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Blenda Fernandes MICROBIOLOGIA ESPECIAL STAPHYLOCOCCUS SP.: bactérias facilmente isoladas, mas não são muito encontradas no meio ambiente, mais frequente na pele e mucosas. São cocos gram+ (coram com cor roxa) em formato de cacho de uva, podendo ser aeróbicos ou anaeróbicos facultativos. Dentro desse gênero temos cerca de 50 espécies já descritas, sendo as mais importantes o S. aureus, S. hyicus e S. intermedius. Estão envolvidos em infecções piogênicas, com conteúdo purulento. São bactérias imóveis, sem flagelo (teste geralmente não efetuado). Além disso, são produtoras de catalase (presente apenas nos Staphylococcus), podendo produzir, ou não, enzima coagulase, relacionada à cepas mais patogênicas. As enzimas são importantes para fazer diferenciação de gênero e espécie. São divididos em 2 grupos: - Staphylococcus coagulase positiva: tem capacidade de coagular, é um fator de virulência, pois as cepas que produzem essa enzima são mais patogênicas. Acredita-se que a bactéria consegue se esconder dentro do coágulo, escapando do sistema imune. - Staphylococcus coagulase negativa: não coagula. São o S. epidermitis, S. saprophyticus, S. haemoliticus. São responsáveis pela formação de biofilme (comunidades de bactérias complexas e estruturadas envoltas por substâncias, principalmente polissacarídeos, produzidas pelas próprias bactérias), podem causar mastite subclínica. A fonte dos estafilococos são a microbiota normal, como mucosas e pele. Não são considerados bactérias do ambiente. São bactérias benéficas intimamente associada com os animais, porém em fatores estressantes e com porta de entrada podem causar doença, caracterizando-se então um patógeno facultativo (oportunista). Possuem afinidade seletiva por espécie. Em ruminantes, por exemplo, o S. aureus pode estar na pele do teto e entrar pelo canal do teto, causando colonização. Nos cães, o S. intermedius está nas narinas, pele e cavidade anal. Nos suínos, o S. hyicus, está na pele e cavidade nasal ou orelha externa, pode estar na microbiota vaginal. FATORES DE VIRULÊNCIA: são descritos principalmente no S. aureus, são fatores que podem ser codificados tanto por plasmídeos quanto cromossomais. São mecanismos que fazem com que a bactéria fuja do sistema imune ou seja mais patogênica, se multiplicando mais no tecido e são divididos em componentes associados a célula, exoenzimas e exotoxinas: Componentes associados à célula: polissacarídeo capsular (evita que a bactéria seja endocitada), peptideoglicano e ácido lipoproteico e adesinas (participam da adesão da bactéria na matriz extracelular). Há também a proteína A, com função de enganar os anticorpos, liga-se na região FC do anticorpo, capturando-o e impedindo-o de fazer o processo de opsonização. Exoenzimas: coagulase (proteção da bactéria dentro do coágulo que forma), lipase, liase hyaluronato, hyaluronidase, proteases e DNAse (degradam tecidos que liberam nutrientes que servem de fonte de energia para bactérias). Exotoxinas: Alguns estafilococos produzem toxinas epidermolíticas, importantes para o S. aureus, intermedius e hyicus nos casos de dermatite, agindo na epiderme causando lesão no tecido. Há também produção de enterotoxinas (associadas em infecções alimentares, quando o S. aureus se multiplicam no alimento, gerando toxina neste). Toxina da síndrome do choque tóxico (desencadeia uma resposta muito grande do SI, causando resposta inflamatória grave), hemolisinas, responsáveis por causar hemólise. Podem ser alfa (total), beta (parcial) ou gama (inaparente), se ligam na membrana dos eritrócitos e rompem as células. CARACTERÍSTICAS BIOQUÍMICAS: Incuba-se a placa em ágar-sangue numa estufa. Primeiramente deve-se observar as características da colônia. No caso dos estafilococos geralmente são de médias à grandes, opacas e convexas, podendo apresentar coloração variada (esbranquiçada a amarelada). Observar se causa hemólise ou não, e fazer um exame de gram+. Em seguida, descobrir se é catalase positiva, fazer a prova da oxidase negativa (todos os estafilococos são oxidase negativa) e verificar se há coagulase positiva ou negativa (prova mais utilizada para verificar se é mais ou menos patogênico). ❏ Teste da catalase: colocar numa lâmina ou placa uma amostra da cultura, adicionar peróxido de hidrogênio. Se houver formação de bolhas de ar, é positivo. Caso contrário é negativo. ❏ Teste de oxidase: utiliza tiras impregnadas com o reativo. Caso positivo há produção de cor roxa imediatamente no local da inoculação da bactéria. Se negativo, não há mudança na cor do papel. Testes e meios para identificação de S. aureus: - Teste de Voges-Proskauer (VP): verifica fermentação da glicose com produção de acetoína. A bactéria é semeada em um meio específico em tubo, entubada por 24h, cresce e utiliza a glicose do meio, produzindo a acetoína. Para visualizar se produziu ou não, utiliza-se o reagente de Barritt’s, substância verificadora que modifica a coloração do meio em caso de resultado positivo. Positivo só para S. aureus. - Outros meios mais utilizados: ágar-sangue, meios seletivos para S. aureus, manitol (observa-se a fermentação do manitol - fica amarelo) e Baird Parker (reduz telurite a telúrio, mais utilizado na indústria de alimentos - colônia fica escura, preta). - Ágar DNAse: meio contendo DNA, feito em placa. Depois de feito o meio, é adicionado ácido clorídrico, fazendo com que o DNA se precipite e o meio fique opaco. Após, pega-se a amostra, coloca-se no meio. Se houver S. aureus, ele produz a DNAse, degrada o DNA do meio, formando um alo transparente ao seu redor (zona transparente em volta do crescimento). ● S. aureus: coagulase positiva, VP positivo, DNAse positivo, é mais patogênico, está envolvido em casos de intoxicação alimentar. Pode causar doença em diversas espécies, causando mastite (transmitida pelo canal do teto no momento da ordenha), dermatite, osteomielite, síndrome do choque tóxico (devido à toxina produzida pela bactéria). No caso da mastite, a bactéria se adere no epitélio glandular, as adesinas permitem ligação à matriz extracelular e colonização do epitélio (leite é um excelente meio de crescimento). Ocorre então uma reação inflamatória e atração de células do sistema imune, gerando abscessos e granulomas. - No campo, para o teste de mastite, é utilizado o teste da caneca telada ou caneca de fundo preto. Coloca-se uns jatos de leite e observa-se a característica do mesmo, caso apresente grumos ou sangue pode-se suspeitar de mastite clínica. Há também o teste da raquete, que pode identificar mastite subclínica. Coloca-se jato de leite nas placas, adiciona um reagente que degrada as membranas das células somáticas, liberando o conteúdo destas, havendo uma gelificação do conteúdo. Quanto maior a gelificação, maior o número de células somáticas presentes, é classificado em graus. ● S. intermedius e pseudintermedius: agente da dermatite piogênica em cães, septicemia em aves. A piodermatite é uma das doenças mais comunsem cães. Causa infecção da pele com acúmulo de exsudato purulento e neutrofílico, pode ter outras bactérias da pele envolvidas além de S. intermedius. É coagulase positiva, possui um potencial zoonótico associado à baixa imunidade. São um componente normal da microbiota cutânea oral e nasal de cães e produzem enterotoxinas. - Fatores predisponentes: fricção mecânica, lesão na pele, umidade excessiva, predisposição racial (Pastor Alemão, Bull Terrier) e agentes químicos. - Patogenia: a partir de uma lesão na pele ou imunossupressão, uma cepa patogênica entra, há adesão e colonização da matriz extracelular, gerando reação inflamatória. Há produção de toxinas (toxina esfoliativa), causando dermatite. ● S. hyicus: infecções secundárias em equinos, bovinos e aves, epidermite exsudativa em suínos, também chamada de cascão. Esta é um dermatite seborreica generalizada e contagiosa. É comumente encontrado na pele dos suínos, portanto afeta principalmente leitões nas primeiras semanas de vida. Este estafilococos apresenta coagulase variável, mas não é hemolítico. É produtor de enterotoxinas e toxinas epidermolíticas (causando as lesões características da doença, formando crostas). - Fatores predisponentes: más-condições de higiene, lesões na pele para iniciar a infecção (corte de dentes e cauda, castração, mossa, brigas), doenças concomitantes (PCV2). 2 - Patogenia: A bactéria peneta na pele, se adere a epiderme, produz a toxina, causando inflamação, aumento da espessura da epiderme, produção sebácea e exudato seroso. Os estafilococos podem também causar doenças em outras espécies, como Bovinos (impetigo no úbere, onfalite), Ovinos (mastite, foliculite (cordeiros), dermatite), Caprinos (mastite e dermatite), Suínos (botriomicose da glândula mamária), Equinos (botriomicose do cordão espermático e mastite), Gatos (semelhante ao S. intermedius) e Aves domésticas (artrite e septicemia em perus, pododermatite ulcerativa). STREPTOCOCCUS SP.: cocos gram-, porém tem formato de cadeias longas ou correntes; São aeróbios ou anaeróbios facultativos. São catalase negativos, imóveis e fastidiosos - são mais sensíveis no ambiente, mais difícil de cultivar no laboratório. São sensíveis a dessecação, sobrevivem pouco tempo no ambiente, são muito associados ao hospedeiro. Causam infecções piogênicas, têm distribuição mundial. São comensais de mucosas TRS e Trato Urogenital Inferior. Agente primário (S. equi/S. suis). São agentes oportunistas comensais do TRS e urogenital inferior, pele, trato intestinal, leite e derivados, fômites - S. suis: pode causar meningite, ou causar artrites das articulações, endocardite vegetante, pneumonia. - S. equi: adenite equina. Animais podem ser assintomáticos. Começa nas narinas com secreção serosa e purulenta. Pode atingir linfonodos da cabeça. Bem contagiosa, pode supurar (estourar) o abcesso. - S. Pneumoniae, S suis: Podem causar outras doenças, como mastite, metrite, endocardite, poliartrite, meningite e pneumonia. FATORES DE VIRULÊNCIA: Cápsula (adesão), Proteína M (antifagocitária - mesma função da proteína A, liga-se a porção FC impedindo a opsonização), Exotoxinas pirogênicas, Estreptolisina\hemolisinas (destroem eritrócitos), Pneumolisina (destrói macrófagos alveolares). Existe uma classificação no gênero dos estreptococos através do agrupamento de Lancefield (método sorológico que classificação com base no polissacarídeo da parede celular). Estes são divididos em grupo A (S. pyogenes), B (S. agalactiae), C (S. equi), D (Enterococcus spp) e F (S. milleri). IDENTIFICAÇÃO BIOQUÍMICA: A hemólise é usada para diferenciação de espécies de streptococcus, sendo que estas podem ser alfa (parcial), beta (total) e gama (não é possível observar no ágar). Essas bactérias são microorganismos fastigiosos, sendo mais exigentes no cultivo no laboratório. É utilizado ágar-sangue, ágar-sangue+ glicose ou um caldo infuso cérebro e coração (BHI) + soro + glicose. Podem ser usados meios seletivos e indicadores. Após crescimento são observadas colônias pequenas, puntiformes. Antibiograma feito em ágar sangue. Os streptococcus são catalase negativa. Podem ser utilizados alguns testes para identificação das espécies: Teste de CAMP (identifica S. agalactiae), Hidrólise da Esculina e bile-esculina (analisa capacidade do estreptococos de hidrolisar a esculina, resultando em um meio de cor preta), PYR (capacidade de hidrolisar enzimaticamente a L'Pirrolidonil-B-naftilamida). Pode se testar a resistência dos estreptococos à Bacitracina e sulfa trimetoprim. Camp test: Em uma placa de ágar sangue, semear S. aureus de um ponto a outro, verticalmente (linha amarela). Em seguida, semear perpendicularmente a colônia do estrepto a ser testado, sem encostar na linha do meio (linhas vermelhas). Caso haja formação de uma seta convergindo para o meio (onde está o S. aureus), o teste é positivo. Caso contrário, negativo. Garrotilho ou adenite equina: agente causador é Streptococcus equi. É uma doença febril altamente contagiosa, afeta o TRS e linfonodos regionais em equinos jovens. Transmissão ocorre facilmente através de contato com exsudato purulento do TRS Púrpura hemorrágica: hipersensibilidade tipo 3, por S. equi. Há formação dos imunocomplexos, que começam a se depositar nos vasos e causam lesões nos vasos. Formação de edema ventral e de membros ou face. 3 ENTEROBACTÉRIAS INTRODUÇÃO: são bacilos gram negativos, de tamanho variável, podem ser aeróbicos ou anaeróbicos facultativos. Podem ou não ser móveis devido a presença de flagelos, e são os principais componentes da flora intestinal. ● Principais espécies patogênicas: Escherichia coli, Salmonella, Yersinia e Shigella. ● Principais oportunistas: Proteus, Citrobacter, Enterobacter e Klebsiella. Mesmo as patogênicas também podem ser classificadas como oportunistas, pois também pertencem à microbiota natural do organismo. A doença pode ocorrer por desequilíbrio na microbiota intestinal, quantidade de bactéria ingerida etc. CARACTERÍSTICAS BIOQUÍMICAS: são bactérias oxidase negativa (não produzem oxidase), catalase positiva, fermentadoras de açúcares, crescem em meios de cultura comuns, mas também há meios diferenciais para identificação. Algumas bactérias são de crescimento muito rápido e fácil, enquanto outras são suprimidas e não crescem na presença de outras bactérias no meio. Além disso, reduzem o nitrato a nitrito. IDENTIFICAÇÃO BIOQUÍMICA: pode ser feito através de fermentação da lactose, sendo o Agar McConkey o mais utilizado, pois este é um meio seletivo para bactéria gram negativa (possui um componente que inibe o crescimento de gram positiva, no caso do Ágar McConkey, possui sais biliares e cristal violeta). No meio há também lactose dessa forma é observado se o microorganismo fermenta ela ou não. ● LAC+: E. coli, Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter ● LAC -: Shiguella, Salmonella, Proteus, este último só cresce em amostras isoladas, pois forma um véu e cresce por cima de outras colônias. Há outros meios seletivos, que podem ter mudança de coloração, sendo um indicativo de crescimentoda bactéria: Ágar Shiguela-Salmonella (SS), Ágar Eosina Azul de Metileno, Ágar XLD, XLT4, Ágar Hektoen e Verde Brilhante, tendo de forma geral um direcionamento pra identificar salmonella. MEIOS: ❏ SS ágar: o meio contém sais biliares, verde brilhante e citrato sódico. A salmonella cresce no meio adquirindo uma coloração preta, pois produz H2S, enquanto a shigella em uma coloração amarelada. As bactérias que fermentam lactose formarão colônias rosa. ❏ Ágar Eosina Azul de Metileno: ágar vermelho que diferencia as colônias lactose positiva das negativas. As positivas crescem em tom verde metálico (geralmente E. coli) ou escurecido. Os negativos crescem em coloração transparente. ❏ XLD: Possui desoxicolato de sódio, outro inibidor de G+. Identifica Salmonella, formando colõnias pretas\escurecidas. ❏ Hektoen: Possui azul de bromofenol e fucsina que inibem G+. A salmonella produz novamente colônias pretas, shigella transparente. Os fermentadores de carboidratos lactose e sacarose formam uma coloração alaranjada. ❏ Verde brilhante: E. coli forma colônias esverdeadas, Salmonella forma colônias rosadas. Além disso, tem-se uma série de provas bioquímicas para diferenciar os gêneros da espécie bacteriana, tendo um diagnóstico. Pode-se observar a produção de gás (bolhas no meio, desprendimento do fundo do tubo), produção de H2S, fermentação de glicose/sacarose, produção de indol , motilidade, citrato, urease e hidrólise da uréia TÉCNICAS: ❏ TSI: é um ágar feito em tubos, coloca-se o ágar líquido, virando o tubo para que forme uma base e um bisel. Tem, no meio, glicose, sacarose e lactose no tubo, nessa ordem. A E. coli fermenta todos os 3 açúcares, 4 gerando uma acidificação do meio, deixando-o amarelo. Há também desprendimento do fundo e bolhas, pois há formação de gás. ❏ SIM: ágar em um tubo, bactéria é inoculada. Pode observar a motilidade com o turvamento do meio (se estiver turvo ela é móvel). Se houver produção de H2S o meio fica escurecido, e a produção de indol é vista com a presença de um reagente indicativo de indol. Caso positivo, há formação de um anel vermelho, negativo fica amarelo. ❏ Citrato: meio também feito em bisel no tubo. Se a bactéria produz citrato o meio fica azul, caso contrário permanece verde. ❏ Urease: o meio tem coloração amarelada, se a bactéria produz urease, meio mudará de cor para rosa. PRINCIPAIS DOENÇAS: temos principalmente as infecções intestinais (diarreias neonatais, colibacilose entérica), infecções septicêmicas (colisepticemia, colibacilose sistêmica), infecção do trato urogenital (cistite e piometra em cães, sendo a E. coli principal.) e infecções hospitalares. ESCHERICHIA COLI: São bastonetes pequenos, Gram-, podem ser aeróbicos ou anaeróbicos facultativo e cresce em meios bacteriológicos simples. São oxidase- e catalase+, não são esporulados. O diagnóstico pode ser feito por isolamento convencional cultivando em AS e MacConkey, deixando 24 horas a 37°C. Após o crescimento, observar as características da colônia nas duas placas, coloração, se é hemolítica. No caso da E. coli há produção de gás +, presença de H2S -, fermentação de glicose, indol +, motilidade +, citrato - e urease -. CARACTERÍSTICAS: apresenta bastante diferença antigênica em relação aos antígenos capsulares (K), onde ja foram descrito 80 tipos. Os somáticos (lipossacarideos), já foram identificados 165 e as proteínas flagelares (H), já foram classificadas 50. A partir disso podemos identificar diferentes sorotipos na E. coli, tendo diferenças na patogenicidade. Por exemplo, O157:H7 causa bastante infecção alimentar em humanos , causando até mortes. Existem aproximadamente 160 sorotipos. Estes mostram preferência por hospedeiros, idade e são encontrados com maior frequência em determinadas doenças, alguns não são patogênicos, não tem fator de virulência. Como regra geral, infecções caracterizadas por septicemia são causadas por cepas invasivas e infecções etéricas são causadas por cepas toxigênicas, que alteram o equilíbrio hidromineral, devido à produção de enterotoxinas. A E. coli é amplamente distribuídas na natureza/ambiente, podendo ser encontrada no solo e na água. Tem distribuição mundial e existem cepas patogênicas e não patogênicas. Habitante normal da microbiota gastrointestinal dos mamíferos, é um dos micro-organismos mais estudados em todo mundo, sendo o principal microorganismo indicador de contaminação fecal em alimentos. Além disso, é o principal micro-organismo em infecções urinárias. Fatores de virulência: cápsula (protege de endocitose) LPS (enterotoxina que causa reação inflamatória muito grande, podendo levar à morte), fímbrias (possuem adesinas que se ligam no receptor do enterócito para a bactéria se fixar), toxinas, Os fatores de virulência são codificados por plasmídeo ou ilhas de patogenicidade. 5 Classes patogênicas: E.coli enteropatogênica – EPEC, E.coli enteroinvasiva – EIEC, E. coli enterohemorrágica – EHEC e E. coli enterotoxigênica - ETEC. Forma de transmissão e infecção: pode ocorrer via oral, através de ingestão da bactéria, causando enterite. No caso de infecções extra-intestinais pode ocorrer entrada umbilical e pelo teto. Fômites são importantes na disseminação da bactéria. O tipo de hospedeiro, agente e ambiente podem ser fatores predisponentes para a contaminação. Em relação ao hospedeiro, algumas bactérias parasitam uma certa idade, também depende da presença de receptores, de anticorpos presentes e infecções concomitantes. Em relação ao ambiente temos a carga bacteriana, introdução de novas cepas (ausência de imunidade) e stress. Sobre o agente, depende da habilidade de colonização, aderência e toxinas. Doenças causadas por E. coli: colibacilose. Principais sinais são diarreia e enterite. Pode causar septicemia, doença do Edema, artrite, onfalite, mastite, infecções do trato urinário e piometra. E. coli enterotoxigênica - ETEC: causa mais comum de diarréia nas espécies domésticas, afetando principalmente suínos neonatos, bezerros e cordeiros. Produz 2 toxinas: Termoestável (ST) e Termolábil (LT) – Reduz a absorção e induz hipersecreção. Não causa dano intestinal, apenas exacerba o fenômeno fisiológico de hipersecreção que acontece no intestino. As toxinas ativam a guanilato ciclase, causando redução na absorção de água, devido a quantidade de sódio e solutos para a luz intestinal. Isso gera atração de água, causando diarreia por hiper “liberação” de água. - Sinais clínicos: acometem animais 2-3 dias de idade, pode causar morte sem sinais clínicos se for uma quantidade muito grande de bactéria. Os animais apresentam apatia e raramente febre. Diarréia aquosa, pastosa, branca ou amarelada, gera acúmulo de material fecal na cauda. Leva a desidratação e até morte. Macroscopicamente observa-se pouca alteração nos intestinos. Podemos ver hipotonicidade dos intestinos, distensão dos intestinos por fluídos e gás, conteúdo intestinal líquido amarelado. Microscopicamente não se observa lesão. E. coli enteropatogênica – EPEC: causa diarreia em todas as espéciesanimais, mas não se observa muito. É bastante relatada em crianças de situação precária. Não produzem toxinas LT ou ST, mas possui o gene Lee, responsável por causar lesão (lesão A/E, por adesão intensa) no enterócito, destruindo as microvilosidades intestinais. Intimina se liga no receptor Tir do enterócito, produzindo uma íntima aderência da bactéria, impedindo que as microvilosidades sejam produzidas normalmente, causando destruição destas. A diarreia causada é por má absorção. Há lesões hemorrágicas no intestino. - Sinais clínicos: Má-absorção, diarréia hemorrágica/muco, febre, desidratação, morte E.coli enterohemorrágica – EHEC: essas cepas são produtoras de Verotoxina (shiga-like toxin- semelhante a Shigella). Em suínos está associada à doença do edema, em leitões uma semana pós desmame. Pode também causar diarréia e disenteria em bezerros e cordeiros A bactéria se adere no intestino através das fímbrias, começa a produzir a verotoxina. Esta é absorvida pela corrente sanguínea, se distribui no organismo e se liga no receptor das células endoteliais, causando inibição da síntese proteica. Isso causa uma desestruturação nas células endoteliais, fazendo com que saia líquido dos vasos, gerando edema. - Doença do Edema: é uma toxemia, geralmente ocorre entre 1 ou 2 semanas após o desmame. Não é só a presença da bactéria que fará com que a doença ocorra, esta possui uma etiologia complexa (alterações nutricionais, ambientais, outros fatores estressantes), mais presente em leitões que se alimentam bastante, pois geram bastante substrato intestinal para a bactéria. - Sinais clínicos: morte súbita, incoordenação, paralisia, sinais neurológicos (tremor das orelhas) e edema de pálpebras, orelhas e face. 6 Na necropsia, no exame macro, pode-se encontrar edema da parede estomacal, linfonodos e mesentério, cavidade abdominal com fluído claro contendo fibrina, líquido na pleura e saco pericárdico. E. coli enteroinvasiva – EIEC: possui capacidade invasiva. A porta de entrada pode ser via oral ou umbilical. É uma diarreia com reação inflamatória na mucosa intestinal, podendo ter muco e sangue. Pode causar septicemia, neste caso pode gerar meningite, artrite e pneumonia. - Mastite: Oportunista. Causa uma mastite clínica. Em vacas leiteiras é causada por uma contaminação fecal da glândula mamária (vaca deita e entra pelos tetos). Geralmente ocorre na forma aguda, gerando uma endotoxemia e morte. A secreção mamária é aquosa e contém grânulos brancos, podendo ter sangue. Os animais afetados ficam gravemente deprimidos, com orelhas caídas e olhos fundos. Diagnóstico: pode ser coletada uma porção do intestino afetado com conteúdo fecal para necrópsia. Pode também ser feito um swab retal\fezes. Em casos de septicemia podem ser enviados outros órgãos (cérebro, baço, fígado). O isolamento é feito em AS e MacConkey, observando os resultados bioquímicos. Porém é necessário associar com os sinais clínicos, pois essa é uma bactéria inerente ao intestino. SALMONELLA SP.: Enterobactérias, são bastonetes curtos, Gram -, móveis (exceto S. pullorum e S. gallinarum). São aeróbios ou anaeróbios facultativos. São sensíveis à temperatura, o cozimento destrói o microrganismo se a temperatura interna do alimento atinge 74- 77°C. Há redução bactérias durante o congelamento, porém são capazes de crescer com variação de pH entre 4.5 e 9.0 (ótimo 6.5-7.5). A contaminação está relacionada ao sistema imune do indivíduo, um indivíduo saudável pode não adoecer mesmo com contaminação. Fatores de virulência: LPS – endotoxina , fímbrias, habilidade ao resistir ao MAC (complexo de ataque a membrana), habilidade de resistir à fagocitose por macrófagos e possui a capacidade de invadir e multiplicar dentro de células (consegue adentrar os enterócitos e macrófagos). Esses fatores de virulência são codificados em plasmídios e ilhas de patogenicidade. Patogenia: ocorre a ingestão da bactéria via oral, esta chega ao ID, se adere pelas fímbrias e adentra nos enterócitos, se multiplicando dentro destes. Causa uma reação inflamatória no intestino, causando citotoxicidade dos enterócitos e das células M, destruindo-os. Há então uma diarreia causada por essa RI pela presença da bactéria, tendo uma produção de água, íons, isquemia e necrose dos tecidos. Pode haver entrada da bactéria na corrente sanguínea, se disseminando e causando septicemia. Classificação: O gênero salmonella spp tem mais de 2400 sorotipos que tem 2 espécies: S. enterica e S. bongori. Dentro da primeira, temos as subespécies entéricas, que são patogênicas. As demais não são patogênicas. Alguns sorotipos são hospedeiro específicos (receptores). Sorotipos importantes: ● S. typhimurium: gastroenterite em humanos e várias espécies animais ● S. cholerasuis: enterite em suínos e humanos ● S. dublin: infecção aguda em terneiros ● S. gallinarum: tifo aviário em galinhas e perus ● S. pullorum : pulorose em pintos Para identificar uma amostra pode ser feita a cultivo direto desta em AS (colônias não hemolíticas, lisas, circulares)ou McConkey (colônias incolores, pois é lactose -), após 24h a 37ºC. Pode ser feito também um cultivo seletivo, geralmente quando se tem pouca quantidade da bactéria. Este segue uma metodologia tradicional para alimentos. A amostra passa por um pré-enriquecimetno, onde fica num caldo para se induzir seu crescimento e multiplicação após, é colocada em um meio de enriquecimento, onde já tem substâncias que irão inibir o crescimento de outras bactérias (como gram+ ou cloriformes). Após isso, coloca-se a bactéria em meios seletivos sólidos, que podem ser XLT4 e XLD, SS ágar ou Hektoen. - O pré enriquecimento é feito para que não haja um falso negativo como resultado, pois se houver pouca Salmonella juntamente com outras bactérias no meio, não haverá crescimento da Salmonella (será inibida). 7 Após feito o cultivo, olhar na tabela os resultados para identificação. Usando o TSI vemos que é citrato+, ureia - e com o SIM observa-se Indol -. Há identificação antigênica, diluindo a amostra junto com anticorpo, podendo ter resultados diferentes. Se for positivo gera uma soroaglutinação rápida. Fontes da bactéria: Água, solo, alimentação dos animais, alimentos de Origem animal, vegetais (disseminação de salmonella na produção de rações, por exemplo). A contaminação ocorre via fezes. Em granjas: Ratos, moscas, cães, gatos, cascudinho • As salmonelas podem sobreviver por mais de nove meses em solos úmidos Possui distribuição mundial, afetando mamíferos, aves e répteis. Os roedores e aves silvestre são portadores (não adoecem). A forma de eliminação é pelas fezes e a principal via de transmissão é fecal/oral. São parasitas intracelulares facultativos. Formas de apresentação da doença: ● Salmonelose entérica: fica restrita ao intestino, causando diarréia profusa e fétida, pode ou não ter sangue, muco, fibrina e células epiteliais descamadas, desidratação. ● Salmonelose septicêmica: chega a corrente sanguínea e se dissemina. Inicia com febre, anorexia e prostração, causandomorte. Sobreviventes apresentam diarréia persistente, artrite, meningite ou pneumonia. A salmonella é um dos principais agentes de doenças veiculadas por alimentos, sendo um problema, pois na maioria dos casos o indivíduo nem vai ao hospital para que faça a identificação e tenha um levantamento adequado de dados epidemiológicos da doença. Diagnóstico: pode ser enviada a porção afetada do intestino, swab retal ou fezes, linfonodos mesentéricos, fígado e baço. Para isolamento em laboratório AS ou MacConkey ou cultivo seletivo. Pode ser feito também PCR. MYCOBACTERIUM SP.: Tem uma parede celular diferenciada, não são nem gram+ nem gram-, não coram com nenhum pois os corantes não conseguem penetrar. É preciso aquecer a lâmina para o corante penetrar na parede celular. As micobactérias são divididas em causadoras da tuberculose (causando granuloma/nódulos amarelados bem característicos) e não tuberculosas (Complexo MAIS: M. avium, M. intracellulare, M. scrofulaceum). São bastonetes retos ou levemente curtos, imóveis, não esporulados, sem cápsulas, aeróbios, catalase positivos e BAAR (resistentes à coloração alcool ácido), portanto precisam passar pela coloração de Ziehl-Nielsen. Sua parede é composta de lipídeos livres, ácido micólico. Os lipídeos correspondem a 60% do peso seco da membrana da célula. Coloração de Ziehl-Nielsen: fazer o esfregaço da bactéria na lâmina e adicionar a fuccina, aquecendo a lâmina. O calor dissolve os lipídios e permite penetração da fuccina na bactéria, corando de rosa. Após esfriar, coloca a solução álcool ácido, como Mycobacterium possui uma membrana Álcool-ácido resistente, ele não perderá a coloração rosa. Em seguida, azul de metileno para corar o restante da célula. Outras células e outras bactérias que não forem Mycobacterium acabarão com a coloração azul. Devido à essa membrana, as micobactérias também conseguem sobreviver dentro de macrófagos, que não conseguem fazer sua fagocitose. Ele se replica dentro dos macrófagos, sendo parasita intracelular facultativo. A replicação dessas bactérias ocorre muito lentamente e de forma crônica, por isso demora para aparecer sinais clínicos da tuberculose. ●M. bovis: causa tuberculose bovina, mas também é uma zoonose (humano pode ser contaminado pelo leite ou eliminação de aerosóis). ●M. avium subsp. Paratuberculosis: causa lesão diferente dos tuberculosos, forma nódulos que não têm aspecto caseoso pelo trato digestório. 8 Cultura: Formam colônias visíveis após 2 - 30 dias, mas podem demorar até 60 dias (fazer a cultura e ir verificando o cultivo no laboratório). As colônias formadas são geralmente róseas, laranjas ou amarelas, especialmente quando expostas à luz. O M. bovis, e complexo M. avium não produzem pigmento ou produzem pouco. As colônias possuem superfície grosseira e rugosa. Meios específicos para M. bovis: Dorset, Coletsos e Stonebrinks, sendo este o mais utilizado. Estes meios possuem gema de ovo, tampão fosfato, sal de magnésio, piruvato de sódio e ocasionalmente, aminoácidos, componentes que facilitam o crescimento da bactéria. Pode também ser adicionado nitrato no meio, usado para fazer uma diferenciação da espécie (pois o M. bovis não reduz nitrato a nitrito). Pode também ser adicionada a pirazinamida, um antibiótico para Mycobacterium, porém M. bovis é resistente. O cultivo é lento e requer 3 a 4 semanas em incubação a 37ºC antes das colônias se tornarem visíveis. Estritamente aeróbico. ➢ Diferenciação de outras espécies: M. bovis não cresce a 25º C, não reduz o nitrato (adicionar naftilamina e ácido sulfanílico e agitar, se gerar uma coloração vermelha/fúcsia é porque possui nitrito), é resistente à pirazinamida, é sensível a hidrazida e não crescem em meios contendo glicerol. Micobactérias devem ser manipuladas em cabinas de segurança para prevenir a disseminação de patógenos ao homem. O material deve ser desinfetado pelo calor, pois as micobactérias são resistentes aos desinfetantes químicos, além de serem bastante resistentes ao meio ambiente (podendo permanecer até 2 anos nas instalações). É distribuída mundialmente, tendo maior prevalência em países em desenvolvimento, já que foi erradicada ou está em erradicação em alguns países desenvolvidos. Reservatórios: animais silvestres. Formas de infecção: Animais doentes ou infectados são fontes de infecção. As vias de eliminação são gotículas e secreções respiratórias, leite, colostro, sêmen, fezes e urina. As vias de transmissão podem ser aerossóis, pastagens, água e alimentos contaminados. Métodos de diagnóstico da tuberculose bovina: Há métodos diretos e indiretos. Diretos: isolamento do agente em meio de Stonebrink ou PCR. Deve ser feito o diagnóstico bacteriológico enviando o material (tecido) refrigerado no gelo ou congelado, como diagnóstico histopatológico, enviando como material órgãos afetados (lesões) em formaldeído 10%. Nos indiretos é utilizada a Tuberculinização. Nela, se avalia a resposta imunológica celular ao M. bovis (reação de hipersensibilidade do tipo IV - tardia), acontece cerca de 72h após a aplicação de tuberculina. Os animais sensibilizados são os que entraram em contato com o Mycobacterium e desenvolvem uma resposta imune celular. Essa prova só pode ser realizada por médico veterinário habilitado em animais com mais de 6 semanas de idade. Tuberculinização: a tuberculina é uma tubérculo-proteína originada do M. bovis (líquido incolor) ou M. avium (líquido avermelhado). É aplicado a tuberculina intradérmica em um animal com tuberculose, aparecendo uma reação de hipersensibilidade. Há atração de Macrófagos, que fazem apresentação de Ag a LThelper. Há produção de citocinas que atraem mais células para o local, causando alterações vasculares, vasodilatação, eritema, etc. Ocorre 9 então a atração de LT, aumentando a permeabilidade vascular, gerando passagem líquido, fibrinogênio e outras proteínas plasmáticas ao tecido perivascular (aumento de volume e endurecimento local). - Teste da Prega Caudal (TPC): é aplicada tuberculina bovina na base da cauda via intradérmica. Só é feito em gado de corte, não sendo permitido em gado de leite. É mais rápido, porém não é tão preciso, mais utilizado para observação (ocorre aumento de volume da região no animal afetado) - Teste Cervical Simples (TCS): aplicação na região da tábua do pescoço ou espinha da escápula via intradérmica. Deve ser feita a leitura antes da aplicação e 72 horas após. Ocorre a formação de uma pápula. Se a medida dessa reação for menor que 2mm, é negativo, maior que 4mm é positivo e entre esses dois valores é inconclusivo. - Teste Cervical Comparativo (TCC): confirmatório. Permitido em animais de leite e corte, recomendado para rebanhos com ocorrência de reações inespecíficas. Locais de aplicação são os mesmos da TCS, sendo usada também a tuberculina aviária. É feita a tricotomia de 2 locais, sendo separados por +-15cm, feita a medição das pregas e, posteriormente, aplicação de umatuberculina em cada local. 72h depois deve ser feita uma nova medição, fazendo a diferença das duas (ΔB-ΔA). Diminuir essa diferença das medidas encontradas antes da aplicação da tuberculina. O resultado é igual a TCS (<2 é negativo, >4 é positivo). BACILLUS SPP.: 1876 o B. anthracis foi a primeira bactéria a ser estudada por Robert Koch. Foi a doença mais antiga relatada em humanos (Antigo Egito e Grécia). São bacilos Gram-positivos, grandes e com formato de “bambu”. São produtores de esporos, catalase positivos, oxidase variáveis, aeróbicos e anaeróbios facultativos e móveis (exceto B. anthracis - indicador de espécie). Da forma vegetativa para a esporulada a bactéria vai passar por uma situação de privação de nutrientes e precisa de aerobiose (recomendado não abrir o animal para necrópsia, para que não tenha contato com oxigênio e forme esporos no ambiente). ●Bacillus anthracis: ruminantes são extremamente sensíveis, além de ser um patógeno humano (zoonose). É raro em outras espécies como cães, gatos, equinos e suínos, pois são mais resistentes. Nas aves não produz toxina, pois estas possuem uma temperatura corporal elevada, o que inativa a produção. São bactérias que produzem esporos, que tem bastante importância na epidemiologia na doença. Causam septicemia aguda e fatal. Nos humanos pode ter a forma cutânea (causando apenas lesão localizada) e pulmonar/intestinal, onde há entrada via respiratória ou oral (formas mais graves que levam à morte). A contaminação de ruminantes ocorre geralmente por via oral, ingerindo pasto contaminado com os esporos. Pode ter contaminação por feridas. A bactéria grande e pode ser observada aos pares ou sozinho. Produz esporos altamente resistentes. É o patógeno mais importante do gênero Bacillus sp. Em laboratório, os esporos germinam para a forma vegetativa quando expostos a 65ºC por 15 minutos, mas no ambiente, em temperaturas acima de 15º já há produção de esporo. As cepas virulentas são sempre encapsuladas. Diferencia-se de outras espécies pois não produz gás, é imóvel, não produz hemólise, é sensível a penicilina e não cresce em ambiente microaerófilo. Seus esporos estão presentes no solo, ar, poeira e água e permanecem vários anos em solos e pastagens, ocorrendo em solos com matéria orgânica. Sobrevive melhor em solos alcalinos e são muito resistentes à temperatura. Fatores de virulência: Possui a cápsula, que previne a fagocitose, e a toxina complexa. Ambos são codificados por genes presentes nos plasmídeos, os genes plasmídeo PXO2 e PXO1, respectivamente. É uma toxina formada por 3 subunidades, sendo o fator do edema, o Ag protetor e o fator letal: - Fator de Edema (FE): também chamado de fração I, fazem a produção de edema - Antígeno Protetor (AP): fração II, função de translocar os dois fatores para dentro da célula, para que possam agir dentro desta. Age como uma molécula de ligação, permitindo a interlização dos fatores. - Fator Letal (FL): fração III, causa hipóxia nas células, gerando necrose dos tecidos. PATOGENIA: Se transforma na forma vegetativa da bactéria, macrófagos não conseguem fagocitar, através deles a bactéria atinge a corrente sanguínea. Começa a se multiplicar e produzir a toxina. AP é quem se liga na célula, 10 translocando o FE e FL, formando um endossomo e liberando esses dois componentes no citosol do hospedeiro. O FE dentro da célula tem atividade de adenilato ciclase, aumentando cAMP, saindo íons e água da célula, formando o edema. Em relação ao FL não se sabe muito bem como acontece, mas essa subunidade da toxina interfere na atividade de proteínas quinases, causando hipóxia e necrose. Ação conjunta dos fatores de virulência: inibe severamente a função dos neutrófilos, causa destruição de fagócitos, danos nos mecanismos de coagulação, trombose capilar, aumento da permeabilidade capilar, edema, bloqueio da atividade opsonizadora do C3, queda da pressão sangüínea, choque e morte. Tratamento: em ruminantes é muito difícil de reverter, mas em outras espécies pode ser feita antibioticoterapia, utilizando penicilina, tetraciclina, estreptomicinas, fluorquinolonas. Tratamento precisa ser prolongado (no mínimo 6 semanas). Controle: Notificação aos órgãos oficiais, quarentena, incineração ou depósito em cova profunda dos animais mortos, dejetos e fômites, desinfecção de estábulos, isolamento dos animais doentes e vacinação. ●B. cereus: microorganismo ambiental grande, presente em diversos tipos de alimentos. Forma um biofilme na superfície dos alimentos e causa comum de intoxicação alimentar. Produzem toxinas que causam Síndrome Emética e Síndrome Diarréica. Geralmente as toxinfecções causadas por B. cereus são subestimadas, porque elas são geralmente menos graves. A identificação é feita pelo isolamento a partir de fezes, vômito ou alimentos suspeitos. Diferencial do B. anthracis: são móveis, resistente a penicilina, hemolítico, crescem em microaerofilia e podem produzir pigmento avermelhado. - Diagnóstico laboratorial: Isolamento em meio de Ágar Sangue, fazer a coloração de Gram e identificação bioquímica (produção de gás, hemólise, sensib. Penicilina…). Outros: FC, IF, ELISA, PCR. Observar aspectos da colônia, forma colõnias rugosas, expandidas, branco acinzentadas, com bordas irregulares e “textura de vidro fosco”. 11
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