Relatório de microbiologia

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
CURSO DE QUÍMICA INDUSTRIAL BACHARELADO
CENTRO DE CIÊNCIAS QUÍMICAS, FARMACÊUTICAS E DE ALIMENTOS
PROFª Dra. ANELISE VICENTINI KUSS
AULAS PRÁTICAS:
VIZUALIZAÇÃO DE CULTURAS DE FUNGOS 
COLORAÇÃO COM LACTOFENOL AZUL ALGODÃO;
MÉTODO FÍSICO E QUÍMICO DE CONTROLE MICROBIANO;
COLIFORMES TOTAIS E TERMOTOLERANTES. 
Pelotas, junho de 2015
INTRODUÇÃO
O Reino Fungi compreende um conjunto de organismos heterotróficos, eucarióticos, essencialmente aeróbicos, com limitada capacidade anaeróbica que pode sintetizar lisina. Como material reserva, acumulam glicogênio e são desprovidos de clorofila e seu núcleo é rodeado por membrana nuclear. Sua parede celular é rígida e possuem quitinosa, retículo endoplasmático, mitocôndrias semelhantes as de células animais e vegetais, além de vacúolos, microtúbulos e ribossomos. Os fungos são divididos em unicelulares e multicelulares. Os fungos unicelulares são as leveduras, que apresentam células arredondadas ou ovais e se dividem por brotamento e raramente por cissiparidade, já os fungos multicelulares são chamados filamentosos, miceliais ou bolores, atualmente conhecidos como oportunistas. Estes apresentam uma estrutura tubular, com parede rígida, a hifa, que pode ser ramificada. O conjunto de hifas é denominado micélio ou talo, elas podem apresentar parede transversal (septo) ou não, portanto o micélio pode ser septado ou asseptado. 1,2
O estudo morfológico dos bolores e leveduras é importante para a determinação do gênero e espécie. Para isso são empregados dois métodos básicos: o primeiro consiste no exame macroscópico da colônia, no qual deve ser descrito tamanho, superfície, bordas, pigmentação, etc. O segundo consiste no exame microscópico, que pode ser feito retirando-se um fragmento da colônia que é então colocado entre lâmina e lamínula, para a observação do micélio e tipos de esporos, ou usando-se a técnica de Ridell para microcultivo em lâmina. O método de coloração com Lactofenol Azul Algodão é usado para preparar exame microscópico de colônias de fungos. É uma técnica que tem a finalidade de visualizar o micélio vegetativo e reprodutor de um fungo filamentoso, como também as características da célula vegetativa e reprodução por brotamentos de leveduras.2
O controle microbiano pode ser exercido através da limitação do crescimento de microrganismos, um processo de inibição, ou pela remoção ou morte de todos os organismos vivos e seus vírus, processo conhecido como esterilização. Este controle pode ser feito por método físico, como temperatura, radiação, filtração, entre outros, e pelo método químico como utilizando desinfetantes, antissépticos preservativos usados em alimentos.3 
As infecções hospitalares representam um problema tanto no Brasil quanto no mundo e constituem um risco à saúde dos usuários dos serviços hospitalares. As infecções pós-operatórias, denominadas atualmente como infecções do sítio cirúrgico (ISC), constituem uma parcela significativa no total de todas essas infecções, sendo considerada a segunda principal causa dessas infecções. Sua prevenção e controle dependem da adesão dos profissionais da área da saúde às medidas preventivas.4 A Anti-sepsia é a eliminação das formas vegetativas de bactérias patogênica e grande parte da flora residente da pele ou mucosa, através da ação de substâncias químicas (anti-sépticos), já a degermação é a remoção de detritos, impurezas, sujeira e microrganismos da flora transitória e alguns da flora residente depositados sobre a pele do paciente ou das mãos da equipe odontológica através da ação mecânica de detergente, sabão ou pela utilização de substâncias químicas (anti-sépticos).5
O calor é um dos mais importantes métodos para o controle do crescimento para eliminar os microrganismos. Acima da temperatura ideal de crescimento o calor vai promover a desnaturação de proteínas estruturais e enzimas, levando a perda da integridade celular à morte. O calor seco, elimina os microrganismos também por processo de oxidação. O calor úmido na forma de vapor tem o maior poder de penetração e eliminar as formas vegetativas dos procarióticos, vírus e fungos e seus poros, neste método utiliza-se autoclave. A morte pelo o calor é uma função exponencial que ocorre à medida que a temperatura menor será o valor D (maior temperatura, menor D). Deste modo, são necessárias rápidas exposições à temperatura alta para grande redução no numero dos microrganismos viáveis.6
Há muitos tipos diferentes de bactérias que estão distribuídos em muitos gêneros. As bactérias do grupo dos coliformes são utilizadas em larga escala nas medições microbiológicas que testam a qualidade da água e de alimentos para que as pessoas os consumam sem riscos maiores. 
Os coliformes totais compõem os grupos de bactérias gram-negativas que podem ser aeróbicas ou anaeróbicas (isto dependerá do ambiente e da bactéria), não originam esporos e fermentam a lactose, produzindo ácido e gás à 35/37°C. Já os coliformes fecais são também conhecidos como “termotolerantes” por suportarem uma temperatura superior à 40°C, convivem em simbiose com humanos, bois, gatos, porcos e outros animais de sangue quente. São excretados em grande quantidade nas fezes e normalmente não causam doenças (quando estão no trato digestivo). Neste grupo está presente a bactéria gram-negativa Escherichia coli, e ao se ingerir alimentos por ela contaminados, os resultados desagradáveis (como uma gastrenterite, por exemplo) podem ser brandos ou desastrosos, dependendo do grau de contaminação.7
OBJETIVO
Isolar fungos filamentosos e leveduriformes do ambiente, preparar o microcultivo e verificar as estruturas vegetativas e reprodutivas por microscopia.Observar o comportamento das bactérias e o seu crescimento quando expostas às substâncias anti-sépticas e a agentes físicos. Determinar as unidades formadoras de colônia (UFC) De coliformes totais e coliformes termotolerantes.
REVISÃO DA LITERATURA
As micotecas são coleções de fungos conservadas para estudo futuro ou para a obtenção de extratos, drogas e outros fins. A conservação em meios de cultura por repiques sucessivos exige cuidados e nem sempre é fácil. Há necessidade de novas técnicas para a manutenção de fungos viáveis por longos períodos. No artigo “ PRESERVAÇÃO DE FUNGOS EM ÁGUA DESTILADA”, avaliou a eficácia da preservação de fungos em água destilada num período de 12 meses. Onde foram avaliadas 43 espécies de fungos que foram mantidas em frascos de vidro com água destilada estéril. Mensalmente eram colhidos de 200 a 250μl do líquido e inoculado em ágar batata dextrose para avaliar o crescimento e viabilidade dos fungos. O crescimento das colônias foi observado semanalmente e realizada a coleta de material para análise microscópica mensalmente pelo método da coloração pelo lactofenol azul algodão. Mensalmente era realizado o microcultivo em lâmina. Ás análises microscópicas das cepas em estudo, quanto à viabilidade do micro e macroconídios, corpo de frutificação e micélios, notou-se que mesmo com muitos repiques apresentaram qualidade inerente às cepas virgens ou selvagens. Para confirmar essas características, usou-se a técnica do microcultivo, que mostrou as microestruturas do organismo em estudo típicas de acordo com os métodos usados para identificação. Concluindo-se que a preservação de cepas pelo método da água destilada possibilitou, nesse curto espaço de tempo, provar a viabilidade e a capacidade de esporulação das cepas submetidas ao estudo. A conservação de fungos em água destilada é método barato e prático para manutenção de micoteca.8
Tendo em vista que o êxito de qualquer procedimento cirúrgico depende não só da técnica empregada como também do rigoroso controle da assepsia, decidimos, ao iniciar as cirurgias reconstrutoras do quadril, no Departamento de Ortopedia e Traumatologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, realizar avaliação bacteriológica sistemática dos pacientes e do ambiente hospitalar (enfermaria e sala operatória). No artigo“SUBSTITUIÇÃO TOTAL DO QUADRIL CONTROLE BACTERIOLÓGICO DA ASSEPSIA” foi adotado um conjunto de medidas e cuidados, visando a prevenção da infecção cirúrgica em pacientes submetidos à artroplastia, utilizando sistematização das técnicas da degermação do paciente e da desinfecção do ambiente. Verificou-se que o paciente apresentou-se ao hospital com a pele contaminada por uma população bacteriana muito grande, constituída principalmente por Staphylococcus, geralmente não patogênicos, variando entre os limites de 25 a + 150 colônias, por placa Rodac, nos meios Agar-infusão-sangue e Chapman, respectivamente. Após a aplicação da técnica de degermação, as condições bacteriológicas da pele do paciente e da roupa foram novamente avaliadas. A pele, após aplicação do antisséptico, apresentou-se sem nenhuma colônia, isto é, houve redução total dos microorganismos. No períneo encontramos apenas 18 colônias de Staphylococcus epidermidis no Agar-sangue e nenhuma colônia cresceu nos meios de Chapman e Teague, considerando-se que esta região antes da degermação possuía número incontável de colônias ou contaminação em grau máximo, a redução ocorrida foi muito boa. Na roupa limpa fornecida pelo hospital constatamos a presença de apenas 3 colônias de Staphylococcus epidermidis no Agar-sangue e nenhuma colônia nos meios de Chapman e Teague. A roupa de uso do paciente apresentou grande número de colônias, possuindo, portanto, condições higiênicas insatisfatórias.  Comprovou-se, através de avaliação microbiológica, que a técnica de degermação empregada foi capaz de reduzir a flora bacteriana dos pacientes.O conjunto de cuidados e medidas adotadas como rotina, em pacientes submetidos à substituição total do quadril, contribuíram para diminuir o risco de infecção.9
 No artigo “ISTERIA SPP., COLIFORMES TOTAIS E FECAIS E E.COLI NO LEITE CRU E PASTEURIZADO DE UMA INDÚSTRIA DE LATICÍNIOS, NO ESTADO DA PARAÍBA (BRASIL)” Investigou-se a qualidade microbiológica do leite in natura e na linha de produção (leite recém-pasteurizado e leite ensacado), de uma usina de beneficiamento em Campina Grande-PB. Foi pesquisada a presença de Listeria spp. e sua diversidade de espécies, os níveis de coliformes totais (CT), coliformes fecais (CF) e Escherichia coli. Analisou-se um total de 75 amostras de leite, sendo 45 de leite cru, 15 de leite recém-pasteurizado e 15 de leite ensacado. Conclui-se que Listeria spp. esteve presente em porcentagens elevadas de amostras de leite cru de todos os fornecedores, as quais também apresentaram elevados níveis de contaminação fecal. No leite cru houve grande diversidade de espécies de Listeria, com predominância de L. monocytogenes, seguida por L. innocua, e em menores porcentagens, L. ivanovii e L. grayi. As amostras ensacadas apresentaram índices de CT e CF mais elevados que as recém-pasteurizadas, sugerindo contaminação pós-pasteurização ou falhas no armazenamento após pasteurização. A positividade para Listeria spp. nas amostras de leite pasteurizado, de 66,6% no primeiro período e 11,1% no segundo, demonstraram que a pasteurização não foi suficiente para eliminação da Listeria ou que a contaminação ocorreu pós-processamento. Entretanto, a diminuição das porcentagens de amostras positivas, sugere que a sanitização da usina melhorou a qualidade bacteriológica do leite beneficiado, apesar de não ter eliminado a contaminação.10
METODOLOGIA
Antes de todas as práticas é feita a desinfecção da banca com álcool etílico hidratado 70º INPM, exceto na aula prática de “Métodos físicos e químicos de controle microbiano.”
PRÁTICA: Visualização de culturas de fungos e coloração com lactofenol azul algodão
Materiais e reagentes
Bico de bunsen
Alça de platina
Lactofenol azul-algodão
Lâmina
Microscópio
Foi colocada uma gota de lactofenol azul-algodão sobre a lâmina, retirou-se uma alíquota de cultura de levedura utilizando a alça de platina e colocou-se sobre a gota de lactofenol e homogenizou-se. Logo após foi coberta com a lamínula e examinou-se no microscópio nas objetivas de 10x. 
Resultados e discussões
Através do microscópio foi possível analisar nos fungos leveduriforme, os esporos e nos fungos filamentosos identificou-se hifas e esporos. 
O lactofenol azul de algodão é composto de lactofenol, que atua como fluido de montagem, e de azul de algodão, um corante. Os organismos suspensos no fluido de montagem são rapidamente mortos pela presença do fenol que age como citotóxico, precipitando proteínas celulares e inativando sistemas enzimáticos essenciais. O ácido lático preserva as estruturas fúngicas. A visualização e preservação de fungos através deste sistema são excelentes, uma vez que não ocorre plasmólise ao matar os organismos. O azul de algodão é incorporado à fórmula como corante diferencial para quitina e celulose, elementos da parede celular dos fungos.
PRÁTICA: Método físico e químico de controle microbiano
Materiais e reagentes
2 Placas de Petri com meio rico em sólido;
Sabonete
Água destilada estéril
Papel toalha esterilizado
Álcool iodado ou 70% 
Três tubos com 0,1 mL da cultura de bactérias esporulados de Bacillus cereus
Autoclave 
 
Degermação e Antissepsia 
Para a degermação, pegou-se 1 Placa Petri com o meio nutritivo e dividiu-se em 2 partes: Uma parte com os dedos antes de lavar e outra parte depois de lavar as mãos com sabonete. Para a antissepsia, pegou-se 1 Placa Ptri com o meio nutritivo e divisiu-se em 2 partes: Uma parte com os os dedos sem limpar e outra parte depois de passar álcool 70%. Após uma semana obtivemos os resultados.
Resultados e discussões
 
 Figura (A) Antissepsia Figura (B) Degermação
Na figura (A), podemos observar que o álcool 70% inibiu o crescimento bacteriano, pois álcoois atuam desestruturando a parede celular através da interação com os fosfolipídios que constituem a estrutura dos microorganismos. Nesse experimento se comportaram como o esperado atuando como anti-sépticos. Já na figura (B), nota-se o crescimento bacteriano mesmo com a interferência do sabonete, pois ele atua na membrana celular, alterando-a, nesse caso o sabonete não foi eficiente. Nas duas figuras, onde as mãos não foram limpas ocorreu o crescimento bacterias e fungo normalmente.
Cultura de esporos bacterianos submetida a processo físico – calor
Foram inoculados 3 tubos contendo 0,1 mLda cultura de bactérias esporuladas de Bacillus cereus. No tubo 1 a temperatura ambiente, no tubo 2 aqueceu-se 5 mim e no tubo 3 foi autoclavado. Os tubos foram incubados a 37ºC por 1 semana e observou-se os resultados.
Resultados e discussões 
Como podemos observar na figura (C), que ocorreu crescimento em dois (1 e 2) tubos, no submetido ao aquecimento durante 5 minutos e no que ficou em temperatura ambiente. O tubo 3, que foi autoclavado foi mais eficiente devido ao maior poder de penetração do vapor d’água. A morte é decorrente da desnaturação de ácidos nucléicos e proteínas, podendo também romper membranas. Além disso, o vapor tem maior capacidade de romper as pontes de hidrogênio. 
O crescimento obtido no tubo no tubo 1 e 2, foi pelo fato dessa bactéria suportar uma temperatura no máximo de 50ºC, como os tubos foram expostos a temperaturas baixas as bactérias sobreviveram.
Figura (C): Respectivamente: Tubo 3, tubo 2 e tubo 1.
PRÁTICA: Coliformes totais e termotolerantes.
Materias e reagentes
Seis tubos contendo o caldo lactosado
Seis tubos de Durham
Alça de Platina
Meio de Cultura Verde Brilhante
Amostra da água do lago 10-1 mL
Bico de Bunsen
A prática foi dividida entre os grupos da aula, onde cada grupo escolheu a sua amostra (Água do lago ou caixa d’água) e a quantidade de amostra (10 mL , 1 mL ou 0,1 mL) que colocou-se no caldo lactosado. 
Nosso grupo escolheu a água do lago e a quantidade de 1 mL. 
1º Etapa: Foi adicionado 1mL de amostra da água do lago aos 3 tubos com caldo lactosado, logo após foram incubadosá 35ºC por 24h. 
2º Etapa: A partir dos tubos com crescimento positivo no caldo lactosado, foram coletadas amostras, com a alça de platina, de cada um desses tubos e colocadas em outros 3 tubos, contendo o caldo bile verde brilhante. Logo após foram incubados a 35ºC por 48h.
3º Etapa: A partir do crescimento positivo no caldo verde brilhante, foi inoculado tubos contendo caldo EC (com tubos Durham invertidos no seu interior), e incubados a 44,5ºC por 24h.
4º Etapa: A partir do crescimento positivo no caldo verde brilhante e no caldo E.C., foi possível avaliar o número mais provável (NMP) de coliformes totais e termotolerantes. 
Resultados e discussões 
Ocorreu o crescimento positivo nos 3 tubos do caldo lactosado e do caldo verde bile brilhante, já no caldo E.C., apenas 2 tubos apresentaram turvação e a formação de gás no tubo de Durham, obtendo o crescimento positivo. Estes resultados podem ser observados na Figura (D). 
 
Figura (D): Caldo bile verde brilhante e caldo E.C., respectivamente.
Foi utilizada a tabela NMP para avaliar o número mais provável de coliformes termotolerantes. A partir dos 2 tubos com crescimento positivo no caldo E.C. calculou-se o número mais provável de coliformes totais, onde trocamos resultados com os outros grupos e obtivemos o valor de 120, equivalente 11 ufc.
Na avaliação de coliformes totais, obtivemos os 3 tubos com o crescimento no caldo bile verde brilhante, que foi possível observar a turvação e o gás no tubo de Durham, Os resultados foram trocados com os outros grupos e obtivemos o valor de 330, aproximadamente 240 ufc.
Podemos Observar na tabela abaixo, os dados trocados com os grupos da aula prática, onde temos os todos os resultados de coliformes totais e temotolerantes, presentes na água do lago e na caixa d’água. 
	
	CBVB Coliformes totais
	UFC
	E.C. Coliformes Termotolerantes
	UFC
	
	10mL
	1mL
	0,1mL
	
	10mL
	1mL
	0,1mL
	
	Água do Lago
	+ + +
	+ + +
	- - -
	
	+ - -
	+ + -
	- - -
	
	Positivos
	3
	3
	0
	240
	1
	2
	0
	11
	Caixa d’água
	+ + +
	+ - -
	+ + -
	
	+ + -
	- - -
	+ + -
	
	Positivos
	3
	1
	2
	210
	2
	0
	2
	14
 	
CONCLUSÃO
Pode-se concluir que o crescimento bacteriano é influenciado pelos agentes anti-sépticos e, também, por agentes físicos. Esses agentes inibem ou matam as colônias bacterianas, cada bactéria, por sua vez, possui de acordo com a sua estrutura, a capacidade de resistência a tais agentes. É possível analisar uma amostra e avaliar se ela está contaminada por coliformes totais ou coliformes fecais, pelo método de avaliação NPM (número mais provável).
REVISÃO BIBLIOGRAFICA
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