RESUMO PARA P1 DE BIOTECNOLOGIA FARMACEUTICA (1)

Prévia do material em texto

RESUMO PARA P1 DE BIOTECNOLOGIA FARMACÊUTICA 
INTRODUÇÃO Á BIOTECNOLOGIA FARMACÊUTICA 
“manipulação de microrganismos, plantas, animais, objetivando a obtenção de processos e produtos de 
interesse” 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
A Biotecnologia pode ser definida também através desses termos: 
 
a)Utilização de sistemas celulares para obtenção de produtos e desenvolvimento de processos. 
b)A aplicação dos princípios científicos e de engenharia para o processamento de materiais por agentes 
biológicos proporcionando produtos e serviços. 
c)Uso de técnicas de regeneração in vitro e do DNA recombinante 
Conceito de biotecnologias apropriadas: 
-Tecnicamente factíveis / -Benefícios mensuráveis / -Ambientalmente seguras /-Socioeconomicamente 
aceitáveis 
Principais técnicas biotecnológicas 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Qual a contribuição das biotecnologias para o desenvolvimento sustentável? 
Econômica: redução de custos e aumento da eficiência (matéria – prima e produção industrial) 
Ambiental: prevenção, remediação e monitoramento da contaminação. 
 Tecnologias limpas/verdes “greentech” ou “cleantech”- Termo utilizado para descrever produtos 
ou serviços que melhorem o desempenho operacional, a produtividade ou eficiência, reduzindo 
custos, insumos, consumo de energia, resíduos e poluição. 
Social: criação de empregos, qualidade de vida, segurança 
Os processos de biotecnologia ambiental levam em conta 5 elementos básicos: 
1)O composto tóxico a ser eliminado ou ter sua concentração reduzida; 
2)O meio em que o composto se encontra; 
3)As características do local que o contem; 
4)O agente biológico que conduzirá a biodegradação; 
5)As condições do processo (parâmetros). 
 
A aplicação de tecnologias biológicas aplicadas a solução de problemas ambientais é determinada 
por 3 fatores: 
 
- Custo do tratamento. 
- Duração do processo. 
- Nível ou limite ao qual se desejam diminuir ou chegar. 
 
Biossegurança 
 Ciência surgida no século passado voltada para o controle e a minimização dos riscos advindos 
da práticas de diferentes tecnologias, seja em laboratório, seja quando aplicadas no meio ambiente Estuda 
os impactos decorrentes da biotecnologia na saúde humana e animal e no meio ambiente . 
TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE 
No passado considerada a molécula mais difícil de ser analisada, hoje o DNA é passou a ser a mais fácil. 
Agora é possível isolar uma região especifica de quase todos os genomas para produzir um numero 
praticamente ilimitado de copias deles e determinar a sequencia de seus nucleotídeos em poucas horas. 
Por meio de técnicas relacionadas, um gene pode ser alterado (engenharia de DNA) e transferido de volta 
para a linhagem germinativa de um animal ou vegetal, tornando-se uma parte fundamental e hereditária 
do genoma do organismo. 
A tecnologia do DNA recombinante compreende uma mistura de técnicas, algumas recentemente 
desenvolvidas e algumas adotadas de outras áreas como a genética microbiana. Dentre as técnicas estão 
as seguintes técnicas chaves: 
-Clivagem de DNA em sítios específicos por meio de nucleases de restrição, que facilitaram muito o 
isolamento e a manipulação de genes individuais. 
-Ligação de DNA, que torna possível desenhar e construir moléculas de DNA não encontradas na 
natureza. 
-Clonagem de DNA pelo uso de vetores de clonagem, ou pela reação em cadeia da polimerase, na qual 
uma porção de DNA é repetidamente copiada para gerar vários bilhões de moléculas idênticas. 
-Hibridização de ácidos nucleicos, que torna possível encontrar uma sequencia especifica de DNA ou 
RNA com grande precisão e sensibilidade, com base em sua habilidade de se ligar seletivamente a uma 
sequencia complementar de ácidos nucléicos. 
-Determinação rápida da sequencia de nucleotídeos de qualquer DNA (mesmo genomas inteiros), o que 
torna possível identificar genes e deduzir a sequencia de aminoácidos das proteínas que eles codificam. 
-Monitoramento simultâneo do nível de mRNA produzido por gene na célula, utilizando microarranjos de 
ácidos nucleicos, nos quais dezenas de milhares de reações de hibridização ocorrem simultaneamente. 
Nucleases de Restrição 
Diferentemente de uma proteína, um gene não existe como uma entidade separada nas células, mas sim 
como uma região pequena de uma molécula de DNA muito maior. Mesmo que o DNA possa ser 
quebrado aleatoriamente em pequenos fragmentos por força mecânica, um fragmento contendo um único 
gene no genoma de mamíferos continuaria sendo apenas um entre centena de milhares de fragmentos de 
DNA. Como todas as moléculas de DNA consistem em uma mistura aproximadamente igual dos quatro 
nucleotídeos, elas não podem ser prontamente separadas como as proteínas podem de acordo com suas 
cargas e propriedades. A solução deste problema começou a surgir com a descoberta das nucleases de 
restrição. Essas enzimas, que podem ser purificadas a partir de bactérias, cortam a dupla hélice de DNA 
em sítios específicos, definidos pela sequencia de nucleotídeos local, clivando, desse modo uma longa 
molécula de DNA de fita dupla em fragmentos de tamanhos estritamente definidos. Diferentes nucleases 
de restrição têm diferentes especificidades sendo relativamente simples encontrar uma enzima que possa 
criar um fragmento de DNA que inclua um gene em particular. O tamanho do fragmento do DNA pode 
então ser utilizado como base para a purificação parcial de um gene de uma mistura. 
Diferentes espécies de bactérias produzem diferentes nucleases de restrição, que as protegem de viroses, 
degradando o DNA viral. Cada nuclease bacteriana reconhece uma sequencia especifica de 4 a 8 
nucleotídeos. Essas sequencias que também ocorrem no genoma da própria bactéria são protegidas por 
metilacao nos nucleotídeos A ou C, já as sequencias de DNA estranho não são metiladas e assim são 
clivadas pelas nucleases de restrição. Hoje diversas nucleases obtidas de diferentes espécies de bactérias 
foram isoladas e são comercializadas. 
Algumas nucleases de restrição produzem clivagens assimétricas que deixam pequenas caudas de fita 
simples nas duas extremidades de cada fragmento, esse tipo de extremidade é conhecido como 
extremidade coesiva, uma vez que cada cauda pode formar pares de bases complementares com a cauda 
de qualquer outra extremidade produzida pela mesma enzima. Essas extremidades permitem que 
quaisquer dois fragmentos de DNA possam ser unidas desde que os fragmentos tenham sido gerados pela 
mesma nucleasse de restrição (ou por outra nucleasse que produza as mesmas extremidades coesivas). As 
moléculas de DNA produzidas pela união de dois ou mais fragmentos de DNA são chamadas de 
moléculas de DNA recombinante. 
 
 
 
 
 
 
Eletroforese em Gel 
O procedimento de eletroforese para DNA é mais simples que para proteínas, uma vez que cada 
nucleotídeo em uma molécula de ácido nucleico já carrega uma única carga negativa (no grupo fosfato), 
não há necessidade de adicionar o detergente SDS carregado negativamente, necessário para fazer com 
que as moléculas de proteínas movam-se uniformemente na direção do eletrodo positivo. O suporte 
utilizada na eletroforese varia de acordo com os propósitos de separação e os tamanhos dos fragmentos. 
Uma variação da eletroforese em gel de agarose, chamada de eletroforese em gel de campo pulsado, torna 
possível separar até mesmo moléculas de DNA muito longas, pois estas na eletroforese comum tendem a 
falhar, devido a movimentos sinuosos durante a migração. Já na eletroforese em gel de campo pulsado, a 
direção do campo elétrico se modifica periodicamente, o que força a molécula a se reorientar antes de 
continuar a se mover sinuosamenteno gel, nesta eletroforese as moléculas mais longas se movem mais 
lentamente do que as mais curtas. 
As bandas de DNA em géis de agarose ou poliacrilamida são invisíveis a menos que o DNA seja marcado 
ou corado de alguma forma. Um método sensível para corar DNA é expô-lo ao corante brometo de etídeo, 
que fluoresce sob luz ultravioleta quando está ligado ao DNA. 
As moléculas de DNA podem ser marcadas especificamente in vitro com radioisótopos ou com 
marcadores químicos que podem ser detectados quimicamente ou por fluorescência. No primeiro 
métodos, uma DNA-polimerase copia o DNA na presença de nucleotídeos que são radioativos, no 
segundo são utilizados precursores de nucleotídeos especialmente modificados. Dessa maneira as sondas 
de DNA contendo vários nucleotídeos marcados podem ser produzidas para reações de hibridização de 
ácidos nucleicos. 
Hibridização de DNA 
Quando uma solução aquosa de DNA é aquecida até 100ºC ou exposta a um pH muito alto (maior que 
13), a complementaridade de bases, que normalmente mantém as duas fitas da dupla-helice unidas, é 
rompida, e a dupla-hélice rapidamente se dissocia em duas fitas simples. Esse processo é chamado de 
desnaturação de DNA. Em 1961 descobriu-se que fitas simples complementares de DNA prontamente se 
reconstituem em duplas-hélices, num processo chamado de hibridização ou renaturação do DNA, se 
fossem mantidas por um período prolongado a 65ºC. Podem ocorrer reações similares de hibridização 
entre qualquer fita simples de ácidos nucleicos (DNA/DNA, RNA/RNA ou RNA/DNA), desde que 
tenham sequencias de nucleotídeos complementares. Essas reações de hibridização específicas são 
amplamente utilizadas para detectar e caracterizar sequencia de nucleotídeos especificas tanto nas 
moléculas de RNA quanto de DNA. 
As moléculas de DNA de fita simples utilizadas para detectar sequencias complementares são conhecidas 
como sondas. As reações de hibridização utilizando sondas de DNA são tão sensíveis e seletivas que 
podem detectar sequencias complementares presentes a uma concentração tão baixa quanto uma molécula 
por célula, assim é possível determinar quantas copias de qualquer sequencia de DNA estão presentes em 
uma determinada amostra de DNA. A mesma técnica pode ser utilizada para procurar genes relacionados, 
mas não idênticos. Para encontrar o gene de interesse em um organismo cujo genoma ainda não foi 
sequenciado, por exemplo, uma porção de um gene conhecido pode ser utilizada como sonda. 
 
Tainá
Highlight
Alternativamente, as sondas de DNA podem ser utilizadas para as reações de hibridização com RNA, em 
vez de DNA, para saber se uma célula esta expressando um dado gene. Nesse caso uma sonda de DNA, 
que contem parte da sequencia do gene é hibridizada com RNA purificado da célula em questão para 
determinar se o RNA inclui sequencias nucleotídicas complementares à sonda de dNA e, caso isso ocorra, 
em quais quantidades. Em procedimentos mais elaborados, a sonda de DNA é tratada com nucleases 
especificas depois da hibridização, para determinar as regiões exatas da sonda de DNA que se parearam 
com as moléculas de RNA. Desse modo, pode-se determinar os sítios de inicio e de termino da 
transcrição de RNA, assim como as ligações precisas das sequencias de íntrons e de éxons em um gene. 
 
Atualmente as posições das ligações de íntrons/éxons normalmente são determinadas pelo 
sequenciamento das sequencias de DNA complementar (DNAc) que representam os mRNAs expressos 
em uma célula e pela comparação delas com a sequencia de nucleotídeos do genoma. 
Clonagem de DNA 
Os genes podem ser clonados usando-se bibliotecas de DNA. Qualquer fragmento de DNA pode ser 
clonado. O termo clonagem de DNA é utilizado em dois sentidos. Em um dos sentidos ele literalmente se 
refere ao ato de produzir varias copias idênticas de uma molécula de DNA – a amplificação de uma 
determinada sequencia de DNA. Entretanto o termo também descreve o isolamento de uma determinada 
fita de DNA (frequentemente um gene em particular) a partir do resto do DNA da célula, pois esse 
isolamento é muito facilitado fazendo-se varias copias idênticas do DNA de interesse. A clonagem de 
DNA no seu sentido mais geral pode se realizada de varias maneiras. A mais simples envolve a inserção 
de um fragmento de DNA particular no DNA genômico purificado de um elemento genético que se 
autorreplica – geralmente um vírus ou plasmídeo. 
Um fragmento de DNA contendo um gene humano, por exemplo, pode ser ligado em um tubo de ensaio, 
a um cromossomo de vírus bacteriano, e a nova molécula de DNA recombinante pode então ser 
introduzida em uma célula bacteriana onde o fragmento de DNA inserido será replicado junto com o 
DNA do vírus. Partindo apenas de uma dessas moléculas de DNA recombinante, que infecta uma única 
célula, o mecanismo normal de replicação do vírus pode produzir mais de 1012 moléculas de DNA viral 
em menos de um dia, amplificando também a quantidade do fragmento de DNA humano inserido pelo 
mesmo fator. Um vírus ou plasmídeo assim utilizado é conhecido como vetor de clonagem, e o DNA 
propagado pela inserção nele é considerado clonado. 
Para isolar um gene específico, inicia-se construindo uma biblioteca de DNA – uma coleção abrangente 
de fragmentos clonados de DNA a partir de uma célula, um tecido ou um organismo. Essa biblioteca 
inclui no mínimo um fragmento que contenha o gene de interesse. Atualmente, a maioria das clonagens é 
realizada em vetores plasmidiais, estes são pequenas moléculas circulares de DNA fita dupla derivadas de 
plasmídeos maiores, que ocorrem naturalmente em células bacterianas. Para serem utilizados como 
vetores de clonagem, os círculos de DNA plasmidial purificados são primeiro clivados com uma 
nucleasse de restrição para criar moléculas de DNA linear. O DNA genômico a ser utilizado na 
construção da biblioteca é clivado com a mesma nuclease de restrição, e os fragmentos de restrição 
resultantes (incluindo aqueles contendo o gene a ser clonado) são então adicionados aos plasmídeos 
clivados e anelados por meio das suas extremidades coesivas para formar círculos de DNA recombinante. 
Essas moléculas de DNA recombinante, contendo insertos de DNA estranho, são então covalentemente 
ligadas à enzima DNA-ligase. 
 
Na próxima etapa da preparação de uma biblioteca, os círculos de DNA recombinante são introduzidos 
em células bacterianas que foram preparadas para ser transitoriamente permeáveis ao DNA. Essas células 
bacterianas são transfectadas com os plasmídeos. A medida que essas células crescem e se dividem, 
duplicando em números a cada 30 minutos, os plasmídeos recombinantes também replicam para produzir 
um numero enorme de copias de círculos de DNA contendo o DNA estranho . 
Tainá
Highlight
Vários plasmídeos bacterianos carregam genes para resistência a antibióticos, um propriedade que pode 
ser explorada para selecionar aquelas células que foram transfectadas com sucesso; se a bactéria crescida 
na presença do antibiótico, apenas as células contendo plasmídeos sobreviverão. Cada célula bacteriana 
original que foi inicialmente transfectadas contém, em geral um inserto de DNA estranho diferente; esse 
inserto é herdado por todas as progênies de células daquela bactéria que, juntas, formam uma pequena 
colônia em uma placa de cultura. 
Os fragmentos de DNA maiores são mais difíceis de manipular e clonar. Então, os pesquisadores 
começaram a utilizar cromossomos artificiais de leveduras (YAC, yeast artificial chromosomes), que 
podem acomodar pedaços muito grandes de DNA. Diferentemente de plasmídeos bacterianos menores, o 
plasmídeo F – e seu derivado, o cromossomo artificial de bactéria (BAC, bacterial artificial 
choromosome) – está presente em apenas uma ouduas copias por células de E coli. O fato de que os 
BACs são mantidos em números muito baixos nas células bacterianas pode contribuir para sua habilidade 
de manter estáveis grandes sequencias de DNA clonadas: com apenas alguns BACs presentes, é menos 
provável que os fragmentos de DNA clonados se misturem pela recombinação com sequencias presentes 
em outras copias do plasmídeo. Por sua estabilidade, habilidade de aceitar grandes insertos de DNA e por 
serem facilmente manipulados, os BACs são agora os vetores preferidos para construir bibliotecas de 
DNA de organismos complexos – incluindo aqueles representando o genoma humano e o de 
camundongo. 
Limitações Dos Plasmídeos Como Vetores De Clonagem: 
Tamanho: limita o tamanho do fragmento de DNA a ser clonado; 
Sítios de restrição: baixo número de sítios de restrições limitando o uso de diferentes enzimas de restrição 
para produção de insertos; 
Poucos marcadores genéticos para seleção: ex: R a antibióticos, metabolismos específicos, etc. 
Bibliotecas de DNA 
Clivar todo o genoma de uma célula com uma nucleasse de restrição específica e clonar cada fragmento 
como descrito produz um grande numero de fragmentos de DNA. Os fragmentos são distribuídos entre 
milhões de colônias diferentes de células bacterianas transfectadas. Quando trabalhamos com BACs em 
vez de plasmídeos típicos, podem ser inseridos fragmentos maiores, e assim menos células bacterianas 
transfectadas são necessárias para cobrir o genoma. Em ambos os casos, cada uma das colônias é 
composta de um clone de células derivadas de uma única célula ancestral e dessa maneira guarda varias 
copias de uma sequencia em particular do genoma fragmentado. 
 
Tal plasmídeo contem um clone de DNA genômico, e a coleção inteira de plasmídeos é chamada de 
biblioteca de DNA genômico. Contudo como o DNA genômico é cortado em vários fragmentos 
aleatoriamente, somente alguns fragmentos contem genes, vários dos clones de DNA genômico obtidos 
de uma célula eucariótica superior contem apenas DNA não-codificante, que é a maior parte do DNA em 
tais genomas. 
Uma estratégia alternativa é começar o processo de clonagem selecionando-se apenas aquelas sequencias 
de DNA que são transcritas em mRNA e, assim, é presumível que correspondam a genes que codificam 
para proteínas. Isso é feito extraindo-se o mRNA de células e então fazendo-se uma copia de DNA de 
cada molécula de mRNA presente – cDNA (DNA complementar). Essa reação de copia é catalisada pela 
transcriptase reversa de retrovírus, que sintetiza uma cadeia de DNA complementar a partir de um molde 
de RNA. As moléculas de cDNA de fita simples sintetizadas pela transcriptase reversa são convertidas 
em moléculas de cDNA fita dupla pela DNA-polimerase, sendo inserida em um vetor plasmidial ou vetor 
viral e clonadas. 
 
Cada clone obtido dessa maneira é chamado de clone de cDNA, e a coleção inteira de clones derivados de 
uma preparação de mRNA constitui uma biblioteca de cDNA. 
Existem algumas diferenças importantes entre os clones de DNA genômico e de cDNA. Os clones 
genômicos representam uma amostra aleatória de todas as sequencias de DNA em um organismo e, com 
raras exceções, serão os mesmos, independente do tipo de célula utilizada para prepara-los. Em contraste 
os clones de cDNA contém apenas aquelas regiões do genoma que foram transcritas em mRNA. Como as 
células de diferentes tecidos produzem conjuntos distintos de moléculas de mRNA, uma biblioteca 
distinta de cDNA é obtida para cada tipo de célula utilizado para preparar a biblioteca. 
Vantagens dos Clones de cDNA 
Uma das vantagens do uso desses clones é a que algumas células especializadas podem produzir grandes 
quantidades de algumas proteínas A vantagem mais importante dos clones de cDNA é que eles contem 
sequencias codificantes não-interrompidas isto permite a dedução da sequencia de aminoácidos de uma 
proteínas a partir da sequencia de DNA ou mesmo a produção de proteínas em grandes quantidades. 
 
 
Tainá
Highlight
Tainá
Highlight
Tainá
Highlight
Tainá
Highlight
Tainá
Highlight
Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) 
Agora que tantas sequencias genômicas estão disponíveis, os genes podem ser clonados sem a 
necessidade de primeiro construir bibliotecas de DNA, a técnica de PCR possibilita essa clonagem rápida. 
Começando com um genoma inteiro, a PCR permite que o DNA de uma região selecionada seja 
amplificado vários bilhões de vezes, purificando efetivamente esse DNA do restante do genoma. 
Para começar um par de ligonucleotideos de DNA (Iniciadores ou primers) escolhidos para se ligar a 
sequencia de nucleotídeos deseja do gene, é sintetizado por métodos químicos. Esses iniciadores são 
então utilizados para iniciar a síntese de DNA nas fitas simples geradas pelo aquecimento do DNA do 
genoma inteiro. O DNA novo sintetizado é produzido em uma reação catalisada in vitro por uma DNA-
polimerase (TAQ polimerase) purificada, e os iniciadores permanecem nas extremidades 5’ dos 
fragmentos finais de DNA que são produzidos. 
A eficácia da PCR é revelada apenas depois de repetidos ciclos de sintese de DNA, cada ciclo duplica a 
quantidade de DNA sintetizada no ciclo anterior. Com cada ciclo da síntese de DNA, os fragmentos 
novos gerados servem como molde na sua vez, e dentro de poucos ciclos o produto predominante é uma 
espécie única de fragmentos de DNA, cujo o comprimento corresponde a distancia entre os dois 
iniciadores originais. 
 
 
 
A PCR portanto torna possível a” clonagem molecular livre de células” de um fragmento de DNA em 
poucas horas em comparação com os vários dias necessários para os procedimentos normais de clonagem. 
O método de PCR é extremamente sensível, pode detectar uma única molécula de DNA em uma amostra. 
Os traços de RNA podem ser analisados da mesma maneira, sendo transcritos prirmeiro em DNA pela 
transcriptase reversa. A PCR ainda é muito usada para diagnostico de doenças genéticas, detecacao de 
baixos níveis de infecção viral e medicina forense. 
Resumo das Clonagem e Amplificação por PCR 
 
 
 
Produção de Proteínas Específicas 
Grandes quantidades de uma proteína desejada são produzidas em células vivas utilizando vetores de 
expressão que em geral são plasmídeos projetados para produzir grandes quantidades de um mRNA 
estável que pode ser traduzido eficientemente em proteína em bactéria, levedura, inseto ou célula de 
mamífero transfectadas. Para prevenir que a grande quantidade da proteína estranha interfira com o 
crescimento da célula transfectadas o vetor de expressão muitas vezes é projetado para retardar a síntese 
do mRNA estranho e da proteína até um pouco antes das células serem coletadas e rompidas. 
Como a proteína desejada é produzida a partir de um vetor de expressão dentro de uma célula, ela deve 
ser purificada das proteínas da célula hospedeira por cromatografia, após a lise das células. Existem 
vários vetores de expressão projetados para adicionar um marcador molecular (como um grupo de 
resíduos de histidina ou pequena proteína marcadora) à proteína expressa para permitir uma purificação 
fácil por cromatografia de afinidade. Uma variedade de vetores de expressão esta disponível, cada um 
modificado por engenharia genética para funcionar em um tipo de célula na qual a proteína devera ser 
produzida, dessa maneira as células podem ser induzidas a produzir vastas quantidades de proteínas uteis 
na medicina como hormônios, citocinas e antígenos virais para vacinas. 
 
Sequenciamento de DNA 
Métodos que permitem que uma sequencia de nucleotídeos de qualquer fragmento de DNA seja 
determinada de forma simples e rápida tornaram possível determinar as sequencias de DNA de dezenas 
de milhares de genes ede vários genomas completos. O volume de informação da sequencia de DNA 
agora é tão grande que computadores potentes devem ser utilizados para armazená-lo e analisa-lo. Agora 
com o sequenciamento de DNA é possível determinar indiretamente as sequencias de aminoácidos da 
maioria das proteínas. 
EXPRESSÃO GÊNICA EM EUCARIOTOS 
Processamento do RNA 
A transcrição de DNA para RNA ocorre por meio da ação da RNA polimerase, contudo existem 
diferenças nesse processo quando comparamos organismos eucariotos e procariotos. Entre essas 
diferenças, podemos destacar que nos organismos eucariotos ocorre adição de 7-metilguanosina à 
extremidade 5’ do RNA, além disto existe uma sequência AAUAAA que determina uma região de 
clivagem que sofrerá ação da Endonuclease, podemos destacar também que ao final deste RNAm ocorre 
adição de uma cauda poliA; deste modo, toda porção terminal de RNAm de eucarioto é rica em Adenina. 
O RNAm de eucariotos é constituído de éxons e íntrons, sabemos que estes últimos devem ser 
retirados para que ocorra a tradução do RNAm à proteína. Estas regiões (íntrons) são iniciadas pela 
sequencia GU e terminam com uma sequencia AG, sendo comum se observar a presença de uma resíduo 
de Adenina na região central do íntron ( regra GU---A---AG). Este tipo de constituição do DNA ( éxons e 
íntrons) permite que ocorra um processo chamando de splicing alternativo, com isto temos um mesmo 
gene produzindo diferentes proteínas devido ao processo de eliminação dos íntrons e ligação dos éxons 
por meio das enzimas de recomposição. 
A maquinaria celular dos organismos eucariotos é bem mais sofisticada e complexa do que a 
maquinaria celular dos procariotos, desse modo ptns que necessitam de modificações pós-traducionais são 
produzidas em sistemas com células de eucariotos. 
As proteínas de eucariotos produzidas em bactérias são instáveis e na maioria das vezes inativas, 
em geral nas ptns obtidas por meio de procariotos há a possibilidade da existência de pirogênio e resíduos 
tóxicos mesmo após a etapa de purificação da ptn; estes fatores somados a necessidade de modificações 
pós-traducionais de algumas ptns e a necessidade de as ptns médicas serem idênticas as ptns naturais 
podem ser entendidos como vantagens para o uso de organismos eucariotos. Porém o que de fato 
determina o tipo celular utilizado é a complexidade da ptn a ser produzida. 
A escolha do sistema de expressão depende de: 1-qualidade da ptn que se deseja, 2- rendimento 
do produção, 3- custo de produção, 4- etapas de purificação. 
Vetores 
Quanto aos vetores empregados, esses são semelhantes aos vetores de procariotos, possuindo, no 
entanto, sinais transcriconais de eucariotos, sinais de parada da transcrição, sequências que permitem a 
adição da cada poliA do RNAm e um gene marcador que permita a seleção. 
Os vetores de eucariotos possuem um ori de E.coli, pois são produzidos e amplificados nesta 
bactéria, e somente após esta amplificação são transferidos às células de eucariotos. Os vetores possuem 
tbm ori de eucariotos, com a presença de um promotor que antecede este ori e que determina a expressão 
do gene introduzido. 
O esquema desenvolvido pode ser resumido nas seguintes etapas: 
◦ Introdução do gene de interesse no vetor, 
◦Introdução do vetor na bactéria (por eletroporação, por exemplo). 
◦Seleção da bactéria que incorporou o vetor, 
◦Multiplicação das bactérias selecionadas, 
◦ Destruição da parede da bactéria e isolamento do vetor, 
◦Introdução do vetor nas células eucariotas, 
◦Seleção das células de eucarioto que incorporam o vetor. 
O gene contido no vetor encontra-se fora do genoma das células, porém podemos utilizar 
técnicas que o tornem parte integrante do genoma da célula eucarioto. Nas células animais, a introdução 
do DNA ( chamada transformação) refere-se a troca nas propriedades de crescimento de tais células. 
A troca de características hereditárias das células devido a adição de DNA exógeno é chamada 
de transfecção, e pode se processar por métodos químicos e físicos. A eficiência da transfecção depende 
da linhagem celular, da quantidade e da qualidade dos plasmídeos, do sistema de entrega e do meio de 
produção usados. 
Os métodos físicos usados para transfecção são: 
I- Microinjeção (utiliza principalmente cels embrionárias e é mt trabalhoso). 
II- Eletroporação (forma poros através de pulsos elétricos e registra alta mortalidade das 
cels) 
III- Sonoporação (utiliza o ultrassom para tornar a membrana permeável ao DNA, 20% de 
eficiência) 
Os métodos químicos usados na transfecção são: 
I- DEAE-dextran (substrato policatiônico que necessita de sucessivas lavagens para ser 
retirado do meio, pouca eficiência) 
II- Precipitação com Fosfato de Calcio (necessita de ótima concentração de DNA e 
controle de pH, método de baixo custo) 
III- PEI-DNA 
Unidade celular 
 O Saccharomyces cerevisiae é unicelular, possui vários promotores fortes identificados, é capaz 
de fazer modificações pós-traducionais nas ptns, é bem conhecido quanto a sua fisiologia e genética,é 
capaz de secretar ptns, sendo portanto amplamente utilizado como organismo eucarioto de escolha. Além 
de ser considerado seguro pelo FDA, pois não possui pirogênio e não produz toxinas, sendo tolerada a sua 
ingestão, este possui, ainda, habilidade de produzir etanol e CO2.Diversas ptns são produzidas em 
Saccharomyces, entre elas: Pró-Insulina, Insulinas, fator VIIIa, fator de crescimento humano, hirudina, 
ptns da malária, entre outras. 
Outros organismos também podem ser empregados, como Pichia pastoris e Hansenula polymorpha. 
Modificação do Saccharomyces 
Como vetores podem ser utilizados plasmídeos ou episomal, contendo promotores fortes e 
regulados, e fatores de terminação. No trabalho com estes organismos, a dificuldade está na manutenção 
do plasmídeo em biorreatores de mais de 10 litros; como solução para este inconveniente podemos tornar 
o Saccharomyces um organismo geneticamente modificado (fazendo a introdução do gene de interesse 
diretamente ao genoma celular do eucarioto), 
Para isto, usa-se enzimas de restrição que reconheçam um fragmento genômico do cromossomo 
do Saccharomyces que seja igual a um fragmento do vetor (gene de interesse deve estar dentro deste 
fragmento), para que haja possibilidade de ocorrer crossing over. 
Sabemos por exemplo, que o Saccharomyces não possui gene para Leucina, logo podemos 
introduzir este gene no genoma do organismo e selecionar somente os organismo que, a partir de tal 
introdução, sejam capazes de produzir esta ptn. 
Pode-se tbm, fazer um segundo cromossomo (estrutura parecida com vetor, porém neste caso 
seria cromossomo) para sofrer a dupla troca( crossing over) com o genoma do Saccharomyces. 
Como exemplo de ptn obtida pela manipulação gênica do Saccharomyces podemos citar a 
Superoxido desmutase, cDNA humano clonado sobre comando de regiões promotoras e terminadora em 
Saccharomyces. 
Neste tipo organismo, as ptns passam por uma sofisticada via de secreção, sofrendo 
modificações no Aparelho de Golgi antes de serem direcionadas para iniciarem sua ação intra ou 
extracelular. 
Entretanto, alguns casos necessitam de outros organismos para que tenha sucesso na produção da 
ptn, como o caso de ptns que precisam de uma hiperglicosilação para serem ativas. 
Célula de inseto 
Células de fácil cultivo, e pode-se utilizar o Baculovirus (visto que este infecta somente insetos). 
Para síntese das ptns de interesse aproveitamos o ciclo de replicação do vírus, pois é composto por duas 
etapas: 1-produção de novas partículas que podem infectar outras células no intestino do inseto; 2-virion é 
aprisionado em uma matriz proteica de polihedrina. 
Para nos utilizarmos do ciclode replicação do vírus, substituímos o gene de produção da matriz 
proteica pela proteína de interesse, e contamos ainda com a vantagem de que nestas células o 
processamento pós-traducional das ptns é parecido com o que ocorre em mamíferos. 
O vetor utilizado neste caso também é baseado em E.coli, contudo é um vetor suicida( que não se 
multiplica e morre se ocorrer a divisão celular). 
Exemplos de ptns produzidas por meio da utilização destas cels: antígeno anthrax, eritropoetina, 
interferon, etc. 
Células de mamíferos 
Tipo celular de última escolha, somente empregado para ptns drasticamente modificadas após a tradução. 
Vetores utilizados possuem as mesmas características: promotores, terminadores, ori de E.coli, marcador, 
possui ainda regiões de íntrons. 
Para obtenção de melhores resultados o gene deve ser equipado com sequencias de controle da tradução( 
seq para secreção, seq para tag(purificação), sítios para retirada de tag, seq que melhorem a eficiência da 
tradução). 
Em casos de dois vetores introduzidos em uma única célula, pode haver a perda de um dos vetores ou a 
produção de ptns com intensidade desigual( números de cópias diferentes secretadas por cd vetor), isto 
pode ser corrigido ou solucionado introduzindo-se os dois genes de interesse através de um único vetor, e 
pode ainda ser otimizado ao se adicionar um sítio para entrada de um segundo ribossomo entre os genes 
de interesse. 
EXPRESSÃO GÊNICA EM PROCARIOTOS 
 Manipulação da Expressão Gênica em Procariotas: 
 Gene: Promotor; Operador; Códon indicador AUG; Stop Códon; Regiões 
terminadoras de tradução. 
 Transcrição do DNA em RNAm 
 Tradução do RNAm em PTN. 
 Alto Rendimento 
 Estáveis. 
 Fácil de purificar. 
 
 Características importantes dos promotores: São fortes, aqueles que apresentam 
alta afinidade para a RNA polimerase; São reguladores, aqueles que tem 
capacidade de controle da expressão genica por mecanismos que podem ser 
controlado. 
 Promotor Fago ƛ: Regulado por temperatura. 
 Promotor Fago T7: Regulado pela presença de T7 RNA polimerase. Este gene é 
inserido no cromossomo de E.coli sob o controle de promotor LAC – IPTG que 
ativa o promotor LAC. 
 
 Produção em Larga Escala: Para isso é necessário mudanças na temperatura e custo 
com energia; indutores químicos como IPTCG de alto custo; desenvolvimento de 
um novo sistema. 
 
 Como obter altos níveis de expressão de PTN heterólogas? : PTN’S heterólogas ; 
ocorrem em baixas concentrações e pode ser devido a degradação por enzimas 
proteolíticas da cél. Bacteriana; Construção de PTN de fusão (protege contra 
proteólise, direciona a compartimentos celulares desejados, facilita a purificação); 
Na maioria dos casos a porção da PTN de fusão deve ser retirada. 
 
 Fatores relacionados a tradução: Nos organismos procariotas várias PTN’S 
apresentam níveis de expressão diferenciados; A tradução eficiente e estabilidade 
da PTN recém sintetizadas podem afetar o rendimento; A base molecular desta 
característica deve-se em parte ao sinal de iniciação da tradução (sitio de ligação do 
RNAm ao RNAr); Distancia precisa no códon de iniciação (AUG); RNAm deve 
apresentar códons comuns aos RNAt do vetor; Sinais de terminação forte. 
 
 Vetores de Expressão pkk233-2: R ampicilina(seleção); Promotor tac; Sítio de 
ligação ao ribossomo lac Z; Terminadores de tradução T1 e T3 do fago ƛ ; ATG8 
nucleotídeos downstream do ribossomo. 
 
 Incompatibilidade Celular: Gene clonado usa códons raros como AGG, AGA, 
AUA, CUA, CGA. Isto pode ser solucionado através da mudança da célula de 
expressão, da modificação do gene e da modificação da célula para super-expressar 
RNAt. 
 
 Aumento da estabilidade da PTN: Meia vida de PTN (poucos minutos até horas); 
Depende do numero de pontes de dissulfeto e aminoácidos na porção N terminal; 
Região interna PEST – diminui a estabilidade (Regiões ricas em Prolina, Ácido 
Glutâmico, Serina, Treonina). 
 
 Arranjo da PTN: Vária PTN que são expressas em Ecoli, são acumuladas na forma 
de corpúsculos de inclusão biologicamente inativos, insolúveis e intracelulares; 
Alto custo de purificação e arranjo incorreto; Alternativa para isso (PTN de fusão 
que mantem a PTN solúvel). 
 
 Integração do DNA exógeno ao cromossomo bacteriano: Identifica um sitio de 
integração (Região do DNA bacteriano que pode ser modificado sem o prejuízo à 
bactéria) -> isolamento ou clonagem do sitio de integração -> ligar o inserto ao sítio 
de integração-> Transferência desta estrutura para a bactéria através de um vetor 
suicida -> selecionar e perpetuar as células bacterianas que apresentam o 
cromossomo modificado. 
 
 Aumento da secreção de PTN: O direcionamento de PTN para o espaço 
periplasmatico facilita e diminui o custo de purificação; Aumenta a estabilidade; 
Adição de peptídeo sinal é ligado a porção N-terminal da PTN. 
 
 Sobrecarga Metabólica: Numero alto de plasmídeos; insuficiência de O2 no meio; 
Superprodução de PTN; “Jam” dos sítios de exportação de PTN; PTN produzidas 
podem interferir no metabolismo das céls. 
PRODUÇÃO DE AGENTES TERAPEUTICOS 
 
SÍNTESE DE PRODUTOS COMERCIAIS