrição ou por PCR. A diferença no número de repetições pode ser usada para identificar pessoas e realizar testes de paternidade
Replicação normal: a fita nova é sintetizada normalmente e copia todas as repetições
Ganho de uma repetição: a fita nova “escorrega” para trás, fazendo com que a DNA polimerase adicione uma cópia a mais
Perda de uma repetição: a fita nova “escorrega” para a frente, perdendo uma repetição
1: Uma amostra de células é colhida - geralmente um cotonete bucal ou exame de sangue
2: O DNA é extraído a partir da amostra
3: Clivagem do DNA por restrição enzimática do DNA é quebrado em pequenos fragmentos
4: Pequenos fragmentos são amplificados por PCR em muitos mais fragmentos
5: Os fragmentos de DNA são separados por eletroforese
6: Os fragmentos são transferidos para uma placa de ágar
7: na placa de agar os fragmentos são ligados a sondas de DNA específicas
8: A placa de Agar é lavada e a sonda em excesso é removida
9: Um filme de raios-X é utilizado para detectar um padrão radioactivo ou papel filme detecta fluorescência
10: O DNA é comparado com outras amostras de DNA
http://pessoas.hsw.uol.com.br/prova-de-dna1.htm
Doença de Huntington
Associada a repetição de trinucleotídeos – CAG – que podem causar um deslize na fita nova, fazendo com que mais ou menos repetições sejam adicionadas
Quando o número de repetições passa de 35, a proteína huntintina perde sua função, fazendo com que a pessoa possa desencadear a doença
Quanto mais repetições, mais cedo a doença aparece, com maior intensidade, levando a demência, movimentos involuntários (coréia de huntington)
Herdado autossomicamente (cromossomo 4)
Sequenciamento de DNA
A técnica é muito parecida com a PCR, mas ao invés de utilizar nucleotídeos livres normais – deoxiribonucleotídeos, DRN – são utilizados nucleotideos modificados – dideoxirribonucleotídeos, dDRN.
A diferença é que o dDRN não permite o crescimento da cadeia de DNA. 
O dDRN é adicionado em proporção muito menor que o DRN. Quando um dDRN é adicionado ao invés do DRN, a fita para de crescer
Microarranjo
Técnica utilizada para comparar as seuências de DNA de duas ou mais amostras
Possui uma sequência de DNA fixada em uma placa, e sondas são feitas a partir do DNA estudado, usando um marcador fluorescente
Caso a sequência do DNA estudado seja a mesma do DNA fixado, eles hibridizam, fazendo com que a sonda criada fique presa no poço, que apresentará a cor da sonda marcada.