SEPARAÇÃO DE PIGMENTOS DE FOLHAS VERDES POR CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA DE SÍLICA GEL (1)

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SEPARAÇÃO DE PIGMENTOS DE FOLHAS VERDES POR CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA DE SÍLICA GEL (CCD)
Este experimento visa apresentar aos alunos algumas técnicas básicas empregadas em um laboratório de química orgânica. Faremos uso de métodos simples de extração (líquido-líquido) e cromatografia, a fim de analisar visualmente uma mistura de compostos orgânicos e isolar substâncias coloridas encontradas em material vegetal. 
Objetivo: Verificar a separação por CCD dos pigmentos (( caroteno, clorofila A e B) extraídos de folhas verdes (espinafre).
Introdução: Entre os métodos modernos de análise, a cromatografia ocupa um lugar de destaque devido a sua facilidade em efetuar a separação, identificação e quantificação de espécies químicas, por si mesma, ou em conjunto com outras técnicas instrumentais de análise, como por exemplo, a espectroscopia no infravermelho ou a espectrometria de massas. 
A cromatografia é um método físico-químico de separação dos componentes de uma mistura, realizada através da distribuição destes componentes em duas fases, que estão em contato íntimo. Uma fase permanece estacionária e outra se move através dela. Durante a passagem da fase móvel pela fase estacionária, os componentes da mistura são distribuídos entre as duas fases, de tal forma que cada um dos componentes é seletivamente retido pela estacionária, resultando em migrações diferenciais destes componentes. São vários os critérios usados para classificação das diferentes modalidades de cromatografia, sendo os mais comuns relacionados à técnica empregada, o mecanismo de separação envolvido e aos diferentes tipos de fases usadas. Na cromatografia em CCD a fase estacionária é a sílica e a fase móvel uma mistura de solventes. Toda cromatografia trabalha com o mesmo princípio: depende de diferenças de solubilidade ou adsorvidade das substâncias em relação às duas fases.
Cromatografia em camada delgada: A cromatografia em camada delgada (CCD) consiste na separação dos componentes de uma mistura através da migração diferencial sobre uma camada delgada de adsorvente retido sobre uma superfície plana. O processo de separação está fundamentado principalmente no fenômeno de adsorção. Este processo físico é baseado principalmente em atrações eletrostáticas ou dipolares (forças de Van der Waals), incluindo a formação de pontes de hidrogênio. Quando se trata de um sólido, como sílica ou alumina, como fase estacionária, a adsorção ocorre na interface entre sólido e a fase móvel, devido a presença de grupos ativos nas suas superfícies.
A CCD é uma técnica simples, barata e muito importante para a separação rápida e análise quantitativa de pequenas quantidades de material. Ela é usada para determinar a pureza do composto, identificar componentes em uma mistura comparando-os com padrões; acompanhar o curso de uma reação pelo aparecimento dos produtos e desaparecimento dos reagentes e ainda para isolar componentes puros de uma mistura.
Adsorventes: Sílica (SiO2) que é um dos adsorventes mais utilizados e Alumina (AlO3) que é o segundo mais utilizado.
Fase móvel: Solventes ou misturas de solventes.
Solventes em ordem de polaridade: água>metanol>ácido acético>acetona>etanol>acetato de etila>éter etílico>clorofórmio>tolueno>benzeno>tetracloreto de carbono>pentano>éter de petróleo>ciclo hexano.
Na CCD as moléculas têm uma certa atração pela sílica e uma atração diferente pelo solvente que se move pela ação da capilaridade.
Compostos muito polares (álcoois, aminas e ácidos carboxílicos) se fixam fortemente à superfície da sílica formando pontes de hidrogênio com os resíduos ácidos da sílica, portanto é necessário usar solventes muito polares para “puxar” esses compostos e fazer com que eles se movam.
Compostos não polares não são muito atraídos pela sílica e se movem rapidamente mesmo com solventes não polares.
Figura 1: Cromatografia em camada delgada (CCD).
	Um parâmetro freqüentemente usado em cromatografia é o "fator de retenção" de um composto (Rf). Na CCD, o Rf é função do tipo de suporte (fase fixa) empregado e do eluente. Ele é definido como a razão entre a distância percorrida pela mancha do componente e a distância percorrida pelo eluente.
	Portanto:
Rf = dc / ds
	Onde:
dc = distância (cm, mm) percorrida pela substância.
ds = distância (cm, mm) percorrida pela frente da fase móvel (eluente).
Experimental:
I- Materiais e Reagentes
	- Éter de petróleo (p.e. 30 –60 oC) ou hexano
	- Béquer de 50 mL
	- Etanol
	- erlenmeyer de 25 mL
	- Acetona
	- Proveta de 10 mL
	- Clorofórmio
	- Papel de filtro
	- Sulfato de sódio anidro
	- Placa de Petri
	- Folhas de espinafre 
	- Cubetas ou béquer de 100 mL
	- Almofariz
	- Placas de sílica gel
	- Pipeta de Pasteur
	- Capilares
	- Funil de separação de 60 mL
	
II – Procedimento:
Preparação do extrato
Colocar em um almofariz 5-10 folhas de espinafre e alguns mililitros de uma mistura de 2:1 de éter de petróleo ou hexano e etanol. Triturar bem as folhas. Utilizando uma pipeta de Pasteur, e uma bolinha de algodão, filtrar o extrato, transferindo-o para um funil de separação. Adicionar, igual volume de água. Girar lentamente o funil, pois a agitação brusca pode causar a formação de emulsão. Separar e descartar a fase aquosa. Repetir esta operação de lavagem, por mais duas vezes, sempre descartando a fase aquosa. Transferir a solução de pigmentos para um Erlenmeyer e adicionar aproximadamente 2 g de sulfato de sódio anidro. Após alguns minutos, utilizando uma pipeta de Pasteur, decantar a solução de pigmentos do sulfato de sódio, transfirindo para um béquer. Se a solução não estiver fortemente colorida de verde escuro, concentrar parte do éter de petróleo, usando uma suave corrente de ar. 
Aplicação da amostra na placa
Utilizando um capilar, aplicar duas ou três porções da solução de pigmentos sobre uma placa de sílica (2,5 x 7,5 cm) a 1,0 cm de uma das extremidades. Evitar a difusão da mancha de forma que seu diâmetro não deva ultrapassar a 2 mm durante a aplicação da amostra. Deixar o solvente evaporar.
Desenvolvimento do cromatograma
Preparar uma cuba colocando uma tira de papel de filtro de 4x5 cm e 5 mL de clorofórmio. Esperar o tempo suficiente para que ocorra a completa saturação. Colocar cuidadosamente a placa na cuba, evitando que o ponto de aplicação da amostra mergulhe no solvente. Quando o solvente atingir cerca de 0,5 cm do topo da placa, remover a placa e marcar a frente do solvente (linha de chegada da fase móvel). Deixar secar ao ar e observar o número de manchas coloridas. Copiar a placa com as substâncias separadas (cromatograma), obedecendo fielmente a distância entre o ponto de aplicação e a frente do solvente, bem como a distância percorrida por cada substância, iniciando pelo ponto de aplicação até o centro de maior concentração da mancha.
	Preparar uma nova cuba usando como eluente uma mistura de CHCl3 e acetona (9:1). Esperar que ocorra a saturação completa e efetuar um novo desenvovimento da placa, tendo o cuidado de não deixar que a frente do solvente atinja a mancha amarela de maior fator de retenção (Rf), obtida na primeira eluição. Copiar o cromatograma.
Observação: As manchas observadas no cromatograma, são normalmente identificadas, em ordem decrescente de valores de Rf, como carotenos (duas manchas laranja), as xantofilas (quatro manchas amarela) clorofila a (azul esverdeada) e clorofila b (verde).
III - Questionário
Pesquisar estruturas das clorofilas a e b, xantofilas e carotenos.
Qual é o estado físico da fase móvel e da fase estacionária na cromatografia em camada delgada (CCD)?
Qual é o mecanismo de separação da cromatografia em camada delgada de sílica gel?
Com que finalidade a solução de pigmentos é lavada com água?
Por que o sulfato de sódio anidro é adicionado à solução de pigmentos?
Que se entende por fator de retenção (Rf)?
Dois componentes A e B, foram separados por CCD. Quando a frente do solventeatingiu, 6,5 cm, acima do ponto de aplicação da amostra, a mancha de A, estava a 5 cm, a de B a 3,6 cm. Calcular o Rf de A e de B. Desenhar esta placa, obedecendo o mais fielmente possível as distâncias fornecidas. O que se pode concluir sobre a resolução das manchas, nesta separação?
IV - BIBLIOGRAFIA
ROBERTS, R. M.; GILBERT, J. C.; RODEWALD, L. B. WINGROVE, A. S., Modern experimental organic chemistry, 4th ed, Phyladelphia Saunders College Publishing,1985.
COLLINS, C. H.; BRAGA, G. L.; BONATO, P. S., Introdução a métodos cromatográficos, 6. ed, Campinas, Editora da UNICAMP, 1995.
DEGANI, A. L. G., CASS, Q. B.; VIEIRA, P. C. Química Nova na Escola, 1998. 7, 21.
BOBBLIO, F. O.; BOBBLIO, P.A. Introdução à química de alimentos. 2. ed. São Paulo: Livraria Varela. 1992.