Relatório de PCR e Eletroforese

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CENTRO UNIVERSITÁRIO DE VOLTA REDONDA
FUNDAÇÃO OSWALDO ARANHA - MANTENEDORA DO UNIFOA
PRÓ-REITORIA ACADÊMICA
CURSO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS – LICENCIATURA
LEONARDO DA SILVA CANDIDO
RELATÓRIO DE AULA PRÁTICA: TÉCNICA DE PCR E ELETROFORESE
VOLTA REDONDA
2017
INTRODUÇÃO
A PCR é uma metodologia que pode ser executada inteiramente in vitro, sem o uso de células. Essa técnica possibilita a síntese de fragmentos de DNA, usando a enzima DNA polimerase que sintetiza uma sequência complementar de DNA desde que um pequeno fragmento – o primer ou iniciador, já esteja ligado a uma das cadeias de DNA. Os iniciadores definem a sequência a ser replicada e o resultado obtido é a amplificação de uma determinada sequencia de DNA com bilhões de cópias.
O ciclo da Reação em cadeia da polimerase decorre em três estágios que se repetem um número específico de vezes:
1. Desnaturação das fitas de DNA – desnaturação da fita dupla de DNA
2. Hibridização ou Anelamento – hibridização dos primers com a cadeia de DNA previamente desnaturada em sequências específicas e complementares. A escolha criteriosa dessa temperatura permite que os primers se liguem a sequência alvo com maior especificidade.
3. Extensão – amplificação do DNA.
A Reação em cadeia da polimerase ocorre no Termociclador, aparelho capaz de controlar e alternar a temperatura durante os períodos programados de tempo para o número apropriado de ciclos de PCR, geralmente entre 30 e 40 ciclos. O passo final é a análise do produto de reação. Esta pode ser feita através de eletroforese em gel de poliacrilamida posteriormente corado pela prata ou em gel de agarose, corado por brometo de etídio. Em qualquer uma delas, o material amplificado é visualizado como uma banda, a ser analisado de acordo com o seu peso molecular.
A eletroforese consiste na separação de moléculas ionizadas, de acordo com suas cargas elétricas e pesos moleculares em campo elétrico. Moléculas orgânicas como RNA, DNA e proteínas são separadas pela migração destas em um gel durante a aplicação de um potencial elétrico. O princípio da eletroforese utilizada para separação de DNA, por exemplo, baseia-se na carga total negativa do DNA (conferida pelos grupamentos fosfatos). Sendo assim, as moléculas de DNA tendem a migrar em direção ao polo positivo (cátodo).
Uma molécula de DNA, quando exposta a um campo elétrico, migra para o eletrodo na velocidade ou mobilidade eletroforética, proporcional a força do campo e a carga líquida da molécula. A mobilidade eletroforética é também inversamente proporcional ao coeficiente friccional da molécula, que, por sua vez, é função do tamanho e forma da molécula, e da viscosidade do meio.
Nessa técnica é utilizada uma cuba com dois compartimentos, eletrodos, solução salina para condução de eletricidade. Entre os compartimentos da cuba é encaixado o gel que deve ficar submerso. Pequenos poços são feitos no gel durante sua preparação com pentes. As amostras são pipetadas nesses poços. 
A distância que o fragmento percorreu a partir do ponto de aplicação, é comparada com a distância que outros fragmentos de tamanhos conhecidos percorreram no mesmo gel. Esses fragmentos são os ladders (marcadores de peso molecular), misturas de segmentos de DNA de tamanhos variáveis e equidistantes entre si, e que são aplicados em um poço no gel no início do processo.
A eletroforese pode ser conduzida em solução com gradiente de densidade ou em diferentes meios-suportes, tais como papel de filtro, sílica gel, membranas de acetato de celulose, gel de agarose, amido ou poliacrilamida, entre outros. O suporte deve ser química e fisicamente inerte, de modo a não interferir na mobilidade das moléculas. No caso de eletroforese em géis, como poliacrilamida e agarose, a migração das moléculas é profundamente influenciada pelas malhas porosas. Em relação a géis de poliacrilamida ou agarose, a porosidade do gel determina o poder de resolução das bandas, sendo este geralmente decorrente do grau de polimerização entre os monômeros. Géis de poliacrilamida são frequentemente usados para análises de alta resolução (sequenciamento de DNA/RNA) em análises proteicas e isoenzimáticas que requeiram maior definição das bandas. Géis de agarose também são amplamente usados na separação de DNA/RNA, especialmente para fragmentos maiores.
A eletroforese em gel de agarose é o método padrão usado para separar, identificar, analisar, caracterizar e purificar fragmentos de DNA. A técnica é capaz de separar misturas de fragmentos de DNA que não podem ser separados por outros meios, tais como centrifugação com densidade de gradiente ou por velocidade de sedimentação. A localização do DNA no gel pode ser determinada diretamente.
REAÇÃO DA PCR (MIX): 
Solução tampão para se garantir pH e concentrações iônicas adequadas à reação 
Deoxinucleosídeos trifosfatos ( dATP, dGTP, dCTP, dTTP ) que atuam como tijolos na construção das moléculas de DNA
Os primers 
A Taq-polimerase
H2O 
Mg+2 para optimizar a reação (nem sempre é usado) 
O DNA extraído da amostra. 
OBJETIVO
Introdução de conceitos e execução das técnicas da reação em cadeias da polimerase (PCR) e eletroforese.
CONCLUSÃO
Para a preparação da solução Mix de reação havia necessidade de calcular o volume correspondente para cada concentração final, sendo que o Mix deveria ter o volume total de 10 µL
A Reação em Cadeia da Polimerase é dividida em 3 estágios: desnaturação, annealing ou hibridização e extensão.
Após a realização da PCR, os produtos da reação foram analisados por eletroforese. Uma PCR bem-sucedida revelará uma banda no gel de agarose que deverá estar na região equivalente ao peso molecular do inserto. A localização dos fragmentos no gel é feita pela comparação com o DNA ladder (padrão de peso molecular). Pela observação do gel da aula prática percebe-se que houve amplificação.