Técnicas de Diagnostico Molecular BIOMOL

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TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO 
MOLECULAR 
Profa. Dra. Ruscaia Dias Teixeira Prof. Dr. Paulo Queiroz 
DIAGNÓSTICO MOLECULAR 
Avaliação da estrutura dos componentes do 
DNA 
DIAGNÓSTICO MOLECULAR 
É um campo emergente na área de análises 
clínicas laboratoriais. 
DIAGNÓSTICO MOLECULAR 
Detecta Agentes infecciosos (Ex: HPV) 
DIAGNÓSTICO MOLECULAR 
Detecta alterações genéticas do próprio organismo 
Auxilia no diagnóstico e prognóstico dessas doenças 
 
DIAGNÓSTICO MOLECULAR 
Identifica pessoas (criminosos ou cadáveres) 
• Existem sequências que se repetem no nosso genoma. 
• O número de repetições pode variar de pessoa para pessoa 
• Ao reconhecer sítios com pedaços de DNA com variados números de 
cópias em série, podemos distinguir duas pessoas . 
 
DIAGNÓSTICO MOLECULAR 
Determina paternidade ou graus de parentesco. 
(filhos possuem metade dos alelos maternos e metade dos alelos do pai) 
 
DIAGNÓSTICO MOLECULAR 
Auxilia na determinação da terapia a ser utilizada 
Tratamento com GH 
Mutação no gene SHOX Mutação no gene GHR 
Insensibilidade ao GH 
TRATAMENTO DE BAIXA ESTATURA 
DIAGNÓSTICO MOLECULAR 
Avalia a suscetibilidade a doença 
Gene APP 
Síntese de PPA em cérebros normais 
Beta – amilóide – clivagens anormais da PPA 
Placas amielóides 
Associado ao maior risco de desenvolvimento de 
Alzheimer 
 
Alzheimer 
CONCEITOS IMPORTANTES 
GENE 
Splicing 
MUTAÇÃO GÊNICA 
Gene com sua função alterada, levando ao aparecimento de 
doenças. 
Adição ou subtração de bases 
 
Substituição de bases 
 
ANEMIA FALCIFORME 
ALELOS 
Forma alternativa do mesmo gene 
Ocupam o mesmo locus em cromossomos homólogos 
cDNA 
DNA sintetizado a partir de uma molécula de 
mRNA, cujos íntrons já foram removidos, 
numa reação catalisada pela enzima 
transcriptase reversa. 
PRIMERS 
SÍTIOS DE RESTRIÇÃO 
REPETIÇÕES EM TANDEM 
• Sequências curtas 
• Idênticas ou similares 
• em tandem (agrupadas) ou dispersas pelo 
genoma. 
• em tandem: DNAs satélite 
• No repetições: variam em cada indivíduo, 
tornando-os únicos. 
• Formam uma espécie de “impressão 
digital” do DNA. 
INDICAÇÃO DOS TESTES 
MOLECULARES 
DIAGNÓSTICO 
1. Doenças infecciosas 
2. Doenças genéticas 
3. Câncer 
 
 
1. DOENÇAS INFECCIOSAS 
• Detecção rápida de microrganismos de: 
– Crescimento lento 
• Mycobacterium kansaii – lesões pulmonares 
– Não cultiváveis 
• Treponema pallidum (bactéria agente da Sífilis) 
• bacilo Mycobacterium leprae (micobactéria agente da lepra) 
1. DOENÇAS INFECCIOSAS 
Determinação de resistência antimicrobiana 
Streptococcus pneumoniae X penicilina 
1. DOENÇAS INFECCIOSAS 
Monitoramento de doenças através da quantificação da 
infecção. 
2. DOENÇAS INFECCIOSAS 
TESTES MOLECULARES MAIS COMUNS: 
• Avaliação de carga viral para: 
– HIV 
– Hepatite C 
2. GENÉTICA HUMANA 
• Diagnóstico das doenças monogênicas: 
– identificação do gene afetado 
– mutação responsável pela doença 
• Fibrose cística (gene CFTR – produção de muco e sucos gástricos) 
• Síndrome de Marfan (gene Fibrilina – formação das fibras elásticas) 
• Distrofia muscular de Duchene (gene distrofina – permeabilidade celular das 
fibras musculares) 
 
2. GENÉTICA HUMANA 
Identificação de portadores heterozigotos 
 
Genótipos : 
Hb AS (heterozigoto de Hb S) - traço falciforme 
Hb AA (padrão normal) 
Hb SS (homozigose de Hb S) – anemia falciforme 
Hb SC (dupla heterozigose de Hb S e Hb C) – doença 
falciforme 
 
Doenças falciforme 
2. GENÉTICA HUMANA 
Diagnóstico pré-natal 
• líquido amniótico – descamações fetais 
 
2. GENÉTICA HUMANA 
Predisposição a doenças genéticas 
 
Três alelos do gene APOE: ε2, ε3 e ε4. 
Indivíduos com uma cópia do alelo ε4: risco 2X a 3X de desenvolver Alzheimer tardia. 
Homozigotos ε4ε4: risco 6X 
Apolipoproteina E 
VLDL 
2. GENÉTICA HUMANA 
• TESTES MAIS COMUNS: 
– Trombofilia hereditária (trombose) 
– X Frágil (retardo mental) 
– Microdeleção do Y (infertilidade masculina) 
 
3. CÂNCER 
CARCINOMA MEDULAR DA TIREÓIDE 
– Detecção de mutações no proto-
oncogene RET (regulam o ciclo celular) 
em uma criança com histórico familiar 
– Permite a tireoidectomia profilática 
– Elimina o risco de câncer tireoidiano 
que pode ser fatal. 
3. CÂNCER 
POLIPOSE ADENOMATOSA FAMILIAR 
– Mutações no gene APC determinam elevadíssimo risco 
de desenvolvimento de tumores colorretais malignos. 
– Testes deste gene indicarão: 
• quais indivíduos da família necessitarão de monitoragem 
• quais não terão de se preocupar 
3. CÂNCER 
Filha 
Mãe 
Câncer de mama 
BRCA1 mutante 
50% Gene mutante 50% Gene normal 
10% de risco 85% de risco 
3. CÂNCER 
LEUCEMIA MIELÓIDE CRÔNICA 
Proteína quimérica ABL 
 Atividade tirosina quinase 
3. CÂNCER 
LLC 
• Identificação de pacientes com pior prognóstico. 
– Portadores de translocação do braço longo do 13 - confere prognóstico 
favorável e sobrevida de 11 anos 
– Alterações envolvendo braço longo do 11 – confere sobrevida de 6,6 
anos 
– Portadores de deleção do braço curto do 17 - sobrevida de 2,5 anos 
VANTAGENS E DESVANTAGENS 
DO DIAGNÓSTICO MOLECULAR 
VANTAGENS 
1. BAIXA CONCENTRAÇÃO DO AGENTE 
Identifica, caracteriza e quantifica 
concentrações extremamente pequenas de 
DNA/RNA de organismos patogênicos. 
 
VANTAGENS 
2. VERSATILIDADE DE AMOSTRAS: 
• Sangue periférico 
• Fluidos corporais (Líquor, derrame pleural, líquido pericárdico) 
• Materiais obtidos através de punção (Medula óssea) 
• Tecidos frescos 
• Tecidos embebidos em parafina. 
VANTAGENS 
3. VIABILIDADE DO MICROORGANISMO 
– MOMENTO DA COLETA 
• INÍCIO DA INFECÇÃO 
• FASE CRÔNICA 
VANTAGENS 
3. VIABILIDADE DO MICROORGANISMO 
– CONSERVAÇÃO E TRANSPORTE 
• Material conservado - Temperatura ambiente 
• Sob refrigeração (gelo seco ou reciclável) 
 
VANTAGENS 
4. TEMPO CURTO DE CRESCIMENTO DE 
MICROORGANISMOS 
– GENOTIPAGEM 
– DIAGNÓSTICO RÁPIDO 
– VERIFICAÇÃO DE RESISTÊNCIA A DROGAS 
VANTAGENS 
5. Alta especificidade 
6. Diagnóstico rápido, abreviando e otimizando o tratamento. 
7. Diagnóstico qualificado com aprimoramento no manejo da 
doença. 
8. Diagnóstico confiável 
9. Diagnóstico com melhor reproducibilidade de resultados. 
DESVANTAGENS 
– CONTAMINAÇÃO DA AMOSTRA 
– PRESENÇA DE INIBIDORES 
– VIABILIDADE DOS AGENTES RNA: RNAse 
– CUSTO 
– PADRONIZAÇÃO 
 
TÉCNICAS MOLECULARES 
TÉCNICAS MOLELCULARES 
1. Southern blot 
2. Hibridização in situ 
3. RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism) 
4. PCR 
5. Fingerprinting 
6. Eletroforese em campo pulsado (PFGE) 
7. Microarranjos 
8. Sequenciamento 
1. SOUTHERN BLOT 
• Emprega sondas de DNA com homologia à 
sequência do DNA-alvo em estudo. 
 
HIBRIDIZAÇÃO IN SITU 
• Baseia-se no emparelhamento de 2 
sequencias de DNA e uma RNA marcada 
com Digoxigenina. 
• Permite a visualização de uma sequência 
nucleotídica especifica em células e 
tecidos. 
2. HIBRIDIZAÇÃO IN SITU 
Passos da Hibridação in situ 
1. Coleta do material biológico 
2. Fixação e desidratação 
3. Hibridação 
4. Detecção da sonda por imunohistoquímica 
5. Revelação com um substrato de fosfatase alcalina 
SONDA 
3. RFLP 
• RFLP - Polimorfismo de comprimento de 
fragmentos de restrição. 
• Mutações podem alterar o DNA entre um 
sítiode clivagem e outro. 
• Isto gera diferentes formas (polimorfismos) 
do mesmo trecho de DNA. 
3. RFLP 
• Raia 1: pessoa normal - dois fragmentos (alelos) do mesmo tamanho. 
• Raia 2: Portador - um alelo sadio e o outro com a mutação. 
• Raia 3: possui os dois alelos mutados. 
4. PCR 
• PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) 
• É uma técnica que amplifica uma sequência 
específica de DNA, 
• Objetivo: tornar a sequencia de DNA 
abundante e disponível para diversas 
técnicas de biologia molecular. 
 
PCR Ciclos 
• Desnaturação: 94°- 95°C 
 
• Anelamento: 55°- 65°C 
 
• Extensão: 72° 
 
• Número de ciclos: 25-40 
PCR - Desnaturação 
A desnaturação é o primeiro passo do PCR, 
no qual as fitas de DNA são separadas 
através de aquecimento a 95°C. 
PCR - Anelamento 
O anelamento é o processo através do qual 
duas sequencias de nucleotídeos são 
ligadas através da formação de pontes de 
hidrogênio. Na reação de PCR, o 
anelamento se dá através da ligação dos 
primers com o DNA Alvo, a temperatura de 
55°C. 
PCR Primers 
Os primers são sequências de 15 a 30 
nucleotídeos, fita única, que são usadas 
para flanquearem as extremidades da 
região a ser amplificada. Marcam o início e 
o fim da sequência-alvo. 
PCR Taq DNA Polimerase 
Amplifica o DNA a partir do anelamento com os 
primers, na presença de Mg, a altas 
temperaturas. 
PCR Ciclos 
PCR Requerimentos 
• Cloreto de Magnésio: .5-2.5mM 
 
• Tampão: pH 8.3-8.8 
 
• dNTPs: 20-200µM 
 
• Primers: 0.1-0.5µM 
 
• DNA Polimerase: 1-2.5 units 
 
• DNA Alvo:  1 µg 
Variações da PCR 
a. RT-PCR, 
b. nested PCR, 
c. multiplex PCR, 
d. RAPD-PCR 
e. PCR real time. 
 
µmicra 
RT-PCR 
• Utiliza uma enzima chamada transcriptase 
reversa para converter uma amostra de 
RNA em cDNA . 
• Antes da etapa de amplificação por PCR, 
• Permitindo estudo de vírus de RNA e 
análises de expressão gênica. 
 
Nested-PCR 
 É uma técnica na qual são realizados diversos ciclos de 
amplificação com um grupo de primers 
 O produto dessa amplificação é re-amplificado, utilizando-se 
outro grupo de primers dirigidos para uma seqüência que se 
encontra dentro da seqüência amplificada pelo primeiro grupo 
de primers. 
 Atualmente, raros são os estudos realizados utilizando esta 
técnica. 
MULTIPLEX PCR 
• É uma reação de amplificação 
• Detecta múltiplas sequências-alvo numa 
mesma amostra. 
• Vários pares de primers 
• Desenvolvida para detecção simultânea de 
vários patógenos. 
 
Multiplex-PCR 
• Vantagens : 
– Diminuição da intensidade e do período de 
trabalho laboratorial 
– Redução do número de reagentes 
– Redução dos custos 
Multiplex-PCR 
• Desvantagens desta técnica em relação ao 
PCR: 
– Redução da sensibilidade de detecção 
RAPD-PCR 
 “Random Amplified Polymorphic DNA” 
 Primer único e pequeno (usualmente de 10 a 
15 bases), aleatório 
 Amplificação do DNA genômico em condições 
de baixa estringência 
 Não sendo necessário o conhecimento prévio 
da região de ligação do primer. 
RAPD-PCR 
• Quando submetidos à PCR, estes 
iniciadores arbitrários resultarão na 
amplificação de uma ou mais seqüências de 
DNA 
• Gerando conjuntos de fragmentos que 
funcionam como marcadores genéticos 
• O número e o tamanho destes fragmentos 
são à base de tipagem de um isolado 
bacteriano (DESTRO, 1995). 
 
RAPD-PCR 
• A principal vantagem do RAPD sobre o PCR 
tradicional é a possibilidade de detectar 
polimorfismos do DNA sem a necessidade 
de conhecimento prévio da seqüência de 
nucleotídeos de um gene relevante ou do 
DNA alvo (MASLOW et al, 1993). 
PCR EM TEMPO REAL 
• Permite que a amplificação e a detecção ocorram 
simultaneamente, num sistema fechado, 
• Termociclador que possua sistema de 
monitoramento de emissão de fluorescência. 
• Esta técnica é empregada para quantificação de 
amostras, como para testes de carga viral e 
monitoramento de doença residual mínima. 
 
PCR em Tempo Real 
 Possui sistema tubular para detectar o acúmulo de 
produtos de PCR 
 Composto de um termociclador com câmeras detectoras 
refrigeradas para detecção de luz fluorescente, em que a 
ressonância emitida é diretamente proporcional à 
intensidade de fluorescência e por sua vez ao número de 
produtos amplificados. 
TÉCNICAS PARA 
DIAGNÓSTICO DE MUTAÇÕES 
• Existem várias técnicas que usam o PCR. 
• Algumas destas técnicas baseiam-se nas 
diferenças de mobilidade eletroforética de 
fragmentos com sequências de DNA 
selvagens e mutantes. 
TÉCNICAS PARA 
DIAGNÓSTICO DE MUTAÇÕES 
• Existem ainda outras técnicas que se baseiam na 
clivagem de bases não pareadas em 
heteroduplexes. 
• Técnicas que utilizam a detecção de alterações na 
proteína transcrita por um determinado 
fragmento de DNA. 
APLICAÇÕES DO PCR 
1. Rápida amplificação de um gene específico ou de um 
exon de um determinado gene como a primeira etapa 
para rastreamento de mutações não caracterizadas: 
– PCR para amplificações de exons específicos do DNA genômico 
– RT-PCR para análise de transcritos 
 
APLICAÇÕES DO PCR 
2. Rápida genotipagem de regiões dos genes 
que são polimórficas: 
I. Digestão da região polimórfica com enzimas de restrição sítio 
específica. 
II. Flanqueamento de primers ao sítio de restrição polimórfico, 
III. Amplificação da região do polimorfismo 
APLICAÇÕES DO PCR 
3. Diagnóstico de mutações conhecidas através 
da discriminação alélica pelo tamanho 
• Pequenas deleções ou inserções em alelos podem ser 
detectadas por PCR. 
• Exemplo: deleções no alelo mais comum que causa a fibrose 
cística (DF508) 
 
APLICAÇÕES DO PCR 
4. Diagnóstico de mutações conhecidas através 
da susceptibilidade a enzima de restrição: 
• Mutações que mudam um sítio de restrição podem ser 
detectadas, pela digestão do produto de PCR com a enzima 
de restrição específica 
 
5. Fingerprinting 
• O “fingerprinting” é um método para 
caracterização e discriminação de 
microrganismos de origem alimentar (JAY, 
2005). 
• Cada vez mais utilizado para fazer 
inferências sobre níveis de variação 
genética dentro e entre populações 
naturais (LYNCH, 1990); 
 
6. PFGE 
• Eletroforese em Gel de Campo Pulsado 
• Uma das técnicas mais utilizadas para 
análise epidemiológica da maioria das 
bactérias patogênicas. 
• É um método derivado da eletroforese 
convencional do DNA, em gel de agarose, 
sendo a principal diferença a mudança 
repetida da orientação do campo elétrico. 
 
PFGE 
Imagem: http://pcrfilme.vilabol.uol.com.br/ 
PFGE 
• Esta mudança provoca o re-arranjo da 
estrutura conformacional da molécula, 
permitindo a sua migração no gel. 
 
• A técnica de PFGE revelou-se capaz de 
diferenciar cepas da bactéria obtidas a 
partir de diferentes municípios. 
7. MICROARRANJOS 
• São lâminas com uma alta densidade de 
seqüências de DNA 
• Permitem estudos de expressão gênica, 
• Analisa uma grande quantidade de genes 
ao mesmo tempo, utilizando sondas de 
cDNA. 
8. SEQUENCIAMENTO 
• Detecta mutações em genes conhecidos. 
• Permite analisar cada uma das bases de 
determinada sequência de DNA. 
8. SEQUENCIAMENTO 
Uso de algumas técnicas que buscam alterações 
 
Após a identificação da região gênica que apresenta 
alguma alteração 
 
Tal região é submetida ao sequenciamento para 
confirmação e determinação da mutação. 
 
CONSIDERAÇÕES FINAIS 
• Possibilitou uma grande evolução nas análises de rotina 
de laboratóriosclínicos e industriais. 
• Organismos de cultivo difícil ou impossível tornaram-se 
passíveis de serem analisados. 
• Exames citogenéticos convencionais estão sendo 
substituídos pela ferramenta molecular. 
• Determinação de predisposição para certos tipos de 
câncer e doenças cardiovasculares têm se tornado 
realidade. 
• Revolucionou a ciência e a prática da medicina e áreas 
correlatas 
 
DESAFIOS 
• Tornar as variadas técnicas de biologia 
molecular, uma alternativa viável à rotina 
laboratorial, principalmente em relação ao 
custo e recursos humanos. 
 
HISTÓRICO DA BIOLOGIA 
MOLECULAR 
1953 
Watson e Crick propuseram a 
estrutura de 
dupla-hélice do DNA 
1957 
Arthur Kornberg isolou a 
DNA polimerase 1958 
Matthew Meselson & 
Franklin Stahl: Replicação 
semi-conservativa do DNA 
1971 
David Baltimore & Howard 
Temin demonstram a 
presença da RT em vírus 
capaz de sintetizar DNAfd 
a partir de RNAfs 
1975 
Fred Sanger: Seqüenciamento de DNA 
baseado em terminação de cadeia por 
incorporação de ddNTPs 
1985 
Kary Mullis: Permite obter (in vitro) 
grandes quantidades de uma 
sequência 
específica de DNA 
1989 
Descoberta da Taq 
polimerase 
termoestável no 
lago 
do “Yellowstone 
National Park” 
1995 
Haemophilus influenzae: 
primeiro 
genoma seqüenciado 1998 
C. elegans: Primeiro genoma 
completo 
de um animal 
2000 
Rascunho do Genoma Humano 
Imagens: Paola Cardarelli - XVI ENAAL 
OBRIGADO!