Roteiro de aulas práticas micro geral Farm Enferm 2016

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UNIVERSIDADE METODISTA 
DE PIRACICABA 
 
 
 
 
ROTEIRO DE AULAS PRÁTICAS 
 
MICROBIOLOGIA GERAL 
 
CURSO S: F ARM ÁC IA 
 ENF ERM AG EM 
 
 
 
 
 
 
 
 
Profa. Dra. Gislene Garcia 
 
 
 
 
 
 
 
2015 
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CUIDADOS A SEREM TOMADOS NO 
LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA 
 
As aulas práticas visam ensinar aos estudantes os princípios e os métodos utilizados em um 
laboratório de microbiologia. Nessas aulas, utilizaremos uma grande variedade de microrganismos 
(bactérias e fungos), alguns dos quais patogênicos. Assim é muito importante seguir as normas de 
segurança estabelecidas para um laboratório dessa natureza, a fim de evitar a contaminação de todos 
os seus usuários. 
1. Não deixar seus pertences sobre os balcões onde os experimentos serão realizados, 
especialmente telefone celular. 
2. Desinfetar a bancada de trabalho no início e término de cada aula prática. Isto removerá 
microrganismos que possam contaminar a área de trabalho. 
3. Não fumar e não comer no laboratório. Evite levar a boca, qualquer objeto como lápis, canetas, 
etc., evitando assim possível contaminação. 
4. Comunicar imediatamente ao professor, qualquer acidente como derramamento de culturas 
sobre as mesas, ferimentos, aspirações de culturas, etc. 
5. Colocar os materiais contaminados (pipetas, alças, lâminas, etc.) em recipientes apropriados 
colocados na bancada. 
6. Seguir as normas de uso de aparelhos. O microscópio deve ser manuseado cuidadosamente e 
após o seu uso, enrolar o fio e colocar a capa. Ao usar a objetiva de imersão, somente remover 
a lâmina após o deslocamento da objetiva. 
7. Lavar as mãos com anti-séptico antes de deixar o laboratório. 
8. Utilizar avental, evitando usá-lo em outros locais caso tenha sido contaminado acidentalmente. 
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MATERIAIS UTILIZADOS NO LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA 
1. Autoclave (calor úmido) - O seu funcionamento baseia-se no vapor d’água sob pressão, e é 
utilizada para esterilização de materiais usados em microbiologia, principalmente meios de 
cultura. 
2. Estufa esterilizadora ou Forno Pasteur (calor seco) - Usado para esterilizar materiais secos tais 
como tubos, placas, etc. 
3. Estufa Incubadora – Onde os microrganismos são mantidos durante o seu desenvolvimento em 
uma temperatura constante. 
4. Microscópio - Para observação de microrganismos. 
5. Placa de Petri - Recipiente redondo de vidro ou plástico (descartável) com tampa rasa, destinada 
ao cultivo de microrganismos em meio sólido. 
6. Tubo de Cultura - Destinado ao cultivo de microrganismos em pequeno volume de meio (líquido 
ou sólido). 
7. Pipeta Graduada e Pipetador automático - Utilizada para diluição, inoculação, etc. 
8. Espátula de Drigalsky - Bastonete de vidro com formato de triângulo que é usado para distribuir 
homogeneamente uma cultura líquida sobre o meio de cultura sólido, contido na placa de Petri. 
9. Cabo de Kolle - Cilindro em cuja extremidade há um fio de platina ou outra liga metálica (níquel-
cromo) que pode ser reto (agulha) ou encurvado (alça). Serve para semear microrganismos em 
meio sólido ou líquido. 
10. Lâmina e Lamínula - Para o exame microscópico de microrganismos. 
11. Lâmina Hematimétrica ou Lâmina de Contagem - Permite contar o número de células 
suspensas num determinado meio líquido. 
Além destes, outros equipamentos como balança, geladeira, destilador de água (ou outros 
purificadores de água como deionizador e de osmose reversa, dependendo do objetivo do 
experimento), centrífuga, filtros microbiológicos, peagâmetro, agitador magnético, banho-maria e 
outras vidrarias. 
 
 MEIOS DE CULTURA 
Para o cultivo e identificação de microrganismos, usam-se soluções e substâncias nutritivas 
chamadas meios de cultura, que devem atender às exigências nutricionais das espécies a serem 
cultivadas. 
Quanto a composição química, podem ser: Meios sintéticos (os componentes são 
quimicamente definidos) e Meios complexos (quando se adicionam ao meio substâncias complexas, 
como por exemplo, extrato de carne, peptona, sangue, etc). Em relação ao estado físico, podem ser 
líquidos, também denominados de caldos, ou sólidos (caldo contendo 1,5% a 2% de ágar). Após a 
preparação, devem ser esterilizados em autoclave. 
 
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EXERCÍCIO 1 
MICRORGANISMOS DO AMBIENTE 
 
Os microrganismos se encontram praticamente em todos os ambientes. No ar, água e 
principalmente no solo. Destes locais podem ser arrastados por partículas de poeira e aerossóis. Do 
ar, passam para nossa superfície contaminando ainda a água e alimentos. Uma vez que as condições 
que favorecem a sobrevivência e o crescimento de muitos microrganismos (nutriente, umidade e 
temperatura adequada) são as mesmas sob as quais vivem as populações humanas, é inevitável que 
vivamos entre grande quantidade de germes. 
 
OBJETIVO 
 
Verificar a existência de microrganismos em diferentes ambientes e superfícies. 
 
MATERIAL 
 placas de Petri contendo Nutriente Ágar (NA) e ágar Sabouraud (AS) 
 cotonetes 
 
MÉTODO 
a) Presença de microrganismos no ar 
Retirar a tampa de placas contendo Nutriente Ágar e ágar Sabouraud e deixar abertas no 
ambiente durante 15 minutos. Incubar as placas por 3 a 5 dias a 30 oC. 
 
b) Presença de microrganismos no laboratório 
Utilizando-se de placas contendo Nutriente Ágar e ágar Sabouraud, inocular da seguinte 
maneira: 
 
Placa 1 - passar o cotonete estéril na superfície de qualquer objeto do laboratório e depois na superfície 
do ágar na placa. Tomar cuidado para não ferir o meio de cultura. 
Placa 2 - tocar a superfície do ágar em vários pontos com os dedos. 
Placa 3 – colocar um fio de cabelo sobre a superfície do meio de cultura através do uso de uma pinça 
estéril. 
Incubar as placas por 3 a 5 dias a 30 oC. 
 
RESULTADOS 
a) Examinar as placas e contar, se possível, o número de colônias de cada uma delas. Descrever em 
termos gerais a aparência dessas colônias (tamanho, textura, cor, etc). 
b) Fazer a distinção entre uma colônia de fungo e bactéria. 
 
 
 
 
 
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EXERCÍCIO 2 
 
TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS BÁSICAS 
 
Para estudo de microrganismos é necessário o emprego de técnicas adequadas de assepsia 
e manuseio durante repicagens e semeaduras (Figura 1), de modo a se preservar as características de 
cada linhagem. 
 
OBJETIVO 
 
Treinamento das principais técnicas de repicagem e semeadura de microrganismos em meios de 
cultura sólidos e líquidos. 
 
MATERIAL 
 culturas fornecidas: 
 tubos e placas de Petri contendo BHI, AS e BHA 
 alça e agulha de inoculação, pipeta 
 
MÉTODO 
 
a) Semeadura do inóculo de bactéria desenvolvida em meio líquido 
Transferir 0,1 mL de cultura desenvolvida em BHI, para tubo de ensaio contendo este 
mesmo meio. Agitar após a inoculação. 
Transferir 0,1 mL da cultura desenvolvida em BHI para placa de Petri contendo BHA, e 
espalhar com espátula de Drigalsky. Incubar os tubos por 48 horas a 35 oC. 
 
b) Repique do inóculo de bactéria desenvolvida em meio sólido 
Utilizando a alça de platina, transferir a cultura de bactéria desenvolvida em meio sólido ou 
líquido, para tubos contendo meios líquido e sólido inclinado (BHI e BHA). 
Incubar por 48 horas a 35 oC. 
 
c) Inoculação em picada 
Introduzir a agulha de platina contendo o inóculo de bactéria, crescida em meio líquido ou 
sólido, no interior do meio de cultura (“picada”). Incubar por 48 horas a 35 oC. 
 
d) Repique do inóculo de bolor 
Repicar placas e tubos com meio inclinado contendo meio AS (por estrias) com a cultura 
fornecida. Incubar por 5 dias a 28 oC. 
 
 
RESULTADOS 
a) Observar o crescimento de bactérias em meio líquido (turvação, formação de película ou 
sedimento). 
b) Observar o crescimento das culturas de bactérias e bolores em tuboscom meio inclinado e placas 
de Petri. 
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PESQUISAR 
1. Para que serve o meio de cultura? 
2. Qual a temperatura e tempos ideais para esterilização de meios de cultura em autoclave? 
3. Por que os meios de cultura não devem ser esterilizados no forno Pasteur? 
4. O que é e para que serve o ágar no meio de cultura? Por que não se usa gelatina para solidificar 
meios de cultura? 
5. Qual a importância de se cultivar microrganismos em laboratório? 
6. Quais as precauções que devem ser tomadas para controlar os contaminantes do laboratório? 
7. O que é uma colônia de bactéria? E de fungo filamentoso? 
 
 
 
 
Fig. 1 – Principais técnicas microbiológicas 
 
 
 
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EXERCÍCIO 3 
MORFOLOGIA BACTERIANA E MÉTODOS DE COLORAÇÃO 
As bactérias são organismos unicelulares que podem se apresentar na forma de cocos, 
bacilos, espirilos e espiroquetas, reproduzindo-se comumente por fissiparidade. Quando esse 
crescimento se dá em meio sólido, as células resultantes normalmente permanecem juntas formando 
a colônia. 
O exame microscópico de bactérias pode ser feito a partir de uma suspensão de células em 
meio líquido ou através de preparações à fresco em gota pendente, o que permite o exame 
microscópico em condições normais de vida. 
As preparações coradas e fixadas são mais frequentemente utilizadas na observação de 
características morfológicas de bactérias. Estas preparações proporcionam melhor visualização das 
células, especialmente no caso de colorações diferenciais, que permitem destacar estruturas celulares 
específicas, como por exemplo, cápsula, flagelo, endósporo, etc. 
 
OBJETIVO 
 
Estudo morfológico de bactérias, através da observação microscópica de várias culturas. 
 
MÉTODO 
 
3.1. COLORAÇÃO SIMPLES 
Vários corantes podem ser empregados na coloração de bactérias de modo a permitir melhor 
visualização das células. Estas preparações podem ser feitas à partir de lâminas à fresco (observação 
in vivo) ou fixadas (esfregaço). 
Colocar uma gota da suspensão bacteriana em uma lâmina, adicionar uma gota de azul de 
metileno, homogeneizar e cobrir com lamínula. 
 
- cultura fornecida: 
 
 
3.2. COLORAÇÕES DIFERENCIAIS (OBSERVAÇÃO DE ESTRUTURAS CELULARES) 
 
3.2.1. COLORAÇÃO DE GRAM 
 
Esta coloração é bastante utilizada pois a maioria das bactérias se cora por este método, 
permitindo que sejam obtidas informações relacionadas a sua morfologia principalmente no que diz 
respeito a parede celular. Devido a estas vantagens esta coloração é utilizada na taxonomia das 
bactérias. 
 
 
 
 
 
 
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- culturas fornecidas: 
 
a) Preparo do esfregaço: 
Colocar uma gota da suspensão bacteriana em uma lâmina e espalhar ligeiramente com a 
alça de platina para que as células sejam homogeneamente distribuídas. Secar a preparação a ar. 
Fixar o esfregaço, passando a lâmina diretamente na chama, evitando o superaquecimento 
(testar no dorso da própria mão). Antes de corar, deixar que a lâmina esfrie completamente. 
 
b) Coloração: 
 cobrir o esfregaço seco e fixado, com cristal violeta por 1 min 
 escorrer o corante e cobrir com lugol por 1 min 
 lavar com água e colocar álcool/cetona por cerca de 30 seg 
 lavar com água e cobrir com safranina ou fucsina por 30 seg 
 lavar com água e secar com papel de filtro 
 observar ao microscópio com objetiva de imersão . 
 
 
 
Fig. 2 – Bactérias coloridas pelo Método de Gram: (A) cadeias de cocos Gram + de Streptococcus; 
(B) cocos Gram + de Staphylococcus; (C) bacilo Gram + de Clostridium perfringens; (D) 
bacilo Gram + de Corynebacterium; (E) bacilo Gram - de Escherichia coli 
A B 
C D 
E 
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3.2.2. COLORAÇÃO ÁLCOOL ÁCIDO-RESISTÊNCIA (Método Ziehl-Neelsen) 
 
O princípio deste método está relacionado com a estrutura e a composição da parede celular 
de algumas bactérias que possuem lipídios complexos como ácidos graxos e ceras (ácido micólico), 
resistindo ao descoramento por álcool-ácido clorídrico. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
- cultura fornecida: 
 
a) Preparo do esfregaço: idem ao anterior 
b) Coloração: 
 corar o esfregaço com fucsina de Ziehl e aquecer até a emissão de vapores por 5 min. 
 Escorrer o corante e cobrir a lâmina com álcool-ácido clorídrico por 1 min. 
 lavar com água 
 corar com solução de azul de metileno por 1 min. 
 lavar com água e secar ao ar 
 observar em microscópio com objetiva de imersão 
 
3.2.3. Coloração de cápsula (Método de Hiss) – preparar o esfregaço em sol. de glicose 6%. 
 
- cultura fornecida: 
 
a) Preparo do esfregaço: idem ao anterior 
b) Coloração: 
 cobrir o esfregaço com metanol por 1 min 
 aquecer no fogo 
 cobrir o esfregaço com solução alcoólica saturada de violeta de genciana e aquecer até a emissão 
de vapores por 3 min. (Sol A) 
 lavar com sulfato de cobre 20% (Sol B) 
 enxugar com papel de filtro e secar ao ar 
 observar ao microscópio com objetiva de imersão 
 
 
Fig. 3 – Mycobacterium 
tuberculosis, álcool-ácido-
resistentes 
Bactéria com 
cor vermelha 
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3.2.4 - Coloração de esporos (Método de Wirtz) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
- cultura fornecida: 
 
a) Preparo do esfregaço: idem ao anterior 
b) Coloração 
 cobrir o esfregaço com solução aquosa de verde malaquita. Aquecer até que se desprendam 
vapores (5 minutos), não deixando o corante evaporar completamente 
 lavar com água 
 corar com safranina por 30 seg. 
 observar ao microscópio com objetiva de imersão 
 
RESULTADOS 
 
Visualizar, esquematizar e classificar as lâminas preparadas, segundo o método de 
coloração empregado: 
 
1. Gram: positivo = roxo; negativo = vermelho 
2. Cápsula: célula = escura; cápsula = coloração mais clara 
3. Esporo: célula = vermelha; esporo = verde 
4. Álcool-ácido resistente: positivo = vermelho; negativo = azul 
 
PESQUISAR 
1. Qual a importância da coloração de Gram? Qual a finalidade de se usar lugol e álcool nesse tipo 
de coloração? É possível observar esporos em preparações coloridas pelo método de Gram? 
2. O que são endósporos bacterianos? Todas as bactérias possuem essa estrutura? 
3. Qual a função da cápsula? 
4. Qual é o princípio e uso da coloração álcool-ácido resistência? 
 
 
Fig. 4 – (A) Coloração de Gram de Bacillus anthracis, com endósporos sub-
terminais; (B) Coloração de cápsula de Streptococcus pneumoniae 
 
A B 
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EXERCÍCIO 4 
CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS DE FUNGOS 
Os fungos podem se apresentar na forma filamentosa (bolores) ou unicelular (leveduras). 
Alguns fungos patógenos humanos são dimórficos, dependendo das condições de cultivo 
(especialmente a temperatura), podendo se apresentar tanto na forma micelial quanto leveduriforme. 
 
OBJETIVO 
 
Estudo morfológico de fungos através da observação macroscópica e microscópica de várias culturas. 
 
4.1 - FUNGOS FILAMENTOSOS 
 
Os fungos filamentosos, também conhecidos por bolores, são constituídos por hifas, que se 
ramificam e se entrelaçam formando o micélio. A parte do micélio que penetra no substrato digerindo-
o e absorvendo-o é o micélio vegetativo. O micélio reprodutivo é o responsável pela produção de 
esporos e varia grandemente nas diferentes espécies de fungos, servindo para classificá-los e 
identificá-los. 
 
MATERIAL 
 culturas fornecidas: 
 lâminas e lamínulas 
 
MÉTODO 
 Examinar macroscopicamente e microscopicamente as culturas fornecidas em placas de 
Petri. Para o exame microscópico à fresco, colocar uma gota de água em uma lâmina e com uma alça, 
emulsionar uma pequena quantidade da cultura do fungo a ser observado. Cobrir com lamínula e 
observar ao microscópio (aumentode 400x). 
 Preparar lâminas com e sem o corante azul de lactofenol. 
 
RESULTADOS 
a) Comparar a morfologia das culturas fornecidas a partir do exame macroscópico e microscópico. 
b) Identificar as estruturas observadas ao microscópio (hifas, estrutura de reprodução, etc), 
esquematizando-as. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Fig. 5 – Colônias de fungos filamentosos: (A) várias espécies do ambiente; (B) Dreschslera sp; (C) 
Cladosporium sp; (D) Aspergillus fumigatus; (E) A. niger; (F) Penicillium sp; (G) Zygomyces 
(Ficomiceto); (H) Fusarium sp 
Fig. 6 – Estruturas de reprodução de fungos filamentosos: (A) Penicillium sp; (B) Rhizopus nigricans; 
(C) Aspergillus fumigatus 
 
A B 
C 
A B C 
D E F 
G H 
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4.2 - FUNGOS UNICELULARES – LEVEDURAS 
 
As leveduras são fungos unicelulares que se reproduzem mais comumente por brotamento. 
Muitas vezes os brotos não se separam imediatamente da célula mãe formando o pseudo micélio (as 
células ficam ligadas em cadeias). A forma das células também é de grande importância na taxonomia 
das leveduras. 
 
MATERIAL 
 culturas fornecidas: 
 lâminas e lamínulas 
 
MÉTODO 
 Examinar macroscopicamente as culturas fornecidas em placas de Petri observando cor, 
brilho, etc. Para o exame microscópico, colocar uma gota de água em uma lâmina e emulsionar nessa 
gota, uma pequena quantidade do material. Cobrir com lamínula e observar ao microscópio (aumento 
de 400x). 
 Repetir o método acima descrito, usando o corante azul de metileno. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
RESULTADOS 
a) A partir do exame macroscópico, descrever as características morfológicas das culturas 
examinadas (tipo de crescimento e morfologia da colônia). 
b) Desenhar as estruturas observadas ao microscópio (forma, tamanho, modo de reprodução). 
 
 Fig. 7 – Levedura Candida 
albicans. (A) blastóporo; 
(B) pseudo-hifa; (C) célula 
Fig. 8 – Levedura Rhodotorula sp 
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 EXERCÍCIO 5 
METABOLISMO MICROBIANO (provas bioquímicas) 
 
Os microrganismos produzem alterações nos meios em que se desenvolvem, decorrentes 
de atividades metabólicas. Estas transformações são devidas principalmente a ação de enzimas que 
os microrganismos elaboram, sendo que cada espécie tem um perfil bioquímico característico. As 
provas bioquímicas, portanto, consistem na verificação das transformações químicas que ocorrem em 
um substrato pela ação de um determinado microrganismo e, portanto, podem ser utilizadas como um 
dos critérios na identificação de gênero e espécie. 
 
OBJETIVO 
Caracterizar diferentes bactérias, de acordo com características de seu metabolismo 
 
MATERIAL 
 cultura fornecida: 
 soluções: reativo de Kovacs, vermelho de metila, reativo de Barrit, azul de metileno, água 
oxigenada 
 meios de cultura: caldo indol, bismuto-sulfito-ágar, caldo de Clark e Lubs, gelatina, ágar leite, 
citrato-Simmons, meio lisina-descarboxilase 
 
MÉTODO 
 
5.1 - Produção de indol 
 
Princípio: indol é um composto produzido pela atividade de algumas bactérias sobre o aminoácido 
triptofano. 
 triptofano triptofanase  indol 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Procedimento: inocular a cultura bacteriana em tubo com caldo indol e incubar por 48 horas a 35 oC. 
Após este período, adicionar 2,0 mL de reativo de Kovacs e agitar. Com o repouso, as duas camadas 
separam-se. 
indol (+)  coloração vermelha na superfície 
indol (-)  coloração amarela na superfície 
Fig. 9 – Caldo Indol sem crescimento 
(esquerda); reação positiva (centro) e 
reação negativa (direita) 
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Obs: o anel formado às vezes fica alaranjado devido à presença de escatol (outro produto). 
 
5.2 - Produção de gás sulfídrico 
 
Princípio: certas bactérias produzem H2S, a partir de cistina (aminoácido que contém enxofre). Esse 
gás é evidenciado nas culturas bacterianas, pois reagem com metais pesados (chumbo, ferro, etc), 
formando sulfetos que são escuros. 
Procedimento: inocular a cultura bacteriana em placa ou tubo contendo meio sulfito-bismuto-ágar e 
incubar por 48 horas a 35 oC. 
H2S (+)  colônias negras 
H2S (-)  colônias amarelas 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
5.3 - Prova do vermelho de metila (VM) 
 
Princípio: algumas bactérias quando fermentam a glicose, produzem uma série de ácidos (fórmico, 
acético, lático, succínico, etc), que abaixam o pH do meio (em torno de 5). 
Procedimento: inocular a cultura bacteriana em caldo de Clark e Lubs e após 48 horas de incubação 
a 35 oC, adicionar ao tubo, 5 gotas do indicador vermelho de metila. 
VM (+)  coloração vermelha 
VM (-)  coloração amarela 
 
5.4 - Prova de Voges-Proskauer (VP) 
 
Princípio: algumas bactérias quando fermentam a glicose, produzem além dos ácidos, substâncias tais 
como acetil-metilcarbinol (acetoina) e 2,3 butileno glicol. 
Procedimento: inocular a cultura bacteriana em meio de Clark e Lubs e após 48 horas de incubação, 
adicionar 0,5 mL da solução de alfa naftol e 0,5 mL da solução de KOH (reativo de Barrit) / ml de 
suspensão bacteriana. 
VP (+)  col. vermelha na superfície 
VP (-)  col. amarela 
Fig. 10 – (A) Salmonella sp 
produtora de H2S (direita); 
controle negativo (esquerda); (B) 
Caldo VM com reação positiva 
(esquerda) e negativa (direita) 
 
 
 
A B 
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5.5 - Fermentação de carboidratos 
 
Princípio: as bactérias podem ou não fermentar certos carboidratos, com produção de ácidos e gases. 
Esses ácidos vão se acumulando no meio de cultura, de modo que o pH vai baixando gradativamente, 
até que uma acidez excessiva limita o desenvolvimento posterior da cultura. 
Procedimento: inocular a cultura em meios contendo açúcares e tubo de Duhram. Após 48 horas de 
incubação a 35 oC, verificar a produção de ácido e gás. A verificação da acidez se faz pela adição de 
indicadores aos meios de cultura. A produção de gás em meio líquido, pode ser verificada pela 
presença de bolhas no tubo de Duhram. 
 
Açúcar Reação Cor do meio Produção de gás 
______________ Positivo 
 
amarelo (ácido) 
 
bolhas no tubo de Duhram 
 ______________ Negativo vermelho ausência de bolhas 
 
5.6 - Produção da catalase 
 
Princípio: certas bactérias produzem a enzima catalase, que decompõe a água oxigenada. 
2 H2O2 
catalase  2 H2O + O2 
 A presença dessa enzima pode ser demonstrada pela adição de água oxigenada à cultura 
e verificando-se o desprendimento de bolhas de O2. 
Procedimento: inocular a cultura bacteriana em caldo nutriente e após incubação por 48 horas a 35 
oC, adicionar algumas gotas de água oxigenada. 
catalase (+)  despredimento de bolhas 
 
5.7 - Hidrólise da caseina 
 
Princípio: algumas bactérias possuem a enzima casease que transforma a caseina em produtos mais 
simples (peptonização). 
Procedimento: inocular a cultura bacteriana em ágar leite e incubar por 48 horas a 35 oC. Observar o 
aspecto da colônia. 
Fig. 12 – Caldo VP 
com reação positiva 
(esquerda) e 
negativa (direita) 
 
Fig. 11 – Fermentação de 
carboidratos. Reação 
negativa (esquerda) e 
positiva com produção de 
ácido e gás (direita) 
 
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Reação (+)  zonas claras ao redor das colônias (mudança na cor meio) 
 
5.8 - Utilização do citrato 
 
Princípio: algumas bactérias utilizam o citrato como fonte de carbono para seu crescimento. Após a 
utilização do citrato e do nitrogênio, ocorre a alcalinização do meio e “viragem” do indicador (azul 
de bromotimol). Os microrganismos que utilizam citrato como fonte de C, também utilizam sais de 
amônia como fonte de N. O desdobramento dos saisde amônia é que alcaliniza o meio. 
Procedimento: inocular a cultura em meio de citrato-Simmons e incubar por 48 horas a 35 oC, 
observando-se o crescimento da cultura. 
citrato (+)  cor azul 
 
 
 
 
 
 
 
 
5.9- Lisina-descarboxilase 
 
Princípio: o aminoácido lisina sob a ação da enzima lisina-descarboxilase, produz uma diamina 
(cadaverina) que alcaliniza o meio. Esta reação ocorre em anaerobiose. 
Procedimento: inocular a cultura bacteriana em meio Mili e incubar por 48 horas a 35 oC. Após a 
incubação, adicionar 1,0 mL de nujol para evitar a penetração de oxigênio, pois esta reação só ocorre 
em anaerobiose. 
resultado (+) (bact. tem a enzima)  cor lilás (alcalino) 
resultado (-)  cor amarela (ácido) 
 
5.10 - Pesquisa do movimento bacteriano 
 
Princípio: quando são estudadas as atividades bioquímicas de uma bactéria, comumente verifica-se 
também se ela é móvel ou imóvel, o que pode ser comprovado pelo tipo de crescimento em ágar semi-
sólido. Assim, bactérias flageladas crescem além da linha de picada, ao contrário das imóveis, 
turvando o meio em que se desenvolvem. 
Procedimento: inocular a cultura em meio Mili semi-sólido em “picada” e incubar por 48 horas a 35 
oC. 
reação (+)  crescimento da bactéria além da linha de picada 
 
 
Fig. 12 – Agar Citrato sem crescimento 
(esquerda) e com reação positiva (direita) 
 
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5.11 - Hidrólise ou liquefação da gelatina 
 
Princípio: certas bactérias possuem a enzima gelatinase, capaz de hidrolisar a gelatina. 
Procedimento: inocular a cultura em meio de gelatina e após incubação por 48 horas a 35 oC, observar 
a ocorrência ou não de liquefação da gelatina (classificando-a como: nenhuma, escassa, moderada, 
completa). 
reação (+)  meio líquido 
 
5.12- Produção de urease 
Princípio: algumas bactérias tem habilidade em degradar enzimaticamente a uréia através da enzima 
urease, havendo formação de amônia. 
Procedimento: inocular a cultura em meio de Christensen e incubar por 48 horas a 35 oC. O resultado 
positivo (rosa escuro) indica que a bactéria possui a enzima urease, que hidrolisa a uréia em amônia, 
alcalinizando o meio, 
urease (+)  rosa-escuro (pH 8,0). 
 
Ba
ct
ér
ia
 
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G
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a 
U
re
as
e 
 
 
 
 
 
RESULTADOS 
 Classificar a bactéria em estudo (gênero e espécie), de acordo com as características da 
tabela fornecida. 
Fig. 13 – (1) Agar semi-sólido inoculado com Pseudomonas apresentando movimento 
escasso; (2) Meio de Christensen sem crescimento (esquerda), e com reação fortemente 
positiva (direita) 
 
 
 
(1) (2) 
 19 
 EXERCÍCIO 6 
 
TÉCNICAS DE ISOLAMENTO E DE CONTAGEM DE MICRORGANISMOS 
 
Para que seja possível o estudo de microrganismos de diferentes origens (solo, água, 
secreções, etc), é necessário que se proceda a uma purificação das amostras, isolando-os em culturas 
puras. Colônias isoladas podem ser obtidas através da semeadura em estrias ou por diluição em 
solução salina e posterior semeadura em meios sólidos. O isolamento de microrganismos também é 
facilitado pelo emprego de meios seletivos e diferenciais, específicos para o crescimento de cada 
grupo microbiano. 
Igualmente importante é a avaliação de crescimento dos microrganismos, o que pode ser 
feito através da contagem direta de células ou determinação de sua massa celular. 
 
OBJETIVO 
 
Aprendizado de técnicas (estria e diluição) para isolamento de microrganismos em culturas puras 
 
MATERIAL 
 suspensão de bactérias misturadas: 
 tubos e placas de Petri contendo BHA e meios seletivos 
 solução salina 
 
MÉTODO 
 
6.1. Estrias em placa de Petri (técnica do esgotamento) 
Com a alça de platina, coletar uma pequena quantidade do inóculo fornecido e espalhar na 
superfície do meios sólido (meio completo e seletivo), conforme mostra a figura abaixo. Tomar 
cuidado para não ferir o ágar e não passar a alça sobre a superfície anteriormente inoculada. Incubar 
as placas por 48 horas a 35oC. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fig. 14 – (A) Estria em meio TSA; (B) Colônias fermentadoras de lactose em ágar Mac Conkey 
(estria); (C) Colônias fermentadoras de lactose em ágar EMB (estria). 
 
ou 
 
 A 
B C 
 20 
6.2 - Diluição e semeadura na superfície de meio sólido 
 
A diluição pode ser realizada no próprio nutriente derretido ou liquefeito (pour-plate) ou 
em salina (sol. NaCl 0,9 %). Após a diluição, a semeadura pode ser feita em meios simples 
(completos) onde todos os microrganismos presentes terão chance de crescer e formar colônia. Sabe-
se que muitas interações (ou interferências) podem ocorrer em amostras ou culturas mistas de 
microrganismos. Assim, se o objetivo for o de selecionar microganismos específicos, após a diluição, 
a semeadura deve ser feita em meio seletivo ou diferencial. 
Transferir 1,0 mL da suspensão de bactérias ao tubo no 1 da solução salina. Homogeneizar 
a suspensão por aspirações sucessivas ou no agitador magnético e transferir 1,0 mL para o tubo no 2. 
E assim seguidamente, até a obtenção da diluição desejada, ou seja, a que permita se obter um número 
de células possíveis de formação de colônias isoladas. 
Inocular em placas de Petri contendo meio sólido, 0,1 mL de cada uma das diluições 
indicadas e espalhar com espátula de Drigalsky. Numerar as placas e incubar por 48 horas a 35 oC. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
RESULTADOS 
a) Examinar as placas em estrias e descrever os tipos de colônias que apareceram. Identificá-las. 
b) Contar as colônias crescidas no item 6.2 após diluição em salina e calcular o nº de bactérias 
(UFC/mL). 
 
 
Fig. 15 – Colônias de Staphylococcus 
aureus em agar Vogel-Johnson 
 
Supensão de 
bactérias 
1 ml 
 
1 ml 1 ml 1 ml 
1 2 3 4 
 21 
 
EXERCÍCIO 7 
CONTROLE DO CRESCIMENTO MICROBIANO 
 
Os microrganismos podem sobreviver em ambientes com diferentes condições físicas e 
químicas, havendo, no entanto, limitações toleradas por eles. A inibição ou destruição dos 
microrganismos depende, em parte, da intensidade das condições que lhes são impostas. 
Processos físicos e químicos são comumente empregados para remover, inibir ou destruir 
microrganismos de vários materiais ou ambiente. 
 
OBJETIVO 
 
Verificar a ação de algumas condições ambientais e o uso de métodos físicos e químicos sobre 
diferentes microrganismos 
 
7.1. CONTROLE DO CRESCIMENTO MICROBIANO POR AÇÃO DE MÉTODOS 
 FÍSICOS 
 
MATERIAL 
 culturas fornecidas: 
 Tubos com caldo nutriente mais cloreto de sódio nas concentrações de 5, 10 e 15% 
 Tubos e placas com meio sólido e semi sólido e materiais desidratados 
 
a) Efeito da temperatura 
Inocular cada uma das culturas microbianas em tubos com BHI e incubar nas 
temperaturas de 3 oC, 25 oC, 37 oC e 55 oC. Observar os resultados após incubação por 72 
horas. 
 
b) Efeito da pressão osmótica 
Inocular cada uma das culturas microbianas em uma série de tubos com diferentes 
concentrações de cloreto de sódio (5, 10 e 15%). Comparar o crescimento de cada organismo e de 
cada tubo com o crescimento do tubo controle, após incubação de 48 horas a 35 oC. 
 
c) Efeito da atmosfera de crescimento 
Inocular as diferentes culturas em tubos, no interior e sobre a superfície do meio. 
Incubar por 48 horas a 35 oC. Comparar o crescimento das culturas em diferentes condições 
de crescimento. Classificar as culturas quanto ao aproveitamento de oxigênio. (Figuras16). 
 
 
 
 
 
 
 
Fig. 16 – Desenvolvimento 
microbiano conforme a tensão de O2 
 
 22 
d)Efeito da umidade 
 Comparar as variedades e quantidade de microrganismos crescidos 
em materiais desidratados como alimentos, medicamentos, etc, após hidratação com água 
estéril. 
 
e) Controle através da Radiação ultra-violeta 
Semear as culturas microbianas em placas contendo BHA ou AS. Remover as tampas das 
placas e proteger com um pedaço de cartolina metade da placa, colocando-as debaixo da lâmpada 
ultra-violeta. Retirar uma placa de cada conjunto nos tempos de 10, 20, 30 e 45 minutos. Recolocar 
as tampas e incubar por 48 horas a 35 oC. 
 
 
f) Controle através da Filtração (Embora não seja um “agente físico”, tem sido utilizada como 
método de esterilização) 
Realizar a filtração de uma suspensão de bactérias em um sistema de membrana filtrante 
com porosidade 0,45 m e 0,22 m (Figura 4). Avaliar a eficiência da filtração, semeando uma 
amostra do “filtrado” em placa de Petri contendo BHI e incubando posteriormente por 48 horas a 35 
oC. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
RESULTADOS 
a) Observar o crescimento da cultura nos tubos e placas em diferentes condições ambientais 
b) Observar a ação da lâmpada U.V. sobre a cultura em estudo nos tempos de irradiação. Por que 
houve diferença no crescimento onde a placa foi coberta com papel? 
c) Verificar a eficiência do processo de filtração, através da comparação com a suspensão não 
filtrada. 
 
 
 
Fig. 17 – Conjunto com membrana filtrante 
 
Membrana 
filtrante 
Base 
porosa 
Recipiente para o meio 
Amostras a serem 
filtradas 
Prendedor (garra) 
Tubo de látex ligado 
à bomba a vácuo 
Filtrado esterilizado 
 23 
7.2. CONTROLE DO CRESCIMENTO MICROBIANO POR AÇÃO DE AGENTES 
 QUÍMICOS 
 
 Uma série de compostos químicos em concentrações adequadas, são capazes de inibir ou 
destruir os microrganismos. Assim, é importante conhecer os tipos de substâncias mais apropriadas 
para cada finalidade, bem como sua eficácia como agentes antimicrobianos 
 
OBJETIVO 
Verificar a ação de métodos químicos sobre diferentes microrganismos 
 
MATERIAL 
 culturas fornecidas: 
 soluções de fenol (1, 2 e 3%), etanol (50 e 70%) e água oxigenada (3, 5 e 10%) 
 placas com BHA, tubos com BHI e agar Letheen 
 mertiolate, PVPI 
 discos de papel de filtro inertes, cilindros (carreadores) 
 
MÉTODO 
 
7.2.1. Ação de Sanitizantes/Anti-Sépticos 
 
a) Diluição em tubos (ação direta sobre microrganismos) 
Colocar 5 mL de cada uma das soluções fornecidas: fenol (1, 2 e 3%), etanol (50 e 70%) e 
água oxigenada (3, 5 e 10%) em tubos esterilizados. Em cada um desses tubos acrescentar 0,5mL da 
cultura bacteriana. Após 5, 10 e 30 minutos, transferir uma alça de cada mistura para um dos 
quadrantes da placa de Petri contendo agar Letheen. Incubar por 48 horas a 35oC. 
 
b) Ação de antissépticos sobre a pele 
Passar swabs esterilizados nas mãos de voluntários, de modo que a mão esquerda sirva para 
obtenção do número de microrganismos iniciais e a mão direita, para obtenção do número de 
microrganismos sobreviventes, após a lavagem com sanificantes comercialmente disponíveis. 
Colocar os swabs em caldo peptonado, diluir adequadamente em salina e semear em placas contendo 
PCA. Incubar por 48 h a 35oC. 
 
RESULTADOS 
a) Observar o crescimento dos microrganismos, comparando com o controle sem tratamento. 
b) Relacionar o tipo e concentração do agente químico, com o tempo de exposição para cada uma 
das espécies bacterianas. 
c) Contar o no de colônias das placas e fazer o cálculo. Comparar o no de bactérias presentes nas mãos 
antes e após a lavagem. Calcular a % de redução de microrganismos. 
 
 
 
 
 
 
 24 
7.2.2. Antibiograma 
A prova da sensibilidade a drogas antimicrobianas é utilizada para orientar o tratamento 
clínico, principalmente no caso daqueles que adquiriram resistência. O método mais utilizado para 
avaliar a sensibilidade dos microrganismos às drogas é o da difusão em ágar. Este se baseia na 
capacidade de difusão do antibiótico através de um meio sólido, inibindo ou não o crescimento do 
microrganismo. Utilizam-se discos de papel impregnados com quantidades conhecidas de 
antibióticos, os quais são colocadas na superfície de uma placa inoculada. 
 
OBJETIVO 
Verificar a ação letal de diferentes antimicrobianos sobre cepas microbianas.. 
 
MATERIAL 
 cultura fornecida: 
 caldo e ágar Mueller-Hinton 
 soluções e discos de antibióticos 
 
MÉTODO DA DIFUSÃO 
Semear 0,1 mL dessa cultura para placa com ágar Mueller-Hinton, através de swab ou 
pipeta. Colocar os discos impregnados com antibióticos sobre a superfície do ágar inoculado com 
uma pinça estéril, pressionando levemente e mantendo um espaçamento de modo que fiquem 
suficientemente separados uns dos outros para evitar a superposição dos halos de inibição. Incubar as 
placas por 48 horas a 35-37 oC. 
 
RESULTADOS 
 A leitura das placas deverá se feita medindo-se o diâmetro dos halos de inibição 
(incluindo o diâmetro do disco), e comparando-se com os dados da tabela 1. Classificar os 
microrganismos como resistente, sensível e intermediário. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fig. 18 – Antibiograma por difusão em agar, das bactérias Staphylococcus aureus em meio BHA (à 
esquerda) e Pseudomonas aeruginosa em Agar Cetrimide (à direita). 
 
 
 
 25 
TABELA 1 
Critérios de interpretações baseados no método de Bauer & Kirby, 1966 
 (diâmetro em mm) 
 
Antibacteriano Conc. Disco 
mcg 
Resistente 
(mm) 
Intermediário 
(mm) 
Sensível 
 (mm) 
ÁC. PIPEMÍDICO 20 ≤13 14 a 18 ≥19 
ÁC. NALIDÍXICO 30 ≤13 14 a 18 ≥19 
AMOXILINA 10 
 BGN entéricos ≤ 11 12 a 13 ≥ 14 
 Estaphilococos ≤ 20 21 a 28 ≥ 29 
AZTREONAM 30 ≤ 15 16 a 21 ≥ 22 
AMICACINA 30 ≤ 14 15 a 16 ≥ 17 
AMPICILINA 10 
 BGN entéricos ≤ 13 14 a 16 ≥ 17 
 Estaphilococos ≤ 28 - ≥ 29 
CANAMICINA 30 ≤ 13 14 a 17 ≥ 18 
CARBENICILINA 100 ≤ 18 20 a 22 ≥ 23 
CEFALOTINA 30 ≤ 14 15 a 17 ≥ 18 
CEFOXITINA 30 ≤ 14 15 a 17 ≥ 18 
CEFOTAXIMA 30 ≤ 14 15 a 22 ≥ 23 
CEFTRIAXONA 30 ≤ 13 14 a 20 ≥ 21 
CEFALEXINA 30 ≤ 14 15 a 17 ≥ 18 
CEFADROXIL 30 ≤ 14 15 a 17 ≥ 18 
CEFTAZIDIMA 30 ≤ 14 15 a 17 ≥ 18 
CIPROFLOXACINA 5 ≤ 15 16 a 20 ≥ 21 
CLINDAMICINA 2 ≤ 14 15 a 20 ≥ 21 
CLORANFENICOL 30 ≤ 12 13 a 17 ≥ 18 
ERITROMICINA 15 ≤ 13 14 a 22 ≥ 23 
ESTREPTOMICINA 10 ≤ 11 12 a 14 ≥ 15 
GENTAMICINA 10 ≤ 12 13 a 14 ≥ 15 
IMIPENEM 10 ≤ 13 14 a 15 ≥ 16 
LINCOMICINA 2 ≤ 14 15 a 16 ≥ 17 
NEOMICINA 30 ≤ 12 13 a 16 ≥ 17 
NETILMICINA 30 ≤ 12 13 a 14 ≥ 15 
NITROFURANTOIN
A 
300 ≤ 14 15 a 16 ≥ 17 
NORFLOXACINA 10 ≤ 12 13 a 16 ≥ 17 
OXACILINA 1 ≤ 9 10 a 13 ≥ 14 
PENICILINA G 10 UI 
 Enterococos ≤ 14 - ≥ 15 
 estaphilococos ≤ 28 - ≥ 29 
POLIMIXINA B 300 UI ≤ 8 09 a 11 ≥ 12 
RIFAMPICINA 30 ≤ 11 12 a 18 ≥ 19 
SULFAZOTRIN 25 ≤ 10 11 a 15 ≥ 16 
SULFONAMIDA 300 ≤ 12 13 a 16 ≥ 17 
TETRACICLINA 30 ≤ 14 15 a 18 ≥ 19 
TOBRAMICINA 10 ≤ 12 13 a 14 ≥ 15 
VANCOMICINA 30 ≤ 9 10 a 11 ≥ 12 
 
 26 
EXERCICIO 8 
APLICAÇÕES DA MICROBIOLOGIA NA ÁREA DE SAÚDE 
8.1. ANÁLISE BACTERIOLÓGICA DA ÁGUA – DETECÇÃO DE COLIFORMES 
 
As águas de abastecimento apresentam o risco de serem poluídas por águas residuárias e 
excretos de origem humana ou animal, podendo conter microrganismos patogênicos, tornando-as um 
veículo de transmissão de doenças. Por isso, impõe-se a necessidade de exames rotineiros das 
mesmas, para determinar seu grau de segurança do pontode vista bacteriológico. Os índices de 
qualidade sanitária mais utilizados são os Coliformes que atuam como indicadores de poluição fecal, 
pois ocorrem em grande número na flora intestinal humana e animais homeotérmicos. 
As bactérias do grupo coliforme apresentam-se como bacilos aeróbios ou anaeróbios 
facultativos, Gram negativos, não esporulados, e fermentam a lactose com produção de gás. Inclui os 
gêneros de bactérias: Escherichia, Enterobacter, Citrobacter e Klebsiella. 
"Água potável é definida como aquela adequada ao consumo humano, devendo para tanto 
atender a características físicas, organolépticas e químicas além da bacteriológica, traduzida pela 
ausência de coliformes totais e fecais em 100 mL da amostra". 
Nestas análises, podem-se empregar as técnicas da Membrana filtrante, Tubos múltiplos 
ou ainda Kits para testes rápidos. 
 
8.1.1. Determinação do Número Mais Provável (NMP) de coliformes pela técnica dos tubos 
múltiplos 
 
 MATERIAL: 
- Amostra de água (inativar o cloro com tiossulfato de sódio 0,9%) 
- Tubos com caldo lactosado, verde brilhante-bile e caldo EC 
 
MÉTODO 
É realizado em duas etapas: 
 Teste presuntivo 
Inocular volumes decrescentes da amostra (10, 1 e 0,1 mL) em tubos contendo caldo 
lactosado, em 3 séries com 3 tubos cada uma. Incubar a 35oC por 48 horas. 
 
 Teste confirmativo (coliformes totais e fecais) 
Transferir as culturas de todos os tubos positivos de caldo lactosado para tubos contendo 
caldo verde brilhante-bile e para placas contendo EMB. Incubar por 48 horas a 35 oC. Resultados 
positivos para coliformes totais devem ainda ser confirmados para a presença de coliformes fecais, 
em caldo EC, incubando-se a seguir por 24 horas a 45 oC. 
 
RESULTADO: 
 
Teste presuntivo: (+) organismos que fermentam a lactose com produção de gás. A combinação dos 
resultados positivos e negativos é usada na determinação do NMP (Tabela 2). 
 27 
Teste confirmativo: A produção de gás a partir da fermentação da lactose em presença de bile é 
prova confirmativa positiva para coliformes totais. A presença de gás nos tubos contendo meio EC é 
prova confirmativa para a presença de coliformes fecais. 
Confirmar o NMP pela tabela 2, usando os dados do teste confirmativo. 
 
 
T a be l a 2 . N úmero Mais Provável (NMP) por 100 mL de amostra, 
usando três tubos de cada diluição (volumes com 10, 1 e 0,1 mL) 
 
no de tubos positivos 
na diluição 
NMP por 
100 mL 
no de tubos positivos 
na diluição 
NMP por 
100 mL 
10 mL 1 mL 0,1 mL 10 mL 1 mL 0,1 mL 
0 0 0 - 2 0 0 9,1 
0 0 1 3 2 0 1 14 
0 0 2 6 2 0 2 20 
0 0 3 9 2 0 3 26 
0 1 0 3 2 1 0 15 
0 1 1 6,1 2 1 1 20 
0 1 2 9,2 2 1 2 27 
0 1 3 12 2 1 3 34 
0 2 0 6,2 2 2 0 21 
0 2 1 9,3 2 2 1 28 
0 2 2 12 2 2 2 35 
0 2 3 16 2 2 3 42 
0 3 0 9,4 2 3 0 29 
0 3 1 13 2 3 1 36 
0 3 2 16 2 3 2 44 
0 3 3 19 2 3 3 53 
1 0 0 3,6 3 0 0 23 
1 0 1 7,2 3 0 1 39 
1 0 2 11 3 0 2 64 
1 0 3 15 3 0 3 95 
1 1 0 7,3 3 1 0 43 
1 1 1 11 3 1 1 75 
1 1 2 15 3 1 2 120 
1 1 3 19 3 1 3 160 
1 2 0 11 3 2 0 93 
1 2 1 15 3 2 1 150 
1 2 2 20 3 2 2 210 
1 2 3 24 3 2 3 290 
1 3 0 16 3 3 0 240 
1 3 1 20 3 3 1 460 
1 3 2 24 3 3 2 1100 
1 3 3 29 3 3 3 2400 
 
 
 
 
 
 28 
 
8.1.2. Determinação do número de coliformes pela técnica da Membrana Filtrante 
O método baseia-se na filtração de volumes adequados da amostra de água através de 
membrana filtrante com porosidade de 0,22 m. As bactérias dimensões maiores, ficarão retidas na 
superfície da membrana, a qual é então transferida para placa de Petri contendo meio seletivo e 
diferencial. 
 
MATERIAL 
- Amostra de água e Sistema de filtração com membrana 0,22 m 
- Placas de Petri com meio MacConkey 
 
MÉTODO 
Acoplar a bomba de vácuo a um sistema de porta filtro e membrana com porosidade 0,22 
m estéreis. Filtrar a amostra de água de 100 mL. 
Com o auxílio de pinça estéril, transferir a membrana para a superfície de meio MacConkey. 
Incubar a placa por 48h à 35 oC. 
 
RESULTADO: Contar colônias típicas de coliformes: vermelhas no meio MacConkey. 
 
8.1.3. Determinação do número de coliformes utilizando substratos cromogênicos 
Proceder conforme descrito no manual. 
 
 
8.2. D I A G N Ó S T I C O E M MI C R O B I O L O G I A MÉ D I C A 
 
No campo das doenças infecciosas, os resultados dos testes laboratoriais são em grande 
parte determinados pela natureza do material, a oportunidade da colheita, o cuidado com que ela é 
executada, e a experiência e habilidade técnica do pessoal do laboratório. Esses fatores são mais 
importantes em exames microbiológicos do que naqueles destinados a fornecer dados químicos. Os 
microrganismos são seres vivos, sensíveis a muitos compostos e podem ser encontrados em regiões 
anatômicas, fluídos orgânicos ou tecidos diferentes, durante a evolução natural da maioria das 
doenças infecciosas. 
 
I s o l a me nt o e i de nt i f i c a ç ã o d a b a c t ér i a S t a p h y l o co c cu s s p de a mo s tr as 
b io ló g i c as hu ma n a s 
 
As bactérias dos gêneros Staphylococcus estão amplamente distribuídas na natureza e 
podem ser isoladas de ambientes como comensais da pele, mucosas e outros locais do corpo dos seres 
humanos e animais. Também podem causar uma variedade de infecções. Apresentam-se como cocos 
Gram positivos, agrupados em "cachos", catalase e coagulase positivos. Algumas espécies produzem 
 hemólise em agar sangue. Outras características também são utilizadas para sua identificação como 
a capacidade de fermentar o manitol, redução do telurito e produção de DNAse. 
 
MATERIAL: - Placas com agar sangue, agar manitol 
 - Tubos com BHI e Discos de antibióticos 
- Água oxigenada, sol. HCI 1N, plasma de coelho, Material para coloração de Gram, 
 29 
MÉTODO: 
a) Coletar as secreções assepticamente e semear as amostras em placas contendo agar sangue e 
incubar por 48 horas a 37oC. Colônias típicas serão colhidas e inoculadas em BHI e após crescimento, 
semeadas em meios específicos para a realização de provas morfológicas, bioquímicas e sorológicas. 
 
b) Prova da catalase 
Colocar algumas gotas de água oxigenada sobre uma cultura crescida em BHA e verificar 
a ocorrência de bolhas. 
 
c) Sensibilidade a antibióticos 
Espalhar a cultura em estudo em meio BHA com swab e colocar discos do antibiótico 
novobiocina. Incubar a 37oC por 48 horas. 
 
d) Prova da coagulase 
Retirar uma colônia da bactéria em estudo e colocar em tubo com BHI. Incubar a 37oC por 
18 a 24 horas. Retirar 0,1 mL dessa cultura e colocar em outro tubo contendo 0,5 mL de plasma de 
coelho. Agitar levemente e incubar a 37oC em banho-maria, observando durante 4 a 24 horas a 
ocorrência de coágulo. 
 
e) Prova da DNAse 
Inocular a cultura em placa com meio acrescido de DNA. Incubar a 37oC por 24 horas. 
Verter ácido clorídrico 1N sobre a cultura e verificar a ocorrência de halos claros ao redor das 
colônias. 
 
f) Observação microscópica 
 Preparar esfregaços em lâminas das cultura em estudo e colorir pelo métodos de Gram. 
Determinar a espécie de Staphylococcus, segundo as características da Tabela 3. 
 
Tabela 3 - Características das espécies de estafilococos de importância médica. 
 
 Produção 
coagulase 
Sensibilidade a 
novobiocina 
hemólise Produção de 
DNAse 
Fermentação 
do manitol 
S. aureus + S v + + 
S. saprophyticus - R v - v 
S. epidermidis - S v - - 
S. haemolyticus - S v - - 
 
 
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 
 
-KONEMAN, E.W.; ALEN, S.D.; DOWELL, V.R. e SOMMERS, H. M. Microbiologia Clínica, Ed. 
Panamericana, 2001. 
- MOURA, R.A.;WADA, C. S.; PURCHIO, A. e ALMEIDA, T.V. Técnicas de laboratório. Rio de Janeiro, 
RJ. ED. Atheneu, 511 p., 1994. 
- NEDER, R. M. Microbiologia-Manual de laboratório. Ed. Nobel, 137 p., 1992 
- RIBEIRO, M. C. & SOARES, M. M. S.R. Microbiologia Prática - Roteiro e Manual.. Ed. Atheneu, 
112 p., 1993.