PCR

Prévia do material em texto

Polymerase Chain Reaction 
 
Reação de polimerização em cadeia 
ou 
Polimerização em cadeia do DNA 
PCR - consiste em fazer cópias de DNA “in vitro”, usando os 
elementos básicos do processo de replicação natural do DNA. 
PCR foi idealizada como um método para isolar 
rapidamente sequências específicas a partir de uma mistura 
complexa de seqüências genômicas ou de cDNAs. 
PCR alcançou objetivos bem mais amplos que os propostos 
inicialmente. PCR é comparada em importância à definição 
da estrutura do DNA. 
Publicação: 
Mullis and Faloona, 1987 
Saiki at al. 1988 
1984 - PCR foi apresentada pela primeira em 
um encontro científico 
1976: Thomas D. Brock descobriu a DNA polimerase termoestável 
de Thermus aquaticus. 
1988: Esta DNA polimerase foi usada por Saiki para fazer PCR. 
PCR requer 7 componentes essenciais: 
 
- DNA polimerase termoestável 
 
- Um par de oligonucleotídeos para iniciar a síntese de DNA 
 
- Deoxinucleotídeos trifosfato (dNTPs) 
 
- Cátion divalente: toda DNA pol. requer cátion divalente, 
 usualmente Mg2+ 
 
- Tampão para manter o pH 
 
- Cátions monovalentes, usualmente K+ (KCl) 
 
- Template de DNA 
Virtualmente, qualquer seqüência alvo de DNA pode ser amplificada 
por PCR. 
 
A localização da seqüência alvo é feita pelos iniciadores (primers). 
Oligonucleotídeos com 17 “mers” são usualmente seletivos o 
suficiente para localizar um sítio único em um genoma de alta 
complexidade, tal como o genoma humano. 
 
Pareamento: pontes de hidrogênio 
Watson e Crick: 
A T 
C G 
A TÉCNICA DE PCR 
PCR 
A TÉCNICA DE PCR 
PCR é um processo iterativo, consistindo de três elementos: 
- Desnaturação da template por aquecimento 
- Pareamento dos iniciadores à seqüência alvo fita única 
- Extensão dos iniciadores pela DNA polimerase termoestável 
 
Separação das fitas é denominada “FUSÃO” da molécula 
de DNA - “MELTING” 
 
MELTING POINT de “primers” para PCR: 
TEMPERATURA NA QUAL 50% DAS TEMPLATES ALVO 
ESTÃO PAREADAS COM OS “PRIMERS” 
Cada uma das novas fitas de DNA extendidas a partir dos “primers” serve como 
template para síntese de uma nova fita. Os “primers” presentes na reação fazem 
o pareamento com as novas fitas, na região de complementariedade 
antiparalela entre “primer”- “template”. Isso garante a aumento exponencial do 
número de novas fitas. 
 
 Todas as fitas de DNA sintetizadas durante a PCR têm a sequência de um dos 
primers na extremidade 5’ e a seqüência complementar ao outro primer na 
extremidade 3’ 
“primers” complemento dos “primers” 
forward 
reverse 
5’ 
3’ 
3’ 
5’ 
5’ 3’ 
5’ 3’ 
5’ 
3’ 
3’ 
5’ 
5’ 3’ 
5’ 3’ 
5’ 
5’ 3’ 
É feito um 
segmento 
complementar 
ao primer 
Amplificação específica 
Amplificação inespecífica 
Quando os produtos de PCR são usados como template eles já têm 
“match” perfeito com os primers 
Produtos específicos 
Produtos inespecíficos 
Tanto produtos específicos como inespecíficos têm sítios para 
pareamento perfeito dos primers e continuarão a ser amplificados nos 
diversos ciclos da PCR 
No = número inicial de 
cópias de DNA-dupla fita 
(template) 
 
Nf = número final de cópias 
da seqüência alvo (dupla 
fita) 
 
Y = eficiência da extensão 
do “primer” por ciclo 
 
n = número de ciclos 
Cinética da PCR: 
- Fase de “screening” - ciclos iniciais 
• Os “primers” (ou iniciadores) procuram a “template” de DNA. 
- Fase intermediária: 
• Acúmulo exponencial do fragmento de DNA. 
- Fase de amplificação linear: 
• A amplificação já é sub-ótima. 
- Fase de platô: a quantidade de produto é estável. 
 
1 g de DNA 
genômico tem 
3 x 105 cópias do 
genoma de 
mamíferos 
Cinética da reação 
O crescimento linear (plot semi-log) do número de cópias ocorre até um determinado 
número de ciclos. A saturação ocorre quando a concentração de produto amplificado atinge 
~ 10-8 M ou ~ 1012 moléculas por 100 l. 
 
As causas do platô são várias: 
- Perda da atividade da enzima 
- Todas as enzimas disponíveis estão ocupadas com a síntese de DNA 
- Acúmulo de produtos amplificados que tendem a parear entre si, em detrimento do 
pareamento com os “primers”. Nesse ponto, a possibilidade de amplificação de produtos 
inespecíficos é maior. 
- Gasto dos reagentes, especialmente inativação da DNA polimerase 
- Acúmulo de pirofosfato (PiPi) 
- Competição com outros produtos que vinham sendo amplificados com eficiência menor 
mas que também foram se acumulando 
etc 
Eficiência da amplificação 
A eficiência média de amplificação é 0,85. Pequenas alterações para menos 
podem fazer com que o produto não seja detectado. 
Redução de 1% na eficiência, redução de 15% no produto final após 25 ciclos. 
Parâmetros mais importantes para a otimização de PCR: 
 
 - Temperatura de “annealing” dos primers 
 - Regime de ciclos 
 - Composição do tampão 
Componentes do tampão para PCR (10 X): 
- Tris.HCl - 100 mM (pH 8.3 a 25oC) 
- KCl - 500 mM 
- gelatina 1 g/L ou 
- Albumina bovina 
- 0,1% Tween-20 ou 
- 0,1% Laureth 12 ou 
- 0,1% NP-40 
- MgCl2 - 15 mM 
 
estas substâncias aumentam a 
estabilidade da enzima 
10 a 50 mM de Tris HCl - pH entre 8,3 e 8,8 (a 20oC) - 
Usualmente 10 mM Tris-HCl/pH 8,3 
 
 
O pH do tampão Tris varia muito com a temperatura (6,8 a 8.3 
durante a PCR). O pH mais baixo é atingido em temperaturas 
mais elevadas. 
 
 
MgCl2: testar de 0,5 a 5 mM em steps de 0,5 ou 1 mM 
(para multiplex, até 10 mM) 
- Se a concentração de Mg2+ é muito baixa, temos pouco ou 
 nenhum produto 
- Se a concentração de Mg2+ é muito elevada, a PCR tem baixa 
especificidade. Observa-se muitas bandas ou “smear”. 
 
A concentração de Mg2+ deve superar em 1,2 mM a 
concentração total de dNTPs, porque esta é a concentração de 
Mg2+ livre necessária para atividade ótima da enzima. 
 
dNTPs: 
 
Usar dNPTs preparados para PCR, pois são fornecidos com pH adequado (8.1) e 
sem pirofosfato. Acúmulo de PiPi pode inibir a reação de polimerização. 
 
Usar entre 20 e 200 M, procurando a concentração que forneça o máximo de 
produto com o máximo de especificidade. 
 
Menor concentração de dNTPs: maior especificidade, com pouco produto final. 
 
Maior concentração de dNTPs: há aumento da quantidade de produto com 
perda de especificidade. 
Primers: 
 
A concentração ótima de “primer” é entre 0,1 e 0,5 M 
Ambos os membros do par devem ser usados na mesma 
concentração. 
 
Excesso de “primers” induz aparecimento de produtos 
inespecíficos e formação de dímeros de “primers”. 
Concentração de reactantes e produtos antes e após 30 ciclos de PCR 
DNA polimerases utilizadas em PCR 
DNA polimerases: 
Todas sintetizam uma fita nova de DNA extendendo um “primer”, através da 
incorporação de nucleotídeos do meio, na direção 5’  3’, tendo como orientação 
para a incorporação dos nucleotídeos a informação contida na fita molde (template). 
Todas são DNA-pol na direção 5’ 3’ 
As DNA polimerases usualmente têm também atividade exonucleásica: 
 
 na direção 3’ -> 5’: uma atividade corretiva - “proof reading” 
 
 na direção 5’ -> 3’: atividade de reparo do DNA (remoção de um segmento 
de DNA que está na “ frente” da enzima) 
DNA polimerases termoestáveis: 
 
 DNA polimerase de Thermus aquaticus (Taq - polimerase) - a primeira a ser 
descoberta e a mais utilizada. 
Esta DNA polimerase termófila não tem atividade de exonuclease 3’- 5’, ouseja, 
não tem atividade corretiva, mas tem atividade exonucleásica 5’3’ 
A taxa de incorporação de bases erradas durante a PCR pode variar entre 10-3 a 
10-6, dependendo especialmente das concentrações de Mg2+ e dNTPs 
 
A incorporação de base errada (mismatch) reduz a estabilidade da interação da 
enzima com o DNA. 
Baixa temperatura de extensão e elevada concentração de dNTPs favorecem a 
extensão de “primers” com pareamento imperfeito e a extensão após mismatch. 
 
 
DNA polimerases podem adicionar uma base a mais na extremidade 3’ OH, 
independetemente da “template”. 
A probabilidade de adição é maior quanto maior a concentração de Mg2+ e de 
enzima e se as últimas bases imporadas previamente forem A ou T. 
A base a adicionada é quase sempre A. 
5’xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx3’ 
3’ yyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyy5’ 
 
5’ xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx3’ 
3’Ayyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyy 5’ 
 
5’ xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxA3’ 
3’ yyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyy5’ 
 
 
5’ xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxA3’ 
3’Ayyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyy 5’ 
 
5’ xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxA3’ 
3’A yyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyy 5’ 
1º ciclo 
2º ciclo 
DNA polimerases termorresistentes com atividade corretiva: 
 
Uemori et al. 1997: DNA polimerase de Pyrococcus furiosus (Pfu) - com duas 
subunidades codificadas por genes dispostos em seqüência num único operon. 
Tem forte atividade exonucleásica 3’5’ (proof reading). 
 
 Tli DNA polimerase: derivada do Thermoccocus litoralis. (Promega) 
 
 Vent DNA polimerase: é a forma recombinante da Tli (New England Biolabs) 
Ambas têm atividade exonucleásica 3’ 5’ e são mais termoestáveis que a Taq 
(meia vida de 6,7 h a 95oC). Sintetizam fragmentos de até 13 kpb. 
 
 DeepVent DNA polimerase: extraída do Pyroccocus GB-D. (New England) 
 
 Pwo polimerase (Boehringer Mannheim) 
 
Ao usar DNA-polimerase com atividade “proof-reading” (exonuclease 
3’ 5’), deve-se usar uma maior concentração de dNTPs (no mínimo 
200 mM de cada), para evitar que a enzima destrua os “primers” ou 
mesmo os produtos de PCR em forma de fita única. Estas polimerases 
degradam DNA fita única. 
 
Enzimas com atividade corretiva não adicionam uma base a mais na 
extremidade 3’ (-A), como ocorre com a Taq polimerase usual e 
outras enzimas sem atividade corretiva. 
Avaliar o produto final da PCR 
 
 
Eletroforese: 
 
 Tipo de tampão 
 
 Voltagem 
 
 Coloração 
 
 
- Evitar produtos inespecíficos na PCR 
 
- Otimizar a reação 
Hot Start PCR 
(Faloona et al. 1990) 
 
A reação de amplificação é 
iniciada em temperatura 
elevada 
Vantagem: 
se não há amplificação de 
produtos inespecíficos, há 
aumento da especificidade e 
do rendimento da reação de 
amplificação. 
Elimina “primer-dimers” 
A polimerase é ativa em faixa ampla de temperatura. 
A atividade da enzima varia em 2 duas ordens de 
grandeza entre 20 e 85oC. 
 
Como fazer “hot start PCR” ? 
 
- Anticorpo anti-DNA polimerase (Life, Clontech, Sigma…) 
- “High-affinity oligonucleotide ligands (aptamers)" - permanecem ligados à 
polimerase a baixas temperaturas, inativando-a. 
- Taq-polimerase modificada quimicamente: 
O modificador é permanentemente liberado em temperatura elevada. A 
liberação é gradual, diferentemente dos dois métodos anteriores 
(AmpliTaq Gold - PE Applied Biosystems) 
Alguns “aditivos” podem aumentar a especificidade e o 
rendimento da PCR 
• DMSO (1 - 10%) – (10% DMSO inibe a atividade da enzima em cerca 
de 50%) 
• PEG-6000 (5 - 15%) 
• Glycerol (5 - 20%) 
• Detergentes não iônicos 
• Formamida (1,25 - 10%) 
• Albumina sérica bovina (10 - 100 g/ml) 
• Betaína 
• Tetrametilamônio (TMAC) 
Quantidade de enzima: 
 
• Se não se observa produto de PCR ou se observa muito pouco 
produto, o problema pode ser a quantidade de enzima. 
 
• Quando se usa enzima com atividade corretiva, deve-se usar uma 
quantidade maior, porque a processividade destas enzimas é 
menor. 
 
Se possível, reduza a temperatura e o tempo de desnaturação. 
 
Caso não consiga amplificação com uma dada enzima, teste outras 
enzimas. 
A concentração de “primers”: 
 
A proporção “primer-template” deve ser entre 107 a 108, no início da 
PCR. 
 
Se a quantidade inicial de moléculas alvo é menor que 100, inciar a 
PCR com 1 pmol. 
 
Após os 5 ciclos iniciais, aumentar a “concentração dos “primers”. 
 
 “Booster PCR” 
Temperatura de annealing dos primers: 
 
O pareamento específico depende criticamente da temperatura, além de ser 
influenciado pela concentração de cátions, de “primers”, tempo na temperatura 
de annealing e outros fatores, como presença de aditivos. 
 
A temperatura de “annealing” deve ser a mais alta possível que permita o 
pareamento. 
 
Pode-se fazer também “touch down PCR”: 
Exemplo: variar a temperatura de “annealing” entre 65oC e 55oC, reduzindo a 
temperatura em 1oC a cada 2 ciclos, durante 20 ciclos. Fazer mais 10 ciclos a 55oC. 
Usar ter,ocicladores com gradiente 
Magnésio: 
 
Concentração de Mg2+ afeta: 
 - annealing dos primers 
 - temperatura de desnaturação da template e dos 
 produtos amplificados 
 - especifidade da reação 
 - formação de dímeros de primers 
 - atividade e fidelidade da enzima 
 
Usualmente se começa com 1,5 mM 
Pode-se utilizar de 0,5 mM a 5 mM de Mg2+ na reação. 
Template: 
 
A quantidade de template a ser adicionada depende do 
tipo de material que estamos utilizando. 
 
DNA genômico: 50 a 250 ng 
1 g de DNA genômico tem 3 X 105 moléculas de um gene único. 
O mesmo número de moléculas está presente em: 
- 10 ng de DNA genômico de levedura 
- 1 ng de DNA genômico de E. coli. 
- 1-2 pg de plasmídeo 
- 2 pg de bacteriofago l 
 
 
Parâmetros dos ciclos: 
 
Temperatura e Tempo de desnaturação: 
 
A desnaturação da template ocorre entre 90oC e 98oC 
Primeira desnaturação: 2 a 5 min a 92oC a 95oC 
Desnaturação nos demais ciclos: 94oC por 15/30 segundos 
Falta de desnaturação da template é uma causa comum de falha na 
PCR. 
Tempo de desnaturação muito longo reduz a meia vida da enzima e 
pode causar depurinação do DNA. 
Temperatura e tempo de extensão: 
 
Temperatura de extensão: usualmente 72oC 
Nessa temperatura, há incorporação de 35 a 100 nucleotídeos 
por segundo, dependendo da enzima, do tampão, do pH, da 
concentração de sal, da natureza do DNA - template. 
 
Tempo de extensão: depende do tamanho do amplicon; 
1 minuto é suficiente para um amplicon de 2 kb 
 
Processividade da Taq polimerase: - 0,25 nt/s a 22 oC 
 - 1,5 nt/s a 37 oC 
 - 24 nt/s a 55 oC 
 - > 60 nt/s a 70 oC 
 - 150 nt/s a 75 – 80 oC 
 
Nested PCR pode ser uma alternativa para melhorar a 
especificidade e a sensibilidade da PCR 
 
 
Problemas comuns e algumas sugestões para solução: 
 
1 – Nenhuma ou pouquíssima amplificação 
 
• Desnaturação incompleta da “template” 
 Ferva o DNA antes de misturar os reagentes 
• Fortes estruturas secundárias na “template” 
 Adicione 7-deaza-dGTP (3:1 ao dGTP) 
 Adicione DMSO até 10% e/ou glicerol até 12% e/ou formamida até 10% 
 Use Taq com deleção N-terminal 
• Sua template alvo não está presente na amostra 
 Faça um controle positivo 
• Desnaturação incompleta dos produtos de PCR 
Aumente o tempo de desnaturação para 1 minuto 
• Não pareamento dos primers 
 Abaixe a temperatura de annealing 
• Seqüênciados primers pode estar incorreta 
 Verifique a seqüência dos primers 
• Magnésio insuficiente 
 Teste concentrações a 1 a 10 mM em passos de 0,5 mM 
Sugestões de solução para “smears”: 
 
• Reduza a quantidade de DNA 
• Aumente a temperatura de “annealing” – em passos de 2oC 
 (amplificador com gradiente) 
• Reduza a concentração de enzima – em passos de 0,25 U 
• Reduza a concentração de Mg2+ - em passos de 0,1 mM 
• Aumente o tempo de desnaturação – em passos de 5 s 
• Aumente a temperatura de desnaturação – em passos de 1oC 
• Reduza o número de ciclos – em 5 a 10 ciclos 
• Faça hot start 
• Faça touch down 
• Reduza o tempo de extensão 
• Reveja o desenho dos “primers” 
PCR a partir de RNA 
RT-PCR 
RT – PCR (Powell e col. Cell 1987, 50:831-840) 
 
• DNA- Polimerase não usa RNA como “template” 
• Primeiro é necessário fazer a transcrição reversa do RNA 
em cDNA 
• RT: Reverse Transcriptase 
• Após a transcrição reversa, prossegue-se normalmente 
com o PCR 
RT-PCR eficiente: 
• RNA da mais alta qualidade, íntegro, sem sinais de 
degradação. 
• RNA livre de DNA 
• Livre de inibidores 
• Livre de nucleases 
Abundância No. de cópias No. de mensagens 
diferentes por célula 
Abundância de 
cada mensagem 
baixa ~ 10 ~ 11.000 < 0,004% 
intermediária ~ 200 ~ 500 < 0,1% 
alta ~ 12.000 ~ 10 3% 
Tipicamente, uma célula de mamífero tem ~10 pg de RNA por célula. 
 
1 mg de RNA total representa ~ 100.000 células. 
 
 
TRANSCRIPATASE REVERSA é uma DNA polimerase que utiliza RNA como 
“template” 
 
Precisa de primer, como toda DNA polimerase 
 
A polimerização é sempre na direção 5’  3’ 
 
Trancriptases reversas de origem viral não têm atividade exonucleásica 
3’  5’ (“proof reading”) ou 5’ 3’ 
Transcriptases Reversas mais comumente usadas: 
 
 
AMV-RT (de virus de aves) 
 
M-MLV-RT (de virus de mamífero – mouse) 
Transcriptases reversas 
mesófilas 
(funcionam bem a 37-42 oC) 
Primers 
 
Transcrição 
 
Reversa 
É altamente recomendável que o RNA a ser utilizado para RT-PCR seja 
previamente tratado com DNase RNase-free. 
 
Pequenas quantidades de DNA genômico podem permitir a 
amplificação do produto procurado, dando-nos a falsa impressão de 
que o amplicon é proveniente de cDNA sintetizado a partir de RNA 
pela transcripase reversa. 
 
Faça sempre um controle negativo, em que a reação de amplificação 
é feita sem a adição de transcriptase reversa. 
Cuidado com pseudo-genes completamente processados: cerca de 50% dos genes têm um 
pseudogene correspondente processado 
Exemplo de amplificação simultânea de fragmento de 
DNA genômico e de fragmento de cDNA 
A Transcrição Reversa é o passo menos reprodutível na RT-PCR 
 
O sucesso da transcrição reversa depende de vários fatores: 
• Integridade do RNA é o fator fundamental 
• Ausência de contaminantes no RNA tais como LiCl, SDS, EDTA e outros 
• As condições da reação - concentração e tipo de tampão, pH, Mg2+ ou 
 Mn2+, dNTPs etc - devem ser otimizados 
• Estruturas secundárias estáveis no RNA dificultam a progressão da 
 enzima; regiões ricas em GC são difíceis de serem reversamente 
 transcritas. 
 
 
 
AAAAAAAAAAAAAA 
AAAAAAAAAAAAAAA 
AAAAAAAAAAAAAA 
TTTTTTT 
TTTT 
 
TTTTTTT 
mRNA 
cDNA 
Estruturas 
secundárias 
abortam a 
transcrição 
reversa 
primers 
oligo-dT 
Sendo esta a seqüência alvo para PCR, o primer 
sense sintetisado para a PCR será o primer para a 
sintese da 2a. fita de cDNA, que será sintetizada 
pela Taq DNA polimerase 
TTTT 
AAAA 
AAAA 
O RNA se degrada a 94oC, 
em presença de íons 
divalentes 
 
TTTTTT 
 
A eficiência da PCR após a transcrição reversa pode melhorar muito 
com a adição de RNase H ou por desnaturação do cDNA a 97oC por 
5 minutos, imediatamente antes da PCR. 
TTTT 1a. fita de cDNA 5’ 3’ 
5’ 3’ 
fragmentos de RNA estáveis em regiões ricas em G e C 
Híbrido DNA/RNA tem Tm mais elevado que DNA/DNA 
AMV-RT (de virus de aves) 
M-MLV-RT (de virus de mamífero – mouse) 
Transcriptases reversas mesófilas 
(funcionam bem a 37-42 oC) 
Não funcionam bem com RNAs com estruturas secundárias estáveis. 
Thermo-Script RT 
 
É uma enzima que permite realizar transcrição reversa em temperatura elevada 
(60oC) 
 
Essa enzima é proveniente da AMV-RT, que foi modificada para eliminar a atividade 
de RNase H e para ter termoestabilidade. 
 
rTth polimerase: 
Isolada da eubatéria termofílica Thermus thermophilus 
 
• DNA polimerase termófila que tem atividade de transcripatse reversa em 
temp. elevada (60-70 oC). Como funciona em temperatura mais elevada, as 
estruturas secundárias do RNA podem ser desfeitas nessa temperatura. 
 
• Primer usado para RT deve ser específico, com Tm elevado. 
 
• rTth tem atividade exonucleásica 5’3’ e atividade 
de RNase H, mas não cliva híbrido RNA-DNA endonucleoliticamente, como 
AMV e M-MLV. 
 
rTth – a mesma enzima é usada para RT e PCR 
 
Atividade de RT favorecida pela presença de Mn2+ 
 
Primeiros experimentos com rTth: 
 
 Mn2+ para RT 
 
 EGTA para quelar Mn2+ 
 
 Adição de Mg2+ para PCR 
 
Atualmente RT e PCR são realizadas com Mn2+ 
 
 
Inconvenientes do Mn2+: degrada RNA em temperatura elevada e 
aumenta erros de incorporação de bases na PCR. 
Nova geração de RT termófilas: 
 
• T. Z05 DNA polimerase: 
DNA polimerase com atividade de RT isolada de Thermus Z05. 
Também dependente de Mn2+, porém mais estável que rTth 
 
• rTth mutada para aumentar a eficiência de RT na presença de Mg2+ 
 GeneAmp AccuRT RNA PCR Enzyme (Roche) 
 
Montagem de um laboratório para PCR 
Células 
 
Lise e purificação 
 
DNA 
RNA viral 
mRNA e 
rRNA 
DNA 
genômico 
purificado 
cDNA 
PCR 
Hibridização, 
dot, slot, e 
microplaca 
Sequencia- 
mento de 
DNA 
PCR 
em tempo 
real 
Eletroforese 
Possibilidade 
de 
contaminação 
Laboratório para PCR 
Todas as salas devem ter: pipetadores, geladeira, freezer -20oC, bancada de 
trabalho. 
1 - Sala para preparo de reagentes 
Equipamentos: microcentrífuga, vórtex, dH2O, máquina de gelo, balança, 
pHmetro. 
2 – Sala para preparo de amostras 
Equipamentos: microcentrífuga, vórtex, fluxo laminar (p/ proteger a pessoa que 
trabalha) 
3 – Sala de 1ª. PCR: termocicladores 
4 – Sala de 2ª. PCR: termocicladores 
5 – Sala de pós-PCR: cubas de eletroforese, fontes de voltagem, micro-ondas, 
transiluminador, sistema de documentação de imagem de gel. 
 
• Pipetadores devem ser dedicados para as áreas específicas; e os 
pipetadores para pipetar DNA nas misturas de PCR devem ser com 
dispensadores positivos (que não provocam aerossol) ou com ponteiras 
com filtro, nunca reutilizadas. Uma partícula de aerosol usualmente tem 
24.000 cópias do DNA amplificado. 
 
• Exposição da área de preparo, do material, e mesmo de alguns 
reagentes, a luz ultravioleta (UV) danifica o DNA que eventualmente esteja 
contaminando o local, tornando-o não amplificável. É mais fácil danificar 
DNAs longos e ricos em pirimidinas. 
 400 mW/cm2 - reduz contaminação com moléculas de DNA. 
 Redução em 1000 vezes, com exposição por 4 h. 
 
· Não reutilize os plásticos (tubos, ponteiras) 
· Todo o material deve ser estéril. Autoclave as partes autoclaváveis do 
pipetador. 
· Todas as soluções devem ser autoclavadas. 
· Não podem ser autoclavados: oligonucleotídeos, DNA, RNA, enzima DNA 
polimerase, dNTPs. 
· As ponteiras devem ter filtro protetor, o que evita contaminação porformação de aerossol 
· Avental específico para ser utilizado apenas na área para PCR, sendo que o 
que foi usado na área de pós-PCR não pode ser usado nas demais áreas. 
· A área pós-PCR deve estar distante das áreas de preparo de amostra e de 
pipetagem dos reagentes. 
• Use luvas descartáveis e troque-as com freqüência e sempre quando 
entrar na área 1 ou 2. Tire as luvas e avental antes de sair da sala. 
 
• Limpe a bancada de trabalho ao começar e ao terminar. 
 
• Adicione o DNA por último na reação, para evitar transferência de 
amostras de DNA de um tubo para outro. 
 
• Faça sempre um controle negativo, sem template. Prepare o tubo 
controle negativo por último, para que este seja representativo da 
manipulação que ocorreu nos demais tubos. 
 
• Para evitar contaminação na fase de eletroforese, lave bem a cubas de 
eletroforese, bandejas e pentes com HCl 1 M. 
Controles: 
 
• Controle negativo: sem DNA 
• Controle positivo: DNA sabidamente com a seqüência alvo 
• Controle interno: primers para outra seqüência alvo 
PCR: evitando contaminação por “carryover” 
• Uso de Uracil-DNA-glicosilase (UNG) e deoxiuridina 
trifosfato (dUTP) 
Lembre-se: 100 ml de uma reação de PCR usual, diluídos na água de uma 
piscina olímpica, resulta em 400 moléculas por 100 ml da água da piscina !! 
• O produto de PCR com dUTP pode ser utilizado para praticamente todas 
as aplicações de um produto de PCR usual com dTTP. 
 
• DNA polimerase com atividade corretiva não incorpora dUTP ! 
 
• Tome o cuidado de desnaturar completamente a UNG, para que não haja 
destruição de seu produto de PCR. 
 
Uma alternativa ao uso de dUTP é sintetizar os primers com dUTP. 
Ao final da PCR, uracil-DNA glicosilase destrói os primers nas extremidades dos 
fragmentos amplificados, inutilizando-os para amplificação posterior