Aula 2 Tecnologia do DNA recombinante (parte 2)

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Aula 2 – Tecnologia do DNA recombinante (parte 2)
REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)
Técnica de amplificação de massa de DNA, aumenta o número de cópias.
É uma reação enzimática. Possui uma equação que dita sua cinética: a quantidade de produto final (P) que eu obtenho é uma função da quantidade de molde inicial (Tinicial) que eu coloco (substrato), multiplicado pelo fator “1 + eficiência” elevado ao número de ciclos da reação (n). 
“n” é o número de vezes que aquela reação vai acontecer. O E (eficiência) varia de 0 a 1. Se a eficiência for de 100%, (1+E)=2 e isso significa que a cada ciclo de reação esse valor vai duplicar. O produto final também serve de molde.
Se a reação estiver operando em eficiência máxima, sua subida será exponencial. Não existe reação enzimática que opera com 100% de eficiência o tempo todo, portanto, na realidade, a reação processa em uma parte com eficiência máxima e com o passar dos ciclos ocorre uma queda de eficiência (fase de amplificação linear) até chegar a um platô. Essa técnica possui aplicação na área criminalista, em análises forenses, pois é possível aumentar a massa de uma pequena amostra.Esgotamento do meio reacional
A cada vez que se gera um produto, este serve de molde para a próxima rodada de reação. Por isso a progressão ocorre de forma logarítmica.
Fases do PCR:
Fase exponencial: máxima de eficiência;
Fase linear: onde a eficiência começa a ser perdida;
Fase de platô: onde o máximo de produto está sendo gerado.
Componentes para uma reação de PCR:
DNA polimerase – ptn que deve se associar a algo com carga negativa. A DNA polimerase possui uma taxa de erros. Logo, no PCR usa-se DNA polimerase de alta fidelidade, baixa processividade (mais lenta) e, consequentemente, baixa taxa de erros.
Nucleotídeos – são os formadores de DNA.
DNA molde inicial – substrato.
Primers senso (foward) e antisenso (reverse) – é o iniciador da reação. Doa OH necessário para fazer a primeira ligação fosfodiéster e formar o DNA. Dá a especificidade do trecho de DNA que se quer amplificar, pois ele é planejado para ser complementar ao seu alvo. Quando a dupla fita de molde é dissociada, temos um primer anelando na primeira fita (primer senso) e outro na segunda fita (primer antisenso). A direção de anelamento é sempre 5’–3’, logo, o primer senso anela da esquerda para a direita e o antisenso da direta para a esquerda (sentido reverso). Assim, temos a OH livre disponível para começar a reação e no final temos uma cópia exata desse fragmento delimitado por esses 2 primers.
Tampão de reação (meio bioquímico de reação) – necessário para que uma reação enzimática ocorra. No tampão está contido Mg2+ (colocado para reduzir a carga negativa do meio devido a presença do DNA). O problema é que a ligação DNA – polimerase também é um ponto de especificidade, de modo que se colocar muito Mg2+ no sistema, a DNA polimerase começa a interagir de uma forma não tão controlada. O Mg2+ facilita a ligação DNA molde – DNA polimerase.
Etapas do sequenciamento:
Como desfazer a dupla fita se não há helicase no sistema? Uma opção seria promover o aumento da temperatura para desfazer a interação entre as duas fitas que se dissociam na faixa de 95°C. Após isso, como a temperatura para anelamento do primer é de 60°C, é preciso resfriar o sistema. Portanto, as etapas são:
1) Desnaturação do DNA por aquecimento para dissociação das fitas, a uma temperatura em que não haja desnaturação dos nucleotídeos; 
2) Resfriamento do sistema de forma a permitir o anelamento do primer nas fitas, mas não o bastante para a reassociação das fitas; 
3) Aquecemos novamente para temperatura ótima para a enzima (DNA polimerase), em geral 70°C, e, assim, a DNA polimerase faz a extensão da fita simples de DNA formando uma nova dupla fita. O processo é repetido quantas vezes forem necessárias.
 
Não existe enzima de mamífero que resista a essa temperatura, então usamos enzimas de organismos extremófilos (que vivem em fontes termais).
PCR com DNA genômico:
O gene que eu quero é de uma bactéria, posso usar o DNA genômico da minha bactéria e ter exatamente aquela sequência da ptn? 
Se eu quero um gene de procarioto, ele já está pronto naquele DNA porque não sofre processamento. Já o de eucarioto não contém apenas a sequência que codifica a ptn, pois possui éxons e íntrons, portanto se eu colocar o DNA genômico na reação eu não vou ter a mesma proteína resultando no que eu quero, se eu coloco uma bactéria para replicar, não teremos processamento. Podemos pegar o RNAm maduro que só contém a sequência codificante da proteína, porque todos os processos de splicing já aconteceram, porém nós precisamos ter uma molécula de DNA. O que pode ser feito é gerar um DNA, chamada de cDNA (DNA complementar) a partir da molécula de RNAm, essa conversão é feita pela transcriptase reversa (presente em retrovírus). Com isso teremos moléculas de DNA que são exatamente complementares ao RNAm que nós queremos e então usamos como molde para o PCR.
Diferentes primers usados na síntese de cDNA: 
Obs.: A cauda poliA na extremidade 3’ é marcador de RNAm maduro.
1) Primer oligo dT: só tem “T”, anelando só aonde que tem “A”. A transcriptase reversa só vai anelar com o cDNA de um RNAm maduro; 
2) Primer específico: usar primer específico somente para aquele determinado cDNA de interesse;
3) Primer randômico: não conhece a sequência dele e, com isso, ele vai anelar com qualquer sequência de cDNA, como RNAm, RNAt, RNA pré, enfim, qualquer coisa (pior opção).
Detecção da amplificação de uma PCR:
GEL COM BROMETO DE ETÍDEO
O sucesso ou não da reação é visto ao correr o PCR em uma eletroforese em gel de agarose. Esse polímero forma uma malha e fragmentos de DNA que são grandes migram com mais dificuldade enquanto fragmentos menores, com mais facilidade. Com isso, temos a dispersão desse gel de acordo com o tamanho do fragmento e colocando um padrão de peso molecular temos o poder de comparar um com a outro, podendo identificar exatamente onde está o que se quer. Uma vez essa reação ocorrida, nós podemos usar um reagente fluorescente, intercalado ao DNA, como o brometo de etídio, para propiciar a visualização. 
Para verificar se a reação ocorreu corretamente, podemos olhar o tamanho da banda, mas com isso, vemos só se a banda está correta e não a sequência de DNA e o que queremos é que a sequência esteja exatamente igual ao que desejamos. Então, para verificarmos a sequência, fazemos o sequenciamento de DNA.
SEQUENCIAMENTO DE DNA PELO MÉTODO DE SANGER 
Também baseado na reação de PCR (usa DNA polimerase, primer, nucleotídeos...). 
Qual é a “sacada” desse método? Façamos 4 reações exatamente iguais, e a grande diferença é que em cada um dos tubos será colocado um dideoxinucleotídeo diferente (por ex. ddATP, ddGTP). Diferente dos deoxinucleotídeos, os dideoxinucleotídeos não possuem a OH na posição 3’. O dideoxi é incorporado na fita, mas não permite que a reação continue processando. Então, por ex., no tubo em que há dideoxi ATP, toda vez que houver uma posição em que a polimerase deverá colocar um A, ela tem duas possibilidades: ou ela vai encaixar um A que é bom (deoxi) ou ela vai encaixar um A que é ruim (dideoxi); se colocar um A dideoxi, a reação para. E assim, em cada um dos tubos, esse acaso irá acontecer. Mas como fazer para distinguir esses pequenos fragmentos de DNA? Vamos correr com gel (poliacrilamida) e esse polímero é feito de uma forma que torna capaz de distinguir a diferença de um nucleotídeo, ou seja, se tiver 10 corre de um jeito e se tiver 11 nucleotídeos corre de outro. No fim, temos essa imagem ao lado. Como interpretamos o gel: de baixo para cima e cada coluna é um nucleotídeo. Essa técnica era muito demorada e trabalhosa, além de usar radioatividade, mas assim que era feito antigamente.
Nos dias de hoje, é feito o sequenciamento automático. 
SEQUENCIAMENTO AUTOMÁTICO DE DNA
O princípio do método é praticamente o mesmo, mas agoraé feita em uma reação só (todos os dideoxinucleotídeos estão misturados); a diferença é que cada dideoxinucleotídeo está marcado com um fluoróforo diferente. Então, se pegarmos a mistura que foi produzida e corrermos em uma eletroforese capilar, e levarmos a um equipamento que tem um laser que excita esses fluoróforos conseguindo distinguir a cor que ele vê, há a capacidade de saber a cor que cada fragmento tem, separados por tamanho. No fim, o que temos é um eletrofluorograma em que cada pico é um nucleotídeo. Esse é um tipo de sequenciamento, mas há também os sequenciamentos profundos, entretanto, o citado acima é o mais barato e o mais utilizado.
CLONAGEM MOLECULAR
Protocolo formado por várias etapas em que queremos inserir fragmentos de DNA (insertos) em vetores (plasmídeos ou cromossomos artificiais).
Permite a propagação de insertos de interesse, sua caracterização e manipulação. Método de geração de construções para produção de proteínas recombinantes.
Características básicas de um plasmídeo: 
Plasmídeo é um DNA extra cromossomial de origem bacteriana. Região múltipla de clonagem é uma região do plasmídeo com sequências de DNA que são reconhecidas por uma família de enzimas conhecidas como enzimas de restrição que são capazes de cortar o DNA na sequência própria dela (clivagem específica). Essas enzimas são oriundas principalmente de bactérias. Por que essas enzimas não clivam o DNA da própria bactéria? Elas conhecem deoxinucleotídeos (A, T, C e G) e se houver qualquer modificação neles, essas enzimas não reconhecerá mais. Devido ao mecanismo de metilação dos deoxinucleotídeos feito pela própria bactérias, ela consegue manter eles protegidos de serem reconhecidos e clivados. 
Ao usarmos a mesma enzima para cortar as pontas do inserto, serão geradas pontas exatamente iguais. Se pegarmos o vetor e fizermos a digestão com a mesma enzima, teremos também pontas exatamente iguais sendo complementares as pontas do inserto. Juntando as duas, as pontas vão se anelar e, então poderemos iniciar a replicação.
Toda enzima gera pontas coesivas? Não. Podemos ter enzimas que geram as chamadas pontas cegas.
A sequência de cortes de uma enzima de restrição são chamadas palindrômicas, isto é, a fita de cima lida em uma direção tem a mesma sequência da fita de baixo lida na direção inversa.
Então, juntando o inserto digerido com o vetor digerido formamos a molécula híbrida uma vez que temos a ação da DNA polimerase refazendo as ligações fosfodiéster.
Esse mecanismo descrito acima é chamado de clonagem não-direcional, pois se as pontas foram iguais temos dois problemas práticos: o vetor pode fechar sozinho e o outro problema está relacionado com a orientação que o inserto pode entrar. 
O que podemos fazer para o vetor não se religar e para o inserto não se inserir na posição errada? Usar duas enzimas de restrição diferentes fará com que as pontas não sejam iguais (impede que o vetor se feche completamente e que o inseto se insira na posição errada). Esse processo é chamado de clonagem direcional.
Em uma ligação não direcional há 50% de a ligação ocorrer da forma esperada e 50% de ocorrer da forma que não se espera. 
Mas podemos tirar a OH ou o fosfato e, com isso, pode ser que as pontas se anelem, mas não irão fechar completamente. Para tirar o fosfato podemos usar uma fosfatase antes de misturar o inserto ao vetor, pois se fizermos tudo junto, tiraremos dos dois e aí não haverá ligação.
Transformação de bactérias: inserção das moléculas híbridas em bactérias. A intenção é que com um choque térmico, a molécula híbrida consiga entrar na bactéria. Membrana de bactérias não é permissiva a ácido nucleico. Para que a inserção ocorra, banhamos a bactéria sucessivas vezes em um íon divalente para neutralizar a repulsão e fazer com que haja aproximação entre a superfície da bactéria e seu plasmídeo e, uma vez dado o choque térmico, serão gerados pequenos poros e qualquer molécula de plasmídeo que estiver por perto irá entrar na célula e o poro é fechado de novo.
Como distinguir as bactérias? Plaquear as bactérias em ágar suplementado com meio de seleção (antibiótico). Quem não recebeu plasmídeo irá morrer.
Crescer colônias de bactérias em meio liquido com antibiótico, fazer uma extração de DNA plasmidial e a massa obtida pode ser analisada para saber se tem ou não o inserto que se quer. Qual análise podemos usar: Sequenciamento é muito caro. Se digerimos com a mesma enzima de restrição que usamos anteriormente, o inserto irá soltar o fragmento de DNA que desejamos encontrar. Se pegarmos o DNA plasmidial para uma reação de PCR usando os mesmos primers do início também podemos avaliar se há ou não o inserto.
Se olharmos a análise por PCR ao lado, vemos que as colônias C2 e C3 estão iguais ao controle positivo o que significa grande chance de o DNA do inserto estar nelas, mas só podemos comprovar por sequenciamento. Jogamos a sequência obtida num banco de dados in silico para análise, e precisa ser 100% igual ao original. 
PCR de mutagênese sítio dirigida
Extensão circular: Quando já tenho o inserto clonado em um vetor de expressão circular, como tem que ser em um plasmídeo. No plasmídeo eu tenho o inserto original. E então, por ex., eu não quero AGC (serina), eu quero TGC (cisteína). OLHAR FIGURA AO LADO:
Como fazer a mutação? Vou contruir um primer em que o ponto de mutação está exatamente no meio do primer, de modo que eu tenho tanto para a esquerda como para a direita da mutação um monte de sítios de anelamento. Quando juntar o molde ao primer haverá anelamento perfeito do primer nos dois segmentos, mas no meio não irá parear certo. A polimerase não se importa com isso, pois a ela só interessa o OH livre. Então, a polimerase irá se estender até chegar no final. Quando acabar ela vai ter gerado um DNA circular mutante. No fim das contas haverá um número enriquecido de plasmídeos mutantes e dupla fita.
Extensão de fragmentos sobrepostos: O “a” e o “d” são os primers usados para fazer o primeiro PCR. Fazer duas reações de PCR independentes. Na primeira, usar o primer “a” original com o primer “b” antisenso carregando a mutação. A segunda terá o primer “c” senso mutante com o “d” antisenso original. Com isso, serão gerados dois produtos: AB e CD. Há uma região de pareamento entre esses produtos gerados. Juntando os dois produtos de PCR e fazendo todo o processo (com DNA polimerase) uma fita mutante irá parear com a outra gerando um fragmento exatamente igual ao inserto, mas com a mutação pontual.
O QUE CAI NA PROVA? LÓGICAS DE MONTAGEM DE PRIMER.