Relatório: Precipitação de Proteínas

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Resumo
	Este procedimento ocorreu na Universidade Estadual Paulista (UNESP) Júlio de Mesquita Filho - Rio Claro. Com o objetivo de observar as ocorrências precipitação das proteínas, considerando sua solubilidade e estruturas moleculares. Para isto, as soluções de proteínas foram separadas em tubos de ensaios, e utilizaram-se diferentes métodos para que acontecesse a desnaturação. Por diversos agentes desnaturantes nas proteínas como calor, acidos, solventes orgânicos, sais de metais pesados entre outros misturados às proteínas. Desta forma foram observadas as várias maneiras pelas quais se dá a precipitação. Observando-se as mudanças de cor, solubilidade e pH. Enfim os resultados foram semelhantes, ocorrendo precipitação, porém através de caminhos diferentes e aparências distintas.
Palavras-chave: análise qualitativa; precipitação de proteínas; estrutura tridimensional de proteínas;
Introdução
As proteínas são polímeros de aminoácidos unidos por ligações peptídicas, uma ligação peptídica é a união do grupo amino (-NH2) de um aminoácido com o grupo carboxila (-COOH) de outro aminoácido, através da formação de uma amida. Apesar de existir diversas proteínas diferentes em estruturas e funções, elas são formadas a partir de 20 aminoácidos diferentes. Os aminoácidos por sua vez apresentam em sua molécula um grupo amino, um grupo a carboxila normalmente tem uma representação comum, onde os grupos aminos e as carboxilas se ligam ao carbono alfa, onde também e ligam um grupo variável (cadeia lateral ou grupo R) e um átomo de hidrogênio (MARZZOCO & TORRES, 1999)
As proteínas são as mais abundantes do contexto celular, são as moléculas com mais variedades no quesito de forma e função. Estas que estão ligados com a formação estrutural e dinâmica. Fazem parte de quase todos os processos biológicos, como incluem as enzimas, que estão presente em todas as reações químicas que ocorre no corpo. Também trabalham como transportadora de moléculas e oxigênio. Responsáveis pela na defesa do organismo, controle de metabolismo, controle gênico, e até contração muscular. (MARZZOCO & TORRES, 1999)
Desnaturação é o processo pelo qual ocorre a modificação da estrutura tridimensional da proteína, quando ela perde algumas de suas funções. Essa modificação se da ao atingir-se o ponto isoelétrico da proteína, através de agentes desnaturastes com a capacidade de atingir as estruturas secundarias, terciarias e quaternárias (muitas das funções dessas proteínas estão ligadas diretamente às suas estruturas), exceto na primaria, que não se perde, assim os aminoácidos continuam unidos. Porém, para algumas proteínas é possível reverter este processo, elas conseguem retornar à sua estrutura terciaria original, quando em exposição a condições iniciais para sua função. (COSTA, 2015)
As proteínas apresentam uma solubilidade bem variável na presença de agua, proveniente da presença de grupos polares (hidrofílicos) e apolares (hidrofóbicos) que está molécula possui. A molécula tende a ser solúvel em água quando os grupos hidrofílicos estiverem "externos", ligando-se com as moléculas de água e os hidrofóbicos "internos", interagindo entre si. A precipitação é, portanto, a alteração das propriedades de uma proteína devido a mudança de sua estrutura tridimensional, que, por sua vez, altera a sua solubilidade, o que leva a ocorrência da precipitação em si. (MASTROENI, 2008)
Existem algumas maneiras de se alterar a solubilidade das proteínas. O calor, que causa o aumento de temperatura, agita as moléculas e altera a formação tridimensional, fragmentando as ligações e deixando os grupos hidrofóbicos expostos. Quando a proteína está em um pH menor que seu pI, ela se encontra em sua forma de cátion, é possível realizar sua precipitação com adição de ânions (tricloroacétato, picrato ou alcaloides), pois isso altera sua solubilidade. Solventes orgânicos causam precipitação por desidratação, e as soluções salinas por efeito salting-out (eleva-se a força iônica da solução e a solubilidade reduz gradualmente). Com a junção de metais pesados, a precipitação ocorre pela junção de cátion metálico com cargas negativas da proteína. As proteínas também podem precipitar pela inserção de ácido nítrico, através da desidratação decorrente do ânion nitrato e a prolongação dos restos de Asp. e Gul. (-COO- +H+ = -COOH), assim rompendo as ligações eletroestáticas. (SKOOG, 2005).
	2. Objetivos
	O objetivo dos experimentos aqui descritos foi observar as diferentes reações da proteína da clara do ovo ao entrar em contato com diferentes substancias, mudanças de pH e temperatura e averiguar também a maneira como as mudanças na estrutura tridimencional das proteínas afetam suas funções. 
	3. Materiais
	3.1 Reagentes 
Solução de proteínas preparada pela diluição de clara de ovo a 10%
Ácido tricloroacético 10%
Acetato de chumbo 0,1M
Sulfato de cobre 0,1M
Álcool etílico absoluto
Hidróxido de sódio 2,5 M
Acetona
Solução alcalina de caseína 1% (PH próximo de 8,0)
Azul de brofenol
Ácido clorídrico 0,1 M 
	3.2 Utensílios 
Bico de Bunsen
Pipeta eletrônica
Pipetas
Tubos de ensaio
	4. Métodos
	Desnaturação da solução de proteínas preparada pela diluição de clara de ovo em concentração de 10%.
	Foram utilizados seis tubos de ensaio numerados de 1 a 6, para a realização de quatro experimentos, em cada um dos tubos colocou-se, com auxílio de uma pipeta eletrônica, 2ml de solução de proteínas preparada pela diluição de clara de ovo contida em um béquer.
Experimento 1 — Desnaturação da proteína por aumento da temperatura.
 	O tubo 1, contendo a proteína da clara, foi aquecido na chama fornecida pelo bico de Bunsen até atingir a fervura. Nesse passo foi importante atentar-se às devidas precauções, para que o tubo de ensaio não se danificasse na presença do calor do fogo, não deixando-o continuamente em contato com a chama e não direcionando a sua boca na direção de ninguém. As mudanças ocorridas foram observadas. 
Imagem 1: Tubo 1 contendo clara de ovo sendo aquecido na chama do Bico de Bunsen
Experimento 2 — Desnaturação da proteína por adição de metais pesados.
	No tubo 2 adicionou-se, com auxílio de uma pipeta, 3 gotas de sulfato de cobre em concentração de 0,1M. As mudanças ocorridas foram observadas.
	No tubo 3 adicionou-se, com auxílio de uma pipeta, 3 gotas de acetato de chumbo em concentração de 0,1M. As mudanças ocorridas foram observadas.
	Em ambos os tubos, 2 e 3, acrescentou-se excesso de reagente até atingir o limite de desnaturação.
Experimento 3 — Desnaturação da proteína por variação de PH.
	No tubo 4 adicionou-se, com auxílio de uma pipeta, 3 gotas de ácido tricloroacético com concentração em 10%. As mudanças ocorridas foram observadas. Em seguida adicionou-se o excesso de ácido até atingir o limite de desnaturação. As mudanças foram observadas novamente. Posteriormente adicionou-se hidróxido de sódio com concentração em 2,5M até que novas mudanças pudessem ser observadas.
Experimento 4 — Desnaturação da proteína por adição de solventes orgânicos.
	No tubo 5 adicionou-se álcool etílico absoluto, com auxílio de uma pipeta, até que mudanças visíveis ocorressem e pudessem ser observadas.
	No tubo 6 os passos do tubo 5 foram repetidos, porém com adição de acetona, até que mudanças visíveis ocorressem.
Experimento 5 — Desnaturação da solução alcalina de caseína com concentração de 1%, com PH aproximadamente igual a 8.
	Em um tubo de ensaio colocou-se 2ml da solução alcalina de caseína com concentração de 1%, em seguida adicionou-se 5 gotas de azul de bromofenol, para verificar o PH da solução. Posteriormente adicionou-se ácido clorídrico, com concentração 0,1M, gota a gota até que mudanças pudessem ser observadas.
	5. RESULTADOS
Experimento 1 — Desnaturação da proteína por aumento da temperatura.
	No tubo 1, assim que a temperatura começou a subir devido ao contato com a chama fornecida pela Bico de Bunsen, a mudança na solução foi visível. Anteriormente homogênea e translúcida, passou a ser heterogênea, com partesbrancas e sólidas que formaram um precipitado.
Experimento 2 — Desnaturação da proteína por adição de metais pesados
	No tubo 2, ao adicionar 3 gotas de sulfato de cobre em concentração de 0,1M à solução de clara de ovo, formou-se pequena quantidade de precipitado na superfície, onde houve contato entre a solução do metal e a solução proteica. Logo após, houve também a formação de quantidade significativa do precipitado, que acumulou-se ao fundo do tubo de ensaio.
	Após a adição de excesso de sulfato de cobre, onde o limite de desnaturação foi atingido, foi possível observar o aumento da quantidade de material precipitado, que passou a ser a única fase dentro do tubo.
Imagem 2: Tubo 2 contendo clara de ovo após adição de excesso de sulfato de cobre
	No tubo 3, ao adicionar 3 gotas de acetato de chumbo em concentração de 0,1M à solução de clara de ovo, formou-se precipitado que imediatamente acumulou-se no fundo do tubo de ensaio. Assim, foi possível observar uma fase homogênea e translúcida acima de outra fase mais densa e branca de precipitado.
Imagem 3: Tubo três contendo clara de ovo após adição de acetato de chumbo
	
	Após a adição de excesso de acetato de chumbo, onde o limite de desnaturação foi atingido, os resultados obtidos foram semelhantes aos observados no tubo 2.
Experimento 3 — Desnaturação da proteína por variação de PH.
	No tubo 4, ao adicionar 3 gotas de ácido tricoloacético em concentração de 10% à solução de clara de ovo, foi observada a formação de precipitado branco e denso ao fundo do tubo de ensaio. Após adição de excesso de ácido, houve maior formação de precipitado também ao fundo do tubo de ensaio. 
Imagem 4: Tubo contendo clara de ovo após adição de ácido tricloroácetico
	
	Quando adicionado o hidróxido de sódio com concentração de 0,25M ao tubo já contendo precipitado recorrente da adição de excesso de ácido, foi possível observar a chamada renaturação, que consistiu na reversão da precipitação. Assim, o precipitado antes existente deixou de estar presente no tubo de ensaio e a solução ali presente tornou-se novamente homogênea e translúcida.
Imagem 5: Tubo 4 contendo clara de ovo com ácido com tricloroácetico após adição de hidróxido de sódio, apresentando a renaturação proteica.
Experimento 4 — Desnaturação da proteína por adição de solventes orgânicos.
	No tubo 5, ao adicionar álcool etílico absoluto à solução de clara de ovo, formou-se uma fase de precipitado branco e menos denso àcima de uma fase não precipitada e translúcida, mais densa se comparada à outra fase. A divisão entre ambas foi extremamente notável.
Imagem 6: Tubo 5 contendo clara de ovo após adição de álcool etílico.
	
	No tubo 6, ao adicionar acetona à solução de clara de ovo, resultados semelhantes aos observados no tubo 5 foram obtidos, com a sutil diferença de o precipitado parecer ainda mais branco e em maior quantidade no tubo 6.
Imagem 7: Tubo 6 contendo contendo clara de ovo após adição de acetona.
Experimento 5 — Desnaturação da solução alcalina de caseína com concentração de 1%, com PH aproximadamente igual a 8.
	No tubo 7, ao adicionar o indicador de pH azul de bromofenol à solução de de caseína alcalina, de concentração em 1%, foi obtida a cor violeta. Uma vez com o indicador ácido-base em solução, o Ácido Clorídrico foi adicionado e foi possível observar a mudança da cor antes violeta para um amarelo esverdeado, além da liberação de bolhas na superfície.
Imagem 8: Tubo referente ao quinto experimento após adição do azul de bromofenol à solução caseína alcalina
Imagem 9: Tubo referente ao quinto experimento após adição do ácido clorídrico à solução de caseína e azul de bromofenol
	
	6. DISCUSSÃO
	Experimento 1 — Desnaturação da proteína por aumento da temperatura.
	No tubo 1, houve precipitação proteica devido à desnaturação de proteínas contidas no albumem da clara do ovo. A desnaturação, nesse caso, se deu por conta do aumento de calor causado pela chama do Bico de Bunsen, que atuou alterando a estrutura tridimencional natural das proteínas envolvidas e, por consequência, sua solubilidade em água. O calor, por prover agitação às moléculas, afeta as pontes de hidrogênio, que são importantes para a manutenção da configuração das proteínas.
Experimento 2 — Desnaturação da proteína por adição de metais pesados
	Nessa etapa do experimento, a adição de metais pesados (sulfato de cobre e acetato de chumbo) aos tubos 2 e 3 causou a desnaturação e, por consequinte, a precipitação das proteínas presentes no albumem da clara do ovo. A precipitação, aqui também causada pela não solubilidade em água das proteínas após mudança da estrutura tridimensional da proteína, foi ocasionada pela junção do cátion metálico do cobre e do chumbo com cargas negativas da proteína.
	Em ambos os casos, ocorre o acúmulo de precipitado no fundo dos tubos devido à alta densidade dos tipos de metais utilizados.
Experimento 3 — Desnaturação da proteína por variação de PH.
	Nesse experimento, a precipitação ocorreu por consequência da desnaturação ocasionada pela mudança do pH do meio, após adição de ácido tricoloacético. A mudança na solubilidade se dá quando a proteína se encontra em sua forma de cátion (pH menor que seu pI) e são adicionados ânions (tricloroacétato) à solução inicial. 
	Também foi possível observar o fenômeno da chamada renaturação, após adição de hidróxido de sódio, processo pelo qual a estrutura tridimensional alterada da proteína retorna à sua estrutura terciaria original por estar novamente em um meio neutro, não mais ácido.
Experimento 4 — Desnaturação da proteína por adição de solventes orgânicos.
	No quarto experimento a precipitação também ocorreu devido a desnaturação, agora ocasionada pela adição de solventes orgânicos (no caso, acetona e álcool etílico) às proteínas da clara do ovo. A mudança da estrutura tridimensional nesse experimento se deu por conta do potencial desses solventes de neutralizar as cargas proteicas.
	A acetona apresentou maior quantidade de precipitado por ter a menor constante dielétrica dentre ela mesma, o álcool etílico e água, tendo assim maior potencial de anulação de cargas.
	Em ambos os casos as fases contendo precipitados e solventes orgânicos ficam acima da fase translúcida pelo fato de a densidade destes ser menor.
Experimento 5 — Desnaturação da solução alcalina de caseína com concentração de 1%, com PH aproximadamente igual a 8.
	No último experimento, solução de caseína (proteína fosfolipídica) foi utilizada junto do azul de bromofenol, que serviu para indicar o valor aproximado do pH da solução. O azul de bromofenol muda de cor de acordo com a escala do pH, para valores acima de 4,7 encontramos a cor azul/violeta e abaixo disso a cor fica verde amarelada. 
	Antes da adição do Ácido Clorídrico (que tem pH aproximado de 2,5), a cor observada era violeta. Conforme a adição do ácido foi feita, formou-se precipitado, que desapareceu ao passo que mais ácido foi adicionado ao tubo. A caseína apresenta desnaturação quando sofre queda no pH. Após adição de certa quantidade de ácido, a cor mudou de violeta para verde amarelado, indicando que o pH estava abaixo de 4,7 e o meio encontrava-se ácido.
	A precipitação ocorrida se dá também pela mudança de pH, como ocorrido no experimento 3.
	7. Conclusão
	Com os experimentos realizados foi possível a observação das diferentes formas de precipitação e desnaturação e assim a compreensão da diversidade de estruturas. Foi analisado as cores, mudanças de temperatura e consistência das amostras e assim as amostras apresentaram diversas mudanças de acordo com os reagentes. 
	8. Bibliografia
MASTROENI, M. F., GERN, R. M. M. Bioquímica: Práticas Adaptadas. Atheneu, São Paulo – SP, 2008
SKOOG, A. D., WEST, D. M., HOLLER, F. J., CROUCH, R. S., Fundamentos de Química Analítica. Tradução da 8ª edição norte-americana. Editora Thomsom. 2005.
Costa, Yanna Dias, Desnaturação. Mestrado Profissional em Conservação da Fauna Silvestre (UFSCar e Fundação ParqueZoológico de São Paulo, 2015)