Sebenta de Biologia Celular e Molecular I (1)

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SEBENTA
BIOLOGIA CELULARE
MOLECULARI
BERNARDO MANUEL DE SOUSAPINTO
FACULDADE DE MEDICINA DA IINIVERSIDADE DO PORTO
Bernardo Manuel de Sousa Pinto
Faculdade de Medicina da Universidade do Porto
Sebenta de Biologia Celular e Molecular I
Índice
Metodologiadoestudodaé1u1a......... .....................3
Microscopia. ..............3
Isolamentoe cúturaçelular ....................7
DNAeDNA-bindingproteins...... ....................11
ReplicaçãodoDNA...... .....................15
Reparação e recombinação do DNA.. .............19
Transoição do DNA...... ...............24
Transcrição: Síntese do mRNA.... ...........24
Transcrição: SíntesedorRNAetRNA....... ....................29
Núcleo celulr........ .........32
Genoma humano e doenças associadas ao DNA...... ...............37
Técnicas de biologia molecular. ..........41
Sínteseedegradaçãodeproteínas. ................45
Controlo da opressão génica e especialização celular........ ..................51
Membranasbiológicas......... ............55
Transporte transmembranar .........58
Tradução elécEica de estímulos: Membrana neuronal ..........63
Modelosexperimentaisdecontrolodaexpressão gética........ .....................67
Citosqueleto. .............72
Actina........ ............72
Microüúbulos e filamentos intermediários................ ................78
AtlasdeMctoscopia........ .................82
Tipos de célúas...... .......82
Núclço......... .............91
Estão incluídos nesta sebenta, resumos das aulas de Biologia Celular e Molecular I da Façuldade de
Medicina da Universidade do Porto, bem como um atlas com as imagens de microscopia observadas.
Desdejá agradeço a quem me ajudou na elaboração da sebenta, através da correcção de eventuais erros
inicialmente presentes, ou através de ideias e sugestões.
Bom trabalho e votos de sucesso nos exames,
Bernardo M. Sousa Pinto
Bernardo Manuel de Sousa Pinto
Faculdade de Medicina da Universidade do Porto
Sebenta de Biologia Celular e Molecular I
Microscopia
O microscópio permite, não só, ampliar aquilo que vemos, mas também, ver mais pontos como pontos
distintos, pois permite uma resolução maior que uma simples lupa. Existem dois grandes tipos de
microscópio: O microscópio de luz, onde é possível ver até às celulas, e o microscópio electrónico, que
teoricamente daria para ver até aos átomos.
Limite de resolução
O limite de resolução de um microscópio é a distância mínima entre dois pontos de um objecto, em que
estes são passíveis de ser observados como pontos distintos, exprimindo-se em subunidades do metro.
o limite de resolução do microscópio óptico é calculado pela fórmula fn : li!1 11 , sendo 1, o valor do
n x send
comprimento de onda da luz uülizada e o produto expresso no denominador muitas vezes indicado pelo
fornecedor.
O limite de resolução mínimo do microscópio óptico, por causa da radiação é de 200 nm, ou seja, não se
conseguem observar estruturas que distam menos de 200 nm, que é a distância mais ou menos que
existe entre os organelos. O microscópio electrónico tem um limite de resolução teórico de 0,1 nm, mas
na prática, o limite de resolução é raramente menor que 1 nm.
Preparações para microscopia
Para elaborar preparações definitivas para microscópio óptico, em primeiro lugar, devemos parar os
processos metabólicos das células, matando-as e conservando a sua estrutura 
- 
fixação. De seguida,
corta-se o tecido endurecido (frequentemente em parafina) em fatias finas (entre 5 e 6 prm de
espessura), pois só assim podem ser atravessadas por um feixe de luz. Finalmente, coloca-se este no
suporte de vidro.
Como as células são incolores, nomeadamente as animais, absorvem/reflectem muito poucas radiações
visíveis, devendo-se por isso fazer colorações, utilizando-se corantes citológicos, básicos (ou acidófilos),
para corar estruturas ácidas, como o núcleo (devido à grande quantidade de ácidos nucleicos), ou
corontes citológicos ácídos (ou basófilos), para corar estruturas básicas (geralmente têm maior afinidade
com o citoplasma). Como as colorações podem induzir alterações morfológicas nas células, há por vezes
a necessidade de observar células vivas e não coradas. Para isto, utilizam-se frequentemente,
mlcroscópios dê contraste de fase.
Já em microscopia electrónica, os cortes têm de ser ultra-finos (80 a 100 nm), sendo estes colocados
numa grelha metálica e fixados numa cera muito dura.
Coloração de Gram
As células procarióticas não têm núcleo, nem organelos membranares individualizados. As bactérias são
indivíduos procariontes, que se classificam de acordo com o modo como coram, quando submetidas à
técnica de Gram. Sendo assim, as bactérias Gram-positivas coram a roxo e as bactérias Gram-negativas
coram a encarnado/magenta.
Estas diferenças em termos de coloração prendem-se com a presença ou ausência de peptidoglicano
nas paredes bacterianas. As Gram-posiüvas possuem uma grande quantidade de peptidoglicano que
funciona como uma "esponja muito grossa e permeável", enquanto as Gram-negaüvas possuem uma
quanüdade muito reduzida de pepüdoglicano.
Bernardo Manuel de Sousa Pinto
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Microscopia de contraste de fase
A microscopia de contraste de
fase permite acompanhar
culturas de células vivas, pois
neste método não é necessária
a coloração histológica das
células. As imagens são nos
dadas, pois, por um contraste,
que Íaz parecer que estas
apresentam relevo. lsto
acontece porque as radiações
que atravessam organelos mais
"densos" e "espessos", como o
núcleo sofrem
retardamento, enquanto as que
atravessam regiôes de menor
resistência, ficam em fase.
Dessa forma, essas diferenças
de fase de radiação, nos diferentes locais da célula, vão ser convertidas pelos microscópios de contraste
de fase, num contraste, onde estruturas mais "densas" são menos brilhante e as menos "densas" são
mais. Este método é útil para observar células individuais, ou finas camadas de células, mas não tecidos
espessos.
O contraste de interferência diferencial (ou contraste de interferência diferencial de Nomarski) é uma
variante da microscopia de contraste de fase, poig converte diferenças de fase também num contraste,
mas os objectos, nas imagens, parecem ter uma sombra, algo que resulta de uma diferença no índice de
refracção deste, relativamente ao meio. lsto é particularmente útil para a observação de objectos
espessos e pequenos detalhes.
Microscopia de fluorescência
Através de microscopia de fluorescência, é possível detectar os fluorocromos, moléculas fluorescentes.
Um composto diz-se fluorescente, caso absorva luz a um dado comprimento de onda de excitação e, por
consequência, emita luz, num maior comprimento de onda específico. São por isso detectadas duas
radiações 
- 
uma associada à excitação dos electrões e outra à emissão de energia por parte destes.
Por isso, neste tipo de microscopia uüliza-se um filtro que deixa passar apenas as radiaçôes que excitam
os fluorocromos. Graças a outro filtro, vemos também somente as radiações luminosas emitidas pelos
fluorocromos. O resto aparece a negro.
Dado existirem muito poucas moléculas naturalmente fluorescentes, somos forçados a recorrer a
técnicas de imunocitoquímica 
- 
utilizamos, pois, anticorpos com fluorocromos, pois os anticorpos são
muito específicos para determinados antigénios. Podemos classificar as técnicas de imunocitoquímica
em directas, se recorrerem somente a um anticorpo marcado para cada molécula, o que acontece
muito raramente; ou indirectas, se recorrerem a um anticorpo primário, ao qual se ligam vários
anticorpos secundários marcados (sendo que os dois anticorpos têm de ser produzidos em animais
diferentes 
-só assim os anticorpos secundários reconhecem o anticorpo primáriocomo um antigénio!).
Podem igualmente ser usadas enzimas com marcação fluorescente.
Bernardo Manuel de Sousa Pinto
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microscopia de fluorescência, que permite observar a interacção directa entre
próximas (nomeadamente reacções de transferência de energia), do seguinte
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Dado o contraste nas imagens de fluorescência ser tão grande, é possível ver estruturas menores que
200 nm, a menos que distem menos que 200 nm!
As imagens de microscopia de fluorescência podem apresentar um fundo (noise), algo que é superado
com recurso a radiação laser muito intensa, em microscópios mais sofisticados. A microscopia confocal
e de deconvolução permitem observações de estruturas tri-dimensionais sem aberrações de imagem. A
microscopia de Apo-Tome permite um aumento de nitidez nas imagens obüdas por microscopia de
fluorescência.
GFP 
- 
Green Fluorescent Protein
Esta proteína permite-nos ver, com recurso a técnicas de fluorescência, células vivas, ou proteínas (por
vezes criam-se proteínas híbridas, com um segmento de GFP, que não altera o funcionamento natural
destas e permite observar o seu "caminho natural").
FRET 
- 
Fôrster resonance energy transfer
Esta é uma técnica de
duas moléculas muito
modo:
Radiaçâo
yioleta
imuito energética) 4\ Radiação I\ azul /
>+Cromóforo A # Cromoforo ts #
FRAP 
- 
Fluorescence recovery after photobleaching
Esta técnica é útil para observação de cinética molecular, pois faz-se um branqueamento de todas as
moléculas fluorescentes numa área restrita e depois vai-se acompanhando as migrações moleculares, ou
seja, a sua "recuperação".
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permite a purificação de sedimentos, quer constituídos por diferentes organelos, quer constituídos
somente por núcleos. Um controlo adicional da pureza é feito, recorrendo ao microscópio electrónico.
Este processo pode ser utilizado para a obtenção de macromoléculas específicas isoladas. Neste caso, a
ultracentrifugação é realizada à conta de forças muito superiores e tempo muito longa, estando sempre
associada a umgradiente muito concentrado em soluto. As macromoléculas, "deslocam-se" ao longo do
gradiente até encontrarem uma zona, cuja densidade seja igual às suas, estabilizando aí. Todavia, esta
não é a técnica de excelência para a separação de moléculas como o DNA e o RNA.
Separação de proteínas:
SDS.PAGE
Para separar proteínas, recorremos à electroforese, um processo que permite separar moléculas com
carga eléctrica, quando se encontram em solução, através da aplicação de corrente eléctrica, estando a
migração das moléculas dependente da sua carga, forma e massa.
No DNA, a migração está apenas dependente da massa (associada ao número de pares de bases), visto
as moléculas de DNA terem carga negativa (devido à presença do anião fosfato) e forma similar, mas nas
proteínas tal não acontece. Neste grupo de moléculas verifica-se variedade na carga e forma, o que leva
a que tenhamos de realizar alguns processos, de modo a eliminar essas "variáveis" e a podermos
separar as proteínas somente pela sua massa.
Para eliminarmos a "variável carga", aplicamos SDS (dodecilsulfato de sódio), que confere carga
negativa a todas as proteínas (estas ficam todas com a mesma carga). lsto leva também, a que haja
repulsões entre as proteínas, algo que ajuda à sua desnaturação e linearização. Posteriormente, aplica-
se DTT 
- 
diüotreitol 
- 
e p-mercaptoetanol 
- 
agentes que quebram as pontes dissulfureto, contribuindo
para a perda de tridimensionalidade das proteínas.
Aplica-se uma carga eléctrica às proteínas, então em gel de poliacriloenil, que migram do cátodo (-), até
ao ânodo (+), sendo que quanto maiores, menor a sua mobilidade. Para visualizarmos as bandas
t:
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obtidas, estas são coradas com nitrato de prata e azul de Coomassie e comparar os valores obtidos com
valores-padrão.
Focagem lsoelectrónica
Esta é uma forma de electroforese, na qual as proteínas são separadas de acordo com o seu ponto
isoelectrónico 
- 
o valor do pH do meio, para o qual a proteína fica globalmente neutra. Sabe-se que ao
ser aplicada electroforese em proteínas neutras, estas não migram, por isso numa tina onde existe um
gradiente de pH, fornecemos corrente a proteínas carregadas, sendo que estas migram até ao local
onde é atingido o seu ponto isoelectrónico.
(
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the protain
ir **çatlve§y
ch*rged
Electroforese bidimensional
As proteínas são separadas com base nos seus pontos isoelectrónicos, por focagem isoelectrónica e
depois, por SDS-PAGE, pela sua massa molecular.
Western-blotti ng
O método de Western-blotting consiste na transferência das proteínas separadas por electroforese
bidimensional para uma membrana. Aplica-se coloração de Ponceau's e depois aplicam-se os anticorpos
marcados com enzimas ou fluorescência para identificar as proteínas de interesse (Ímunoblottíng).
§ Elecrr*phor*ris srrd tr*rsfsr
SDS-p*lyaerylamid* gel l'r4*rrr ll ra n e
Arrribody detoction § elrrcnrog*nic
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Separação e hibridação de ácidos nucleicos:
No DNA, a migração por electroforese é feita em gel de acrilamida e agarose e está apenas dependente
da massa (associada ao número de pares de bases), visto as moléculas de DNA terem carga negativa
(devido à presença do anião fosfato) e forma similar. Dadas as dimensões da molécula de DNA, por
vezes é necessário cindi-la, com recurso a enzimas de restrição. A visualização das bandas de DNA é
possível graças ao SYBR green (antigamente recorria-se ao brometo de etídio, contudo, este é
cancerígena).
É possível a hibridação de ácidos nucleicos, podendo-se obter cadeias de DNA/DNA, RNA/RNA e
DNA/RNA. Para isso, aumenta-se inicialmente a temperatura das moléculas "originais", o que leva à
quebra das pontes de hidrogénio e desnaturação destas. De seguida, obtêm-se moléculas híbridas,
graças à diminuição de temperatura.
Southern-blotti ng
O método de Southern-blotting é análogo ao de Western-blotting. Esta técnica é capaz de detectar um
fragmento de restrição específico, com uma enzima de restrição. Quando uma mistura de DNA
complexa é submetida a electroforese é notável a presença de vários fragmentos diferentes com
aproximadamente a mesma massa, não sendo detectável, cada um, como uma banda particular. Dessa
forma, o southern-blotting recorre à hibirdação para identificar um fragmento de DNA particular - os
fragmentos de restrição são transferidos para uma membrana, que é deixada a incubar em condições de
hibridação com uma sonda específica de DNA marcada radioactiva. Após se dar a hibridação dos dois
fragmentos, identificamos a sua localização, por autoradiografia.
Nothern-blotti ng
O método de Northern-blotting permite determinar a localização da expressão de um gene particular,
sendo análoga para RNA que é separadopor electroforese e induzido em hibirdação com uma sonda de
DNA marcada radioactivamente. Este método necessita da extracção de mRNA de uma célula ou
conjunto de células, dessa forma, para manter a informação posicional da célula, em estudos mais
precisos, é necessário realizar hibridização in situ.
L0
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DNA e DNA bindine proteins
Molécula de DNA
A molécula de DNA apresenta como unidades básicas os nucleotídeos, compostos por uma base
azotada, uma desoxirribose e um grupo fosfato. Ao conjunto da base azotada, mais a dexosirribose dá-
se o noÍne de nucleosídeo. Quanto às bases, existem as pirimídicas, que são a timina e a citosina e que
apenas apresentam um anel azotado, e as púricas, que apresentam dois anéis azotados, sendo por isso
aadeninaeaguanina.
O grupo fosfato estabelece duas ligações éster com a desoxirribose, dizemos por isso que se
estabelecem ligações fosfodiéster na molécula de DNA. Uma das ligações é estabelecida no 5e carbono
da desoxirribose, enquanto a outra é no 3e carbono de uma desoxirribose diferente. Dessa forma, a
sequência de nucleotídeos é sempre lida de 5' para 3'.
A cadeia de DNA é formada por dois polímeros lineares com tendência a formar uma dupla hélice,
estabelecendo-se pontes de hidrogénio entre as bases azotadas, de ambas as cadeias, que se dispõe
antiparalelamente. Relativamente ao emparelhamento de bases, podemos afirmar que estas formam
sempre pares de Watson e Crick, ou seja a adenina emparelha sempre com a timina, através de duas
pontes de hidrogenio e a guanina com a citosina, por 3 pontes de hidrogénio. De referir que na molécula
de DNA distinguimos dois "sulcos", um maior e outro menor, sendo que em cada volta, encontramos um
sr.rlco de cada. Já as pontes de hidrogénio estabelecem um "efeito velcro", pois são muito frágeis
individualmente, mas, no seu conjunto, constituem uma junção muito forte.
Relativamente aos üpos de DNA, quanto ao seu arranjo em dupla hélice, podemos considerar o BDNA, o
ZDNA e o ADNA. O BDNA corresPonde à
maior parte do DNA existente nas células.
Regista-se nele uma rotação para a direita
e existem 10,1 bases por volta completa
(que tem 3,6 nm). Já o ADNA apenas
existe em laboratório e em condiçôes de
desidratação extrema, sendo por isso,
semelhante à estrutura do BDNA, mas
mais compacto. Por último, o ZDNA
apresenta uma rotação para a esquerda e,
embora por vezes se encontre nas células,
não se sabe qual a sua função.
(b)A DNA
Desnaturação da molécula de DNA
A molécula de DNA é muito estável, todavia, a separação das duas cadeias é possível, através do
aumento de temperatura (dado a elevação térmica aumentar a cinética dos electrões). A esta separação
dá-se o nome de desnaturação do DNA, sendo este processo reversível. Valores extremos do pH
ta,mbém |evam à quebra das pontes de hidrogénio, isto porque as cadeias passam a repelir-se, quer pelo
facto das bases ficarem protonadas (em meio ácido), ou com carga negativa (em meio básico). Também
a diminuição da concentração de iões é um factor que contribui para a desnaturação da molécula de
DNA.
{a) B DNA {ci Z ãNA
LL
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75
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§oshl§'
strand*d
§,t*A
80 8§ 9S
Temperatur* {"C}
As quebras de ligações nas moléculas de DNA são
passíveis de ser monitorizadas, através da
espectrofotometria. De facto, as cadeias simples
absorvem uma quantidade muito maior de
radiação UV de comprimento de onda 260 nm. A
temperatura para a qual se dá um aumento
muito brusco da absorção de radiação de 260 nm
é designada por melting-point (também
designado por "temperature of melting", ou T,).
O melüng-point é mais elevado quando há mais
pares de bases guanina-citosina, do que quando
há mais pares de bases adenina-timina. lsto,
0.5 L
75
porque entre a guanina e a citosina estabelecem-se mais pontes de hidrogenio, que entre a adenina e a
ümina.
Disposição do DNA na célula
O DNA não se dispõe aleatoriamente no núcleo das células
em interfase 
- 
ocupa os chamados territórios
cromossómicos, locais restritos ocupados de forma
ordenada pelo DNA, entre os quais existe o espaço
intercromossomal. O DNA encontra-se então no núcleo
associado a proteínas, o que constitui a cromaüna. A
cromaüna pode se encontrar sob uma forma muito
condensada (heterocromaüna), ou pouco condensada
(eucromatina), estando essa última forma, geralmente
associada à transcrição activa.
Quando se encontra em solução hipotónica, o DNA
apresenta-se na forma de fibras de cromaüna de 10 nm de
diâmetro, assemelhando-se a um colar de contas, sendo que cada conta é um nucleossoma 
- 
a unidade
básica de compactação de DNA nas células, constituído por 747 pares de bases ligados a um octâmero
(constituído por um conjunto de oito histonas, de quatro üpos diferentes).
As histonas apresentam resíduos de aminoácidos carregadas positivamente, sendo que após a tradução
destas é possível, que estas sofram alterações (código das histonas), que determinarão a sua função e
compactação. Uma histona importante e a Hl, por permitir a formação de fibras de cromatina de 30 nm
de diâmetro, estas fibras iniciam a sua formação pela orlentação de duas colunas de DNA para esquerda
e enroladas sobre si próprias, originando depois, no seu conjunto, uma dupla hélice com orientação
para a esquerda.
De entre as histonas e igualmente de destacar a acção da HP1, ao permitir uma maior condensação do
DNA, levando à génese de mais heterocromatina. Essa maior condensação está pois associada a
trimetilações, enquanto as acetilações estão sobretudo associadas a um impedimento da condensação
da cromaüna.
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Replicação de DNA
A replicação de DNA é o processo pelo qual se formam 2 moléculas de DNA exactamente, iguais à quais
lhe deu origem e entre si. É um processo semi-conservatvo feito por complementaridade de bases, algo
que foi comprovado numa experiência que utilizou isótopos de azoto num gradiente de Césio.
DNA Polimerase
A DNA Polimerase é a principal enzima a catalisar o processo de replicação DNA. Existem vários tipos de
DNA polimerase 
- 
nos procariotas, podemos referir as DNA Polimerases l, ll e lll (a DNA Polimerase lll é
a principal, adicionando nucleotídeos e tendo capacidade de proof-reoding, as restantes, sobretudo a ll
intervêm somente no processo de reparação do DNA), enquanto nos eucariotas, são de salientar a DNA
polimerase c (também designada por DNA primase), a DNA polimerase p (que actua nos processos de
reparação de DNA) e as DNA polimerases ô/e (com capacidade de adlção de nucleotídeos e de proof-
reading. A DNA polimerase ô actua ao nível da cadeia leoding, enquanto a € actua ao nível da cadeia
loggingl. A DNA Polimerase 6/e é a enzima mais importante nas células eucarióticas, criando ligações
difosfoester, de 5' para 3', quando as bases já estão emparelhadas, entre a molécula de DNA e um
desoxirribonucleosídeo trifosfato (levando à libertação de dois fosfatos). Esta enzima é similar a uma
mão fechada, com "dedos", "polegar" e "palma",
Esta enzima é incapaz de adicionar os desoxirribonucleotídeos a uma cadeia simples. Tem que existir,
por isso, na cadeia de DNA, um pouco de ligação dupla. lsto é algo que não acontece com a enzima DNA
primase.
Cadeia condutora (leading) e cadeia rápida (lagging)
Em microscopia electrónica é possível observar a replicação de DNA. As moléculas de DNA circular vão
sendo abertas, havendo crescimento bidireccional das cadeias, com formação das forquilhas de
replicação. A forquilha de replicação é a estruturacom forma de diapasão que se forma, aquando da
replicação do DNA. Nela distinguimos duas cadeias, a cadeia condutora, ou leading, e a cadeia lenta ou
lagging. A cadeia condutora é aquela onde o DNA é sintetizado de modo contínuo. A sua orientação 5'
para 3' é de acordo com a direcção de síntese de DNA pela DNA polimerase. Por outro lado, na cadeia
lenta o DNA é sintetizado de modo descontínuo, alternando os fragmentos de Okazaki com primers de
RNA.
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Os fragmentos de Okazaki são as sequências de DNA, que se vão formando nas cadeias lentas e têm
cerca de 100-200 nucleotídeos nos eucariotas e 1000 a 2000 nos procariotas. Os primers de RNA são
pequenas regiões de ribonucleotídeos, com 3 a 10 nucleotídeos, acrescentados pela DNA primase (DNA
polimerase a), de forma a ser possível a síntese de DNA na cadeia lenta. Na cadeia leoding também é
necessário um primer, para que se possa iniciar a replicação, dado que a DNA polimerase não pode
acrescentar nucleotídeos de novo.
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A remoção dos primers é feita por acção da RNase H. Dado a presença de ribonucleotídeos nas cadeias
de DNA ser facilmente detectada nas células como algo anómalo e aberrante, estes são fácil e
rapidamente removidos. Os espaços livres são então preenchidos por desoxirribonucleotídeos
colocados pela DNA polimerase. A enzima DNA ligase, por seu turno, à conta de ATP, estabelece a
última ligação fosfodiéster.
Proteínas acessórias da DNA polimerase
A DNA helicase é essencial ao processo de replicação do DNA, pois permite a abertura da dupla hélice e,
por outro lado, o desenrolamento das cadeias simples, aquando da formação de uma nova cadeia dupla.
Esta proteína tem forma de anel, que progride, abrindo a cadeia de DNA.
Contudo, é necessário, que as cadeias simples, uma vez desenroladas, se mantenham simples. Esta é a
função da RPA 
- 
Replicotion Protein Á, que simultaneamente mantém as cadeias simples acessíveis à
deposição de novos nucleótidos.
Já a PCNA - Proliferaüng Cell Nuclear Anügen 
- 
é uma proteína com três subunidades que permite que a
DNA polimerase esteja mais tempo ligada à molécula de DNA e não se separe desta. lsto porque a DNA
polimerase, por si só, tem pouca afinidade com a molécula de DNA. Nos procariotas, a sua homóloga é a
sliding-clom p protein.
O RFC 
- 
Replicatíon Factor C - é um complexo que "trabalha em conjunto" com a DNA polimerase e que
se está constantemente a formar e a dissociar na cadeia lenta, visto dissociar-se do complexo que forma
com a DNA polimerase e com a PCNA e da própria molécula de DNA, quando se inicia a síntese de um
primer.
Nos procariontes, destaque ainda para a clamp-loading protein, que faz a hidrólise de ATP, permitindo
assim que ocorra a adição de desoxirribonucleotídeos.
l*;aling
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São igualmente necessários
mecanismos que evitem a
ocorrência de sobre-enrolamento
no DNA, função assegurada pelas
topoisomerases, que dão
pequenos cortes na molécula de
DNA, com esse intuito, e depois
restabelecem essas mesmas
ligações fosfodiéster, por elas
quebradas. Existem duas classes
de topoisomerases a
topoisomerase I quebra a cadeia
simples de DNA e está muito
próxima da forquilha de abertura
e a topoisomerase ll quebra a
cadeia dupla, assumindo um
papel fundamental para que
ocorra a separação dos
cromossomas e a "mudança de
lugar da cadeia de DNA".
Ao conjunto formado entre a DNA
helicase a DNA primase dá-se o
nome de primossoma.
llk§,*§"# Funci*nar*ent*
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Verificação da replicação pela DNA polimerase
Apenas um em cada 10e nucleotídeos é incorporado incorrectamente durante a replicação de DNA.
Embora, ao ser realizada a polimerização de nucleotídeos, um em cada LOs nucleotídeos seja
incorporado erroneamente, o mecanismo de exonucleotyüc proofreading, operado pela enzima DNA
polimerase, permite que apenas subsista um erro em cada 102 nucleotídeos e o processo de Strqnd
directed mismatched repoir,leva a que também apenas subsista um erro em cada 102 nucleotídeos. A
acção combinada destes três mecanismos leva então a que apenas "passe" um erro em cada 10e
nucleotídeos sintetizados.
O processo de proof-reoding da DNA polimerase é possível graças à actividade de exonuclease desta
enzima. Este processo é possível de 3' para 5', sendo que a DNA polimerase reconhece os nucleotídeos
mal-emparelhados, pois esses não formam uma cadeia dupla correcta. A enzima em questão remove o
nucleotídeo errado e adiciona o correcto. Se a polimerização de nucleotídeos ocorresse, eventualmente,
de 3' para 5'nalguma das cadeias, ao se operar o processo de proof-reading, quando fosse detectado
um nucleotídeo errado e, posteriormente, removido, a cadeia ficaria incompleta e não poderia crescer
mais.
Origern e velocidade da replicação
Em E. coli, as origens de replicação são regiões do DNA ricas em pares A-T, que têm ligações mais fracas
(porapenas duas pontes de hidrogénio).
Nas células eucarióticas, a velocidade de replicação é L0 vezes mais lenta que nas procarióticas, devido à
presença de nucleossomas. Por isso, o genoma das células eucarióticas têm obrigatoriamente várias '
origens de replicação, muito diferentes entre si às quais se ligam ORC 
- 
Origin Recogniüon Complex 
-
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proteínas com 6 subunidades cuja função é a de reconhecer as regiões de origem de replicação, ciciinas
e DNA-helicases. A um conjunto formado por entre 20 a 80 origens de replicação, dá-se o nome de
unidade de replicação.
É importante referir que o DNA não replica todo simultaneamente nas células eucarióticas, replicando
primeiro a cromatina menos condensada (eucromatina), contudo, todo o genoma é replicado.
Formação dos nucleossomas
Os tetrâmeros de histonas H3 e H4 nunca se separam durante a replicação, contrariamente às H2A e
H2B. A síntese dessas histonas é então feita imediatamente após a replicação de DNA. Como as
moléculas recém-formadas de DNA possuem então já histonas, as que se formam de novo, podem ser
depois modificadas de acordo com as que já estão ligadas ao DNA.
Replicação dos telómeros
A enzima telomerase assegura a replicação do DNA no telómero - extremidade cromossómica, que
apresenta no ser humano a sequência repetitiva GGGATT, pois este não é sintetizado na cadeia lenta,
pois, como é uma extremidade, seria aí impossível para a DNA polimerase slntetizar nucleotídeos.
Contudo, a maioria das células somáticas não exprimem a enzima telomerase, contrariamente às células
tumorais e embrionárias. Dessa forma, vão ficando com as extremidades cromossómicas cada vez mais
curtas, até ao ponto dos cromossomas se fundirem. Essa perda cromossómica leva à morte celular,
estando assim explicado, o motivo pelo qual ascélulas somáticas normais apenas têm capacidade de
efectuar 40 replicações.
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18
Bernardo Manuel de Sousa Pinto
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Sebenta de Biologia Celular e Molecular I
DNA: Reparacão e Recombinacão
Danos no DNA
Cada célula humana sofre em média, por dia 104 a 106 eventos, físicos ou químicos, conducentes a
danos do DNA e, dessa forma, é essencial para a célula possuir mecanismos de reparação do DNA. A
célula não pode evitar que se dêem estes danos, visto que muitos são originados por produtos das
reacções metabólicas celulares, sendo a sua ocorrência normal.
De entre os danos que se registam no DNA, salientamos as reacções de hidrólise, de entre as quais,
despurinações 
- 
reacções de hidrólise, em que as bases púricas deixam de o ser 
- 
e as desaminações 
-
remoção de um grupo amina nas bases citosina, adenina e guanina. Também os danos oxidaüvos, onde
há perda de ligações oxidativas contribuem para lesões no DNA, bem como as alquilações, de onde se
salientam as metilações, onde grupos metilo se ligam a átomos de azoto.
Contudo, não são apenas agentes endógenos que contribuem para as lesões do DNA. A exposição a
certos agentes exógenos, como as radiações UV, que levam à formação de dímeros de timina ou
citosina, ou alguns produtos químicos, que levam por exemplo a metilações e etílações, propicia à
ocorrência de danos na molécula de DNA.
Cada cadeia de DNA apresenta uma cópia (um bockup), devido ao facto de se encontrar ligada a uma
cadeia cor.n bases complementares. lsto faz com que a molécula de DNA seja a molécula ideal para
armazenamento de informação genética. A presença de apenas quatro nucleotídeos diferentes facilita
igualmente, a reparação de erros.
Reparação directa do DNA
Existem mecanismos de reparação directa do DNA,
nomeadamente a reversão directa (direct reverse) de um dímero
de tiÍnina, formado aquando da exposição a radiação UV e que é
possível em bactérias e algumas células eucarióticas, sendo
levada a cabo por uma enzima. Algumas enzimas das células
humanas têm também a capacidade de cortar um grupo metilo
indeyidamente ligado a um nucleotídeo.
Reparação por remoção e substituição de bases ou
de nucleotídeos
O processo de bqse-excision-repair (reparação por excisão de
uma base) é útil para quando ocorrem desaminações, um tipo de
mutação muito frequente. Dessa forma, quando devido a este
tipo de mutações, se geram nucleotídeos errados, a enzima DNA-
gNicosilase quebra as ligações entre a base nucleotídica e a
desoxirribose, deixando o local apuriníco, ou apirimídico 
- 
temos
então um AP-site. Os AP-sites também se podem formar por
perda espontânea de uma base.
De seguida, a AP endonuclease corta a ligação fosfodiéster entre
dois nucleotídeos, no AP-site e a desoxirribosefosfodiesterase,
uma exonuclease, remove o que restava daquele nucleotídeo
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19
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Sebenta de Biologia Celular e Molecular I
TIRF - Total internal reflection fluorescence microscope
Permite excitar os electrões que estão mais à superfície na lâmina, permitindo ver só moléculas
individuais específicas.
Microscopia electrónica de transmissão
Este típo de microscopia
electrónica utíliza um feixe de
electrôes, emitidos por um
filamento de tungsténio, após ter
sido criada uma grande diferença
de potencial, o que mata células
eventualmente vivas. Como as
células são muito permeáveis à
passagem de electrões e os
metais pesados não, cria-se uma
fixação à base de elementos
densos, como o ósmio, ou o
acetato de uranilo...levando à
génese de um contraste.
Em microscopia electrónica
aplicam-se também técnicas de
imunocitoquímica,
nomeadamente
imunocitoquímica ultra-estrutural, onde, recorrendo a anücorpos marcados com metais pesados (p.e.
esferas de ouro), conseguimos detectar determinadas estruturas.
M icroscopia crioelectrónica
Consiste na congelação muito rápida de material biológico em azoto líquido, algo essencialmente útil
para a identificação de vírus. Pode preceder o processo de sombreamento metálico, algo que é
extremamente útil para revelar o interior de biomembranas.
Sombreamento metálico
Consiste na colocação de um metal pesado no material biológico, obtendo-se uma réplica da superfície
que se consegue ver a microscópio electrónico 
- 
à espécie de um molde.
Microscopia electrónica de varrimento
Quando observamos estruturas em microscopia electrónica de varrimento, fazemos incidir electrões em
ângulos diferentes, relativamente aos do microscópio electrónico de transmissão. Obtemos assim uma
iniagem da superfície do material biológico (que não é atravessado pelos electrões), embora o limite de
resolução neste tipo de microscópio seja menor.
§ Frlir
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Bernardo Manuel de Sousa Pinto
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De referir, que este processo avança ciclicamente,
até aparecer um "elemento de fronteira", que
impede o resto da proliferação da heterocromatina.
O processo da produção de heterocromatina pode
ser então descrito pelo esquema da direita.
De entre a heterocromatina, é igualmente
importante referir que existe heterocromatina que
está permanentemente condensada e que se
denomina heterocromatina construtiva, não sendo
praticamente transcrita.
Estrutura do cromossoma
O cromossoma apresenta DNA associado a proteína,
designando-se cada molécula de DNA presente no
cromossoma por cromatídea. As cromatídeas estão
unidas por um centrómero. A extremidade do
cromossoma é o telómero.
Existem proteínas QU€, não sendo histonas,
desempenham importantes funções na manutenção
da estrutura do cromossoma 
- 
/oops de DNA
associados a um scoffold cromossómico de proteínas
não histónicas, formam umas "argolas" designadas por SMC - Structural mointenonce of chromosome.
A condensina é entendida como largos complexos proteicos com uma função fundamental na estrutura
de um cromossoma.
O cariótipo é entendido como o diagrama organizado dos cromossomas metafásicos de uma espécie e
tem em conta, o número de cromossomas de uma determinada espécie, a sua forma e tamanho.
DNAbinding proteins
AS DNA binding proteins são as proteínas que se ligam ao DNA (mais particularmente à sua periferia),
estas têm acesso às bases no interior da molécula de DNA, sem ser necessário desnaturá-la. lsso é
possível, especialmente, graças ao "snlco grande" da molécula de DNA, que permite a exposição das
bases nucleotídicas. As ligações estabelecidas entre o DNA e as proteínas são muito específicas,
formando à espécie de um efeito velcro.
Frequentemente, ligam-se ao DNA proteínas com estrutura secundária em s,-hélice, mas as folhas
pragueadas p também conseguem reconhecer a dupla hélice de DNA, bem como ansas de aminoácidos
(como as da proteína p53, supressora tumoral).
A helix-turn-helix é um domínio comum de ligação ao DNA, sendo compostas por duas hélices e um
grupo turn, em ângulo fixo, sendo que uma hélice, a hélice de reconhecimento liga se à mojor groove do
DNA. O basic helix-loop-helix (bHLH) é uma variante, onde duas hélices estão conectadas por um loop.
Um caso particular de helix-turn-helix é o homeodomain e é observado nos repressores bacterianos.
O zincfinger é o motivo mais abundante de ligação nos animais. Tem umátomo de zinco a unir vários
resíduos de aminoácidos (entre 23 e28), apresenta várias formas possível, mas geralmente, tem uma
hélice de reconhecimento.
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13
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Reporaçõo das dirneras de ?inine pcr excisão de nurleetideos
{n*clec"tide excisicn repsi!" - NEâ)
antigo. lsto permite finaimenie que a Dil-lA
polimerase e a DNA ligase possam repor o
nucleotídeo correcto.
Todavia, muitas mutações não podem ser
corrigidas simplesmente pela remoção de uma
base e um nucleotídeo mutado altera, inclusive, a
configuração local da molécula de DNA. Quando
temos dímeros de timina e de citosina, o processo
utilizado é a nucleoüde excision repdir, onde as
helicases removem uma grande quantidade de
nucleotídeos adjacentes ao dímero.
Posteriormente, reconstrói-se a região em falta,
com recurso à DNA polimerase e à DNA ligase.
Nas células dos mamíferos, estes danos do DNA
são reconhecidos pelas proteínas XPA 
- 
xPG
(sendo que algumas destas proteínas têm
também função de helicase e até endonuclease),
e mutações nestas levam à doença Xeroderma
pigmentosum, onde se registam frequentes
tumores cutâneos.
O processo de reparação do DNA associada à transcrição em células eucarióticas (tronscription-coupled
repairl é importante na medida em que as mutações do DNA são reparadas mais rapidamente se
ocorrerem numa região transcricionalmente activa, pois as RNA polimerase que estão a fazer a
transcrição param se encontrarem um dano que lhes impeça de realizar a sua função. Essa paragem é
prontamente detectada pelas proteínas CSA e CSB que activam as proteínas XPA-XPG, que realizam um
processo que será depois similar ao anterior. Associado à deficiência na capacidade das células
repararem DNA que está sendo transcrito, temos o síndrome de Cockayne, cujos pacientes apresentam
desordens mulü-sistém icas.
Reparação ÁÂísmotch
Reparação associada à replicação
Após ocorrer replicação de DNA, a enzima DNA
polimerase tem capacidade de proof-reoding e detecta
emparelhamentos errados, substituindo-os por correctos.
Porém, por vezes escapam mismdtches. Estes
mismotches são detectados e corrigidos pelo processo de
mismotch repoir, que ocorre após a replicação do DNA.
A detecção de regiões onde ocorrem mal-
emparelhamentos e feita à conta de proteínas,
nomeadamente, nos procariotas, as proteínas Mut (Mut
S, Mut L e Mut H), que reconhecem nucleótidos
metilados. A Mut l- a Mut S, uma helicase e uma
exonuclease contribuem para a excisão do fragmento
onde se encontra o nucleótido mal-emparelhado.
Finalmente, a DNA polimerase e a DNA ligase colocam um
fragmento correcto, em substituição.
Humona
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20
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§t{§{t{*§§§§s§§§
citrT
Recornbi*aç§* hom*logâ na ÍylÊiüsê
dos cromossomas. Ocorre então remoção da
região em torno das extremidades do
fragmento, por acção de uma exonuclease e
forma-se posteriormente um heteroduplex,
após uma strand invasion, operada pelo
cromossoma homólogo. O heteroduplex
formado permite que a cadeia com a região
fragmentada, por complementaridade de
bases, relaüvamente ao cromossoma
homólogo, possa "preencher" a região em
fa lta.
As proteínas RecA (nos procariontes) e Rad51
(nos mamíferos) são essenciais para a
formação do heteroduplex, pois catalisam a
ligação de uma cadeia simples de DNA a uma
dupla. A proteína Rad52 favorece a ligação da
Rad51 à cadeia simples de DNA. As regiôes de
heteroduplex podem migrar da cadeia dupla,
espalhando-se por bronch migraüon. lsto
pode ocorrer sem acção de enzimas (e então
ocorre bidireccionalmente) ou,
unidireccionalmente, com acção de enzimas
(com função de helicase). Neste processo não
ocorre perda de nucleotídeos.
{b} Gene conversion
5'.
F'
5',
U
(c) Crossover
§,v
§,
3',
5'
3',
3'
5'
5',
5',
5',
(a)
s',,
3',
3',
D'
,'it
E'
e'
F'
I
5'ffi3', DE
pequena porção para outro (sem que haja perda de informação genética para o cromossoma dador). A
recombinação pode ser prevenida, caso não haja homologia entre as sequências de nucleotídeos,
através de um mecanismo de mismatch repair.
*r*r*§s!&§a§*rô§la§
§rm§m§§&ü**§
aà@rsffi**r&&gs§#rt
A recombinação molecular genética homóloga
que ocorre na meiose é muito similar à reparação por recombinação. A Spo11 e a Mre11 vão começar
por provocar falhas na molécula de DNA de um cromossoma, estimulando-a à invasão do cromossoma
vizinho, promovendo-se assim a recombinação genética homóloga, através das junções de Holliday
(uma junção móvel entre quatro cadeias de DNA).
lsto permite o processo
designado por crossing-
over, que ocorre em cerca
de t0% das moléculas de
DNA, bem como o processo
de conversão genética.
Enquanto no processo de
crossing-over ocorre uma
troca de segmentos entre
cromossomas, no processo
de conversão genética um
cromossoma transfere uma
l§§eryM,
3'
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Recombinação não-homóloga do DNA
A recombinação não-homótoga de DNA não implica homologia de sequências específicas de DNA.
Participam neste processo, recombinases que funcionam de modo similar às topo-isomerases. As
recombinases reconhecem dadas sequências de DNA, cortam-nas e recombinam-nas com sequências
não-homólogas. Este processo de"site specific recombination" é muito importante para a formação dos
anticorpos e daí, 25000 genes originarem cerca de 1011 anücorpos diferentes. Este processo de RV(Dil
Recombindtion é possível graças à presença das proteínas RAG 1 e RAG 2, expressas especificamente
nos linfócitos.
Rearranjodo genedacadeialeue daímunoglobultna(contérnttmaregiãoV,amaJ euma C): 600 camb.díferentes
Rearranjo d.o gene da cadeiapesada da imtmoglobulina (contémwnaregiáo V,uma l,uma D e ttma C): 7200 comb. ilif e?'entes
Numero d.e genes cadif ícantes para antícorpos:25000
Número de múicoroos passíveís d.e seremproduzídos: 60o x 7200 x 25000 = 1011
Esta diversidade tal de anticorpos é essencial ao funcionamento do sistema imunitário dos vertebrados,
na medida em que permite que uma imensa quantidade de antigénios seja reconhecida.
Amplificaçâo genética
Em algumas células como as tumorais ou de ovócito, alguns genes são replicados muitas vezes (muito
amplificados) antes de se dar a replicação completa do genoma total, num processo designado por
amplificação genética. lsto permite aumentar a influência que esse gene apresenta no fenótipo.
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Transcricão: Síntese do RNA mensaseiro
A ribose é o monossacarídeo presente na molécula de RNA. Esta estrutura tem um grupo 
-HO, em vez
de um grupo 
-H, no carbono 2, como acontece com a desoxirribose. lsto torna o RNA muito mais
reactivo e leva a que este se encontre, quase sempre, sob a forma de cadeia simples (estrutura primária
do RNA). Apesar disso, o RNA pode assumir estruturas tri-dimensionais, que determinam diferentes
funções. De entre as estruturas secundárias formadas encontramos o hairpin e o stem loop e de entre
as terciárias, destaque para o pseudo-nó. A formação de estruturas tri-dimensionais do RNA é muito
importante, na medida em que permite a activação de reacções químicas, por parte do RNA. As
ribozimas são então RNA com actividadeenzimática.
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M*ese*er§ffi*§.hMM§ryel
RNA polimerases e RNAs transcritos
A transcrição de DNA é entendida pela polimerização de RNA utilizando uma cadeia molde de DNA,
adicionando-se ribonucleotídeos por complementaridade de bases. O crescimento da cadeia de RNA
ocorre sempre de 5' para 3', sendo a reacção catalisada pelas RNA polimerases, sem necessidade da
adição prévia de primers. Existem três classes de RNA polimerases que codificam diferentes RNAs:
Estas enzimas disünguem-se também pela diferente sensibilidade a uma toxina, a a-amaniüna, sendo
que a RNA polimerase ll é mais sensível que a RNA polimerase lll a RNA polimerase I é lhe insensível.
Todas.as RNA polimerases são constituídas por várias subunidades, algumas delas homólogas com as da
DNA polimerase, sendo a estrutura dessas subunidades muito conservada durante a evolução. De entre
nR&§§ * 5.§§" 1§§ e ?§§ Base da estrutura dc ribçsctrríãã
M*difir.ar,ãs ru ir:nisa das rã.l,ɧeEn;rRl\t&s i peq sê nss E!\§As n ur le*lare:]
§adi$icem pr*teínas
snflf'lAs e scf,ldAs Ipequencs RtúÂ-r] Funçôe:, p*r ex.ernpi*" a* nível d*
Reeulaçã* da expreasãr §€nica {bl*eq*ei*
d* traduçãç de determinad*ls
mifll{Ás lrnicr* HNÀsl
*lnterffiediári*s* enâre * mâffià e cs
snSMAs e sERt*As ipequrnos Rl{,qs} ües. §*rexempl 
" 
a* níEel d*
B*çe da r=truÍur* d* rib*ss*m*
24
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as subunidades encontramos duas maiores do tipo p (as quais nos eucariotas, denominamos por RPB1 e
RPB2), duas do tipo c e uma do üpo o. As RNA polimerases adicionam erradamente 1 em cada 10000
nucleotídeos. Contudo, estas enzimas possuem capacidade de proof-reoding (náo tão elevada como a
da DNA polimerase).
A RNA polimerase ll apresenta, numa das suas subunidades grandes, uma cadeia carboxílica terminal (C
Terminql Domain), que é constituída por cadeias repetidas de sete aminoácidos, variando o número de
repetições entre 26 e 52 (são 52 nos vertebrados). Esta cadeia sofre hiperfosforilação durante a etapa
de iniciação da transcrição, sendo essencial no processo de transcrição, nomeadámente, em regiões
onde existe muita acüvidade nesse sentido.
Transcrição do DNA em mRNA
O processo de transcrição de DNA inicia-se ao nível do nucleotídeo +1. Todos os nucleótidos que se
encontram antes desse nucleótido, dizem que se encontram "a montante", ou upstream, sendo
contados negativamente. Dos nucleótidos que se encontram depois, diz-se que estão a "jusante", ou
downstreom, contando-se positivamente. Este processo envolve genericamente três etapas 
- 
iniciação
(que concerne a abertura da cadeia de DNA, ficando desemparelhados 14 nucleotídeos), a fase de
alongamento e a terminação.
As sequências de consenso são sequências com cerca de 10 nucleotídeos, que são muito conservadas e
que se encontram próximas dos locais de início de transcrição. A estas sequências, da qual é exemplo a
TATA box, ligam-se factores proteicos, essenclais para que a RNA polimerase possa actuar. Alguns genes,
contudo, não necessitam de sequências de consenso dos promotores para serem transcritos,
apresentando estes, normalmente, baixa actividade transcriptiva. Existem ainda regiões do DNA que
funcionam como acüvadoras e de aumento da actividade transcriptiva 
- 
são os Promotor-proximol
elements, que se encontram 100 a 200 bp upstream do local +1 e os enhoncers, a mais de 200 bp do
Iocal +1 lquer upstream, quer downstreom). O complexo mediador é o responsável por "fazer a ponte"
entre a RNA polimerase Il e as regiões activadoras.
Sequências de ccnsenso
,35-30 +tô
ÊnÉ TÃrÀ
tr*nÍsistisã
ilârt psltrlrI
llr§
§R§
YÃT*
§*§
§pÉ
§l{§í{§tâc§({
TÂT.* ÀrÍ & À/T
*t(rͧ§Ít*{iTüT
À16tiÀ1T{6ͧ
YFII§
T&p
Tfiͧ
tF{í§
A TBP liga-se à TATA box, seguindo-se o TFIID (o maior transcripüon /octor destes aqui presentes) e o
TFIIB (TF significa transcripüon foctor). Liga-se então a RNA polimerase ll e, simultaneamente, o TFllF.
Por último, liga-se o TFIIE e o TFllH, ficando assim formado o complexo de iniciação. O TFIIH tem função
de helicase, permitindo a abertura da cadeia de DNA e de síntese, ligando grupos fosforilados à cadeia
carboxílica terminal (a ordem de ligação dos factores de transcrição é dada pela mnemónica, "Deus
Bom, Fé Em altura", representando-se a altura por h como na física).
25
Con'lplexo cie iniciaçâo
.l.e\!q-e;isr!:irl;"",!.,@i]!i,rrG{.!rL', .
I §i!:ir!,.,r r!lr)!!,r;,
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Assim que se dá a fosforllação da CTD e adição do primeiro
ribonucleotídeo, desmonta-se o complexo de iniciação e
inicia-se a fase de alongamento. Nas células eucarióticas, a
velocidade de adição de ribonucleotídeos é muito
reduzida, nomeadamente devido ao super-enrolamento
verificado no DNA, a jusante da RNA polimerase e que é
gerado pela própria enzima (que paradoxalmente facilita o
desenrolamento do DNA à volta das histonas nos
nucleossomas). Contudo, o recurso a topo-isomerases
para desenrolar a cadeia é por vezes necessário.
No pré-mRNA formado existem sequências de
ribonucleotídeos que assinalam o início e o fim da
transcrição. O início é marcado pelo elemento upstreqm,
enquanto o fim e marcado pelo elemento downstreom.
Processamento
Após a transcrição forma-se um pré-mRNA, ou seja um
mRNA que ainda não sofreu processamento e que ainda
não está pronto para ser traduzido. O processamento
conduz assim à formação de um mRNA maduro e envolve a
ocorrência de copping, clivagem, splicing e poli-adenilação.
O capping ocorre na extremidade 5', que se liga a uma
guanosina, quando o mRNA começa a sair da RNA polimerase (através de uma ligação 5'-5'). Essa
guanosina é então metilada, originando-se 7-meülguanosina. O cop permite a protecção da
extremidade 5'da degradação enzimática e que aquela molécula seja reconhecida como mRNA. Por
outro lado, o cap é um factor que contribui no transporte do mRNA para o citoplasma. De referir que o
copping ocorre concomitantemente à metilação da ribose do primeiro nucleotídeo.
Ao mRNA recém-formado ligam-se também proteínas (levando à formação de ribonucleoproteínas -
RNP), com o objectivo de prevenir a formação de estruturas tri-dimensionais e de reconhecimento de
sequências de nucleotídeos. Existem lgualmente RNA-binding proteins, cujo objectivo é o de manter a
estabilidade do RNA.
Na clivagem (cleovagel
ocorre um corte na
molécula de pré-mRNA,
no sentido da região do
elemento downstream
(ou seja na extremidade
3'), algo que é catalisado
por endonucleases e que
requer a existência de
factores de estimulação
deste processo,
nomeadamenteoCstFeo
CPSF.
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Bernardo Manuel de Sousa Pinto
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Sebenta de Biologia Celular e Molecular I
O processo de splicing, por sua vez, consiste na remoção dos intrões do pré-mRNA. Quando este é
muito longo e contém muitos intrões, o splicing é feito ainda aquando da transcrição. Contudo, quando
o pré-mRNA é pequeno, ocorre mais ou menos simultaneamente splicing e poli-adenilação.A poli-
adenilação é um processo que consiste na adição de uma cauda poli-A (sem que seja necessária a
adição de outras estruturas prévias), constituída por uma elevada quantidade de adeninas, à
extremidade 3', por acção da enzima PAP (polyadenylate polymerase). A cauda poli-A impede a
degradação do mRNA, podendo-se ligar proteínas a esta estrutura 
- 
as poli-A binding proteins.
Para que ocorra splicing é necessária a intervenção de pequenos RNA, que reconhecem regiões de
intrões e promovem a sua eliminação da cadeia de mRNA, O mecanismo de splicing envolve então o
reconhecimento de três sequências de consenso do intrão 
- 
o local de splicing em 5', o local de splicing
em 3' e o brsnch point (sítlo de ramificação, onde a extremidade 5' se vai ligar) Dessa forma,
compreende-se que o emparelhamento entre o pré-mRNA e os pequenos RNA (nomeadamente os
pequenos RNA U1 e U2) seja essencial para que ocorra este processo. O primeiro pequeno RNA a ligar-
se é o U1, na extremidade 5' de um intrão. Seguem-se as proteínasfactores de splicing BBP e U2AF e
posteriormente liga-se, no branch point, o pequeno RNA U2. Ligam-se depois os pequenos RNAs U4, U5
e U5, sendo formado um complexo ribo-proteico, ao qual se dá o nome de spliceossoma, que tem
aproximadamente a massa de um ribossoma. Após sucessivas ligaçôes RNA-RNA, que envolvem gastos
de ATP, o intrão é eliminado da cadeia de RNA, sob a forma de lariot intron (intrão em forma de laço) e,
já sob a forma linear, degradado no ínterior do núcleo, por acção de enzimas.
De forma a não serem removidos os exões, durante o processo de splicing,ligam-se proteínas aos exões
- 
as proteínas SR. Os intrões, de maiores dimensões, formam complexos hnRNP (heterogeneous
nucleor riboproteinsl e são posteriormente degradados. Estas ligaçôes são fundamentais, de forma a
permitir que o spliceossoma distinga intrões de exões. Se um exão for removido indevidamente, podem
ser originadas patologias, da qual é exemplo a atrofia muscular espinhal.
Tipcs de spliçin§
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Bernardo Manuel de Sousa Pinto
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Sebenta de Biologia Celular e Molecular I
lsolamento e cultura celular
lsolamento de células
Microdissecçáo por laser
Este processo permite recortar regiões da célula, muito selectivamente, submetendo-as a radiação
laser, após estas terem sido cobertas por um polímero.
Citometria de fluxo
A citometria de fluxo permite a separação de células, através de diferença de cargas. Algumas células
são marcadas por fluorescência, sendo que as marcadas, recebem uma determinada carga e as que não
têm recebem outra. É feita posteriormente uma triagem com base nas cargas das células.
Cultura de células in vivo:
A cultura de células in vivo é muito importante em termos científicos, sendo aceite em termos éticos e
poupando recursos financeiros. Estas células são cultivadas em meio de cultura Iíquido, asséptico,
suplementado com aminoácidos, vitaminas e soro animal, estando todos os factores controlados. Para
alem disso, estas células mantêm as características das originais. Contudo, existe a possibilidade da
contaminação destas culturas com microrganismos.
As células que retiramos podem se dividir num número limitado de vezes (normalmente podem
efectuar até 40 divisões), morrendo posteriormente. Contudo, algumas células normais de roedores e
células tumorais têm capacidade de se dividir indefinidamente 
- 
linhas de células imortais 
- 
um
exemplo de células imortais, são as células da linha HeLa, a primeira linha celular, que foi isolada a
partir de um cancro do colo do útero.
Células imortais cultivadas in vivo são utilizadas na criação de células híbridas. As células híbridas
resultam da cultura de duas células com conteúdo genético não muito diferente. Para se criarem células
híbridas, recorre-se ao polietilenoglicol, formando-se depois um heterocdryon, porque as membranas
das células tornam-se muito permeáveis. Formam-se depois, por mitose, células com informação
genética de ambos os tipos de células. As células híbridas são utilizadas, por exemplo, para a produção
de anticorpos monoclonais, por parte de hibridomas, células resultantes da fusão de linfócitos B com
células tumorais, o que lhes confere imortalidade. As células híbridas têm ainda aplicações na
investigação e no diagnóstico de patologias.
lsolamento de organelos:
Os organelos são isolados, de forma a permitir um melhor conhecimento da sua constituição, algo
essencial, por exemplo, para a produção de fármacos. Para proceder à obtenção de organelos isolados,
em primeiro lugar, a membrana citoplasmática das células é rompida, através de um método mecânico
- 
o homogeneizador. De seguida, procede-se a uma centrifugação, onde se aplica uma grande força
centrífuga, maior que a da gravidade, de modo a obter um sedimento, constituído pelas estruturas mais
densas e um sobrenadante, constituído pelas restantes. O núcleo será o primeiro organelo a constituir o
sedimento, dada a sua elevada densidade. Contudo, é necessária a separação dos sobrenadantes, algo
que se faz recorrendo-se a uma centrifugação diferencial, a forças cada vez maiores.
Como as fracções obtidas nunca são 100% puras, utilizamos um gradiente, onde a base tem maior
concentração de soluto (p.e. de sacarose) que o topo. Obtém-se aí uma coluna com bandas, o que
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O leucin-zipper consiste em duas q-héllices de DNA, unidas por interacções hidrofóbicas, ao nível das
leucinas. Está associada à expressão de genes.
Os heterodímeros são resultado da junção entre o leucin-zipper e as hélice-ansa-hélice básicas, tendo
diferente especificidade de ligação ao DNA. Contudo, o número de combinações em cada célula é
limitado, dependendo sempre da sequência de aminoácidos de cada cadeia.
l.{elix-turn-helÍx Zinc*Finger Leucin-zipper
{a}
Bcsic helix-loap-helix (bHLF{}
T4
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Nos eucariotas,o mismotch repair é operado pelas proteínas MSH. O reconhecimento do mismotch é
levado a cabo pela MSH2 e MSH6, a excisão pela DNA helicase, pela DNA exonuclease, pela MLH1
endonuclease e pela PMS2. Finalmente, a regeneração da cadeia fragmentada é levada a cabo pela DNA
polímerase e pela DNA ligase. Apesar disso, não se sabe muito bem como é que as MSH detectam quais
os nucleótidos que foram colocados erradamente. Mutações nas proteínas MSH leva a uma tendência
para os indivíduos desenvolverem cancro do colo do útero e colo-rectal.
Reparação error-prone
Reporxç§* pcr ãw:dssbi? §&e4 S#?t*§*Quando nenhum dos
mecanismos enumerados
anteriormente funciona e
quando, aquando de uma
nova replicação, a DNA
polimerase encontra uma
situação aberrante (por
exernplo, um dímero de
timina), esta enzima pára a
sua actividade, pois não
sabe o que fazer. Passa
então a actuar uma nova
DNApolimerase-aDNA
polimerase error-prone 
-
que não tem capacidade
de proof-reodrng e inicia a
polimerização de nucleotídeos "à toa", inserindo muitos por estimativa (e obviamente, muitos errados).
Contudo, isto evita que a célula morra, algo que aconteceria, caso não ocorresse replicação, de todo. A
Recombinação homóloga do DNA cadeia nova que se forma, serve então como
molde para a remoção do erroque estava na
cadeia original. Este processo designa-se por
reparação por tronslesion DNA synthesis, ou
reparação error-prone.
Reparação por end-joining
O processo de reparação por end-joining ocorre,
quando se verificam quebras na dupla cadeia de
DNA. Ocorre então o reconhecimento dessas
extremidades por parte das proteínas Ku e por
acção destas e de outras proteínas, ocorre
remoção de nucleotídeos próximos das
extremidades e, depois, junção destas. lsto, claro,
leva a perda de informação genética.
Recombinação homóloga do DNA
Já o processo de recombinação homóloga do DNA
ocorre entre regiões homólogas de cromossomas
muito similares, aquando de um fragmento num
ldí}ʧl*i rusti**!i$r*
3d**.1**ct §ç
th'tn*ne drsxr
l"*r,r,§À i íêp§íi:§li\,*
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2L
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Nas células eucarióticas há outros mecanismos de splicing, que são, contudo mais raros, nomeadamente
o splicing dotipo U12, que ocorre com ligação do pequeno RNA U11 à extremidade 5'do intrão e do
pequeno RNA U12 ao branch point. Já o trans-splicing consiste num mecanismo, em que dois exões
separados se ligam, ocorrendo concomitantemente remoção do fragmento de intrão que entre eles se
interpunha. Este processo ocorre com a intervenção de pequenos RNA e é característico do
Trypanosoma e dos nemátodos.
Em alguns protozoários existe sell-splicing, onde o próprio RNA catalisa as reacções de splicing, sem que
haja intervenção de proteínas. No self-splicing, um cofactor de guanosina liga-se ao local de splicing em
5' do intrão, que tem actividade enzimática (Grupo l); ou o próprio intrão apresenta uma adenosina que
"ataca" o local de splicing em 5', catalisando a sua clivagem (Grupo ll) e, consequentemente, a sua
própria remoção. O splicing alternaüvo ocorre em fragmentos que contenham muitos exões, podendo
ser removidos alguns, sem perda de função celular e, como tal, podem ocorrer inúmeras combinações
entre exões, o que contribui para um aumento da variabilidade genética. Analogamente ao splicing
alternativo, existe também cleavage alternaüva.
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Transcricão do DNA: Síntese do tRNA e do rRNA
Numa célula em crescimento rápido, cerca de 80% do RNA é rRNA, sendo que quanto maior for a
actividade metabólica da célula, maior a percentagem de rRNA. O IRNA, por sua vez, conta cerca de 15%
da quantidade de RNA existente na célula e apenas 5% do RNA celular é mRNA.
Síntese do rRNA
A RNA polimerase I participa ao nível da síntese de rRNA, actuando unicamente ao nível dos nucléolos,
onde este processo ocorre. Um nucléolo é constituído por um componente fibrilar denso, um centro
fibirlar e um componente granular. O componente fibrilar
denso, que apresenta um aspecto mais escuro, quando
visualizado em microscopia electrónica, é o local onde
ocorre síntese activa de rRNA. Este migra para o
componente granular, o local do nucléolo, onde é visível a
presença de grânulos de cerca de 15 nm de diâmetero e
onde ocorre a maturação do rRNA, através da sua
clivagem. O centro fibrilar apresenta um aspecto mais
claro, onde está presente o DNA codificante de rRNA, que
não está transcricionalmente activo naquele momento.
Finalmente, completada a maturação, o rRNA migra para o
citoplasma.
No final da telofase, aparecem vários pequenos nucléolos, que depois se unem, aquando da replicação
do DNA e se separam outra vez, aquando da mitose. Como já foi referido, quanto maior forem as
dimensões e o número de nucléolos, maior a actividade metabólica da célula.
Os genes que codificam os nucléolos, no final
da telofase, são os NOR (organizadores
nucleolares), que não se encontram no
nucléolo (nesta estrutura apenas
encontramos genes que codificam para
rRNA), mas nos pares de cromossomas
t3,14,15,2t e 22.
A transcrição activa de rRNA pode ser
observada através das imagens de árvore de
Natal. A bactéria E. coli apresenta 7 cópias
para o gene que codifica rRNA, enquanto o
ser humano tem entre 200 e 250 cópias, não
sendo todas transcritas activamente, em
simultâneo. Este número muito elevado de
cópias, permite a produção de muitas cópias
de rRNA por intervalo de tempo. Estas cópias
dispõe-se numa sequência em tondem
drrqy, constituída por sequências de
unidades de transcrição intervaladas com
DNA spocers, que não são transcritos. Nas
unidades de transcrição, existem ainda
partes que são transcritas, mas não são
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codificantes.
No DNA que codifica o pré-rRNA, existe um upstreqm
element (UCE), a entre l-55 e 60 nucleotídeos a montante do
local de início da transcrição e um core element que se
encontra no local entre -40 e +5. Para a RNA polimerase I se
ligar aos promotores é necessário que se liguem primeiro
factores de transcrição, nomeadamente, o UBF (upstreom
trdnscription fdctorl, o Selecüvity Factor í (SL-1, composto
pelos TAF) e o core factor (CF). O UBF tem como função o
reconhecimenlo do upstream element (sendo por isso um
upstreom binding foctorl, ao qual se liga também o SL-1. O
core foctor reconhece o core element. Uma das subunidades
do SL-1 é a TATA binding protein, apesar de no DNA em
questão não existir nenhum promotor com sequência
homóloga à TATA box.
Após ocorrer o processo de transcrição (que fica completo
aquando da clivagem da extremidade 3' do DNA), forma-se
um transcripto primário com 45S (unidades de
sedimentação), que vai sofrer um processamento, que inclui
clivagem (e retirada a extremidade 5' e as regiões não
funcionais) e modificações químicas nas bases (por exemplo, metllações nas riboses). Este transcrito
originará, então, por clivagem, uma cadeia de 28S, uma de 5.8S (unindo-se estas duas, que se formam a
partir de uma de 32 S, para originar o que será a subunidade grande do ribossoma, juntamente com
uma cadeia de 55) e uma cadeia de 20S (que depois passará a 18S, originando a subunidade pequena do
ribossoma).
O pequeno RNA U3 é o responsável pela remoção da extremidade 5', sendo que as restantes regiões
não-codificantes de RNA são clivadas e imediatamente degradadas por enzimas. Os snoRNAs (pequenos
RNAs nucleolares), que são pequenos RNAs que são transcritos
pela RNA polimerase ll, pela RNA polimerase lll e até por
intrões, participam no processo de processamento de RNA,
nomeadamente, por complementaridade de bases, permitem
a exposição das bases que devem ser metiladas ou sofrer
outras alterações. Os snoRPs box C+D posicionam uma enzima
que metilará bases do pré-rRNA (tendo, por isso, actividade de
metil-transferase), enquanto os snoRNPs box H + ACA
posicionam uma enzima que converte a uridina em pseudo-
uridina.
O RNA ribossomal 55 integra a subunidade grande do
ribossoma e é sintetizado pela RNA polimerase lll. O complexo
de iniciação envolve a presença dos factores de transcrição
TFlllÀ TFlllB e TFlllC (TF significa transcription Íoctor), sendo o
promotor associado a este processo a boxc.
O ribossoma não é apenas constituído por rRNA,
apresentando também proteínas. O processamento do rRNA
ocorre simultaneamente à associação com proteínas, sendo
I'
_:â áM
.,*§ u"ffi 
'&. 
...
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Sebenta de Blologia Celular e Molecular I
§*mplex* de inicioção Ca trcns:riçô* pel* Rfd,4pofiner*ssl§f que a subunidade pequena é "produzida"
mals depressa que a grande, pois
começa-se a ligar a proteínas ainda na
fase de transcrição. Já a subunidade
grande sofre a clivagem final no
citoplasma, após ter migrado, algo
importante, na medida em que, isto
impede que a síntese de proteínas ocorra
no núcleo. De referir que a subunidade
grande sofre também controlo de
qualidade (depois de actuarem hellcases,
com o objectivo de fazer a clivagem de
eventuais snoRNAs que se Iigaram ao
rRNA). O transporte desta subunidade é
também muito lento, visto que esta é do
tamanho do poro nuclear, tendo que se
desligar primeiro a maior parte das
estruturas que lhe estavam ligadas.
A RNA polimerase lll tem como função a síntese do tRNA, que ocorre ao nível do nucleoplasma. Para se
formar o complexo de iniciação para a RNA polimerase lll, Iigam-se primeiro o TFlllC (que se liga aos
promotores box A e box B) e o TFlllB. Após a transcrição, o IRNA sintetizado sofre clivagens
(nomeadamente na extremidade 5' e na extremidade 3'). Depois, é adicionada à extremidade 3', uma
sequência CCÀ essencial para a ligação dos aminoácidos, aquando do processo de tradução. Segue-se a
modificação de cerca de tQ% dos nucleótidos do IRNA, podendo este ainda sofrer splicing. O splicing no
tRNA ocorre exclusivamente por acção de enzimas proteicas, nomeadamente endonucleases,
fosfotransferases e ligases. Os IRNA produzidos são exportados para o citoplasma, através do complexo
de poro nuclear por acção de uma exportina.
Aquando da síntese de snRNAs na presença da RNA-polimerase lll, o promotor apresenta a TATA box,
estando ligados ao promotor o TFlllB e o SNAP, aquando da presença do complexo de iniciação.
TFilit3
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Núcleo celular
O núcleo é um organelo extremamente dinâmlco e que apresenta grandes dimensões,
comparaüvamente aos restantes organelos celulares (cerca de 6 pm, nas células dos mamíferos). A
presença deste organelo é um elemento-chave para fazer a distinção entre células eucarióticas e
proca rióticas.
Observação e estudo do núcleo celular
O núcleo cora por acção de corantes básicos, devido à presença substancial de ácidos nucleicos.
Contudo, estes corantes não permitem distinguir o DNA e o RNA. Dessa forma, o método de Feulgen
emprega-se com o fim de evidenciar histologicamente somente o núcleo - ocorre remoção do RNA
existente nos núcleos, por acção do ácido clorídrico, dando-se a quebra entre as ligações ocorrldas entre
as bases púricas e os grupos desoxirribose. lsto permite que haja reacção com o reagente de Schiff e que
o DNA apareça visível, de cor vermelha. Utilizando esta técnica, os nucléolos aparecem incolores, pois
são, sobretudo, compostos por RNA. A
Mércdcde Êêrrsen lAp, observação do núcleo por imunofluorescência é
igualmente possível, sendo utilizado o DAPI, um
corante fluorescente, que se liga ao DNA, sendo
emitida, por consequência, uma cor azul.
O método da contrastação regressiva do EDTA
permite igualmente o estudo do núcleo celular 
-
entre a aplicação de acetato de uranilo e citrato
de chumbo, utiliza-se EDTA, um ácido que
permite a obtenção de um "negativo" do que
seriam as imagens de normal contraste, isto é, as
partes claras correspondem a locais de maior
presença de DNA e as partes mais escuras a
locais como fibirlas e grânulos. Os núcleos
celulares podem igualmente ser isolados e
purificados por ultracentrifugação, sendo os
primeiros organelos a sedimentar, devido à sua
massa.
Territórios cromossómicos e corpos nucleares
As moléculas de DNA, em interfase, não ocupa áreas aleatórias do
núcleo, designando-se essas áreas restritas ocupadas por cada
cromossoma por território cromossómico. Após cada ciclo celular, os
cromossomas continuam a ocupar aproximadamente os mesmos
territórios cromossómicos. Entre esses territórios, existem domínios
intercromossómicos, onde ocorrem reacções muito importantes.
No núcleo encontramos vários domínios, denominados corpos
nucleares (também designados por domínios nucleares), que não
são rodeados por membranas, mas que mesmo assim, apresentam
concentrações elevadas de proteínas específicas e RNAs, o que leva à
formação de estruturas quase esféricas. Os corpos nucleares mais
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Hr*ãr strB
proeminentes são os
nucléolos. Contudo, existem
l-Í*r*íô€,hMa{§ muitos outros que têm vindo
a ser detectados devido a
§sr$hi
*m* técnicas
imunofluorescência ou à
contrastação progressiva por
FirL írâdy E DTA'
Os focos ou fábricas de
replicação são os locais onde
Nsreffsp*ekies se origina a replicação
cromossómica, sendo que
P§{ir$dêol*. Mptn§srlt §A§'t6§n§d6ârb§dr estes só se observam durante
a fase 5 do ciclo celular. Já os domínios de transcrição podem ser observados recorrendo a técnicas de
imunofluorescência, quer no núcleo, quer nos nucléolos.
Os locais onde ocorre a síntese e amadurecimento dos rRNA são os nucléolos, locais onde é possível
disünguir um componente fibrilar denso, um centro fibrilar e um componente granular. Os nucléolos
são formados em torno de loci específicos 
- 
os NORs (regiões organizadoras de nucléolos).
As fibrilas pericromatínicas estão sempre entre os domínios intercromossómicos, na periferia da
cromatina condensada. As fibrilas são enriquecidas em RNA e provavelmente são locais de splicing do
pré-mRNA e de poliadenilação.
Os grânulos pericromáticos são regiões cuja função ainda não é bem conhecida. Provavelmente,
participam na acumulação de transcritos primários de RNA pré-mensageiro, que não sofreram
amadurecimento (por exemplo, splicing\, não tendo sido ainda degradados. Em microscopia electrónica,
estes grânulos são regiões escuras, rodeadas por uma auréola clara.
Os gânglios intercromatínicos são também designados por speckles, sendo pequenas estruturas de
difícil visualização, devido ao facto de não se encontrarem em regiões de ocorrência de splicing. Pensa-
se que estas estruturas estão relacionadas com o armazenamento de snRPs e proteínas envolvidas no
splicing de pré-mRNa, que são lançadas no nucleoplasma, quando é necessário.
Os corpos espiralados, também designados por corpos de Cajal são locais onde os pequenos RNAs são
produzidos, sofrem maturação e são reciclados. Acredita-se que o processamento das histonas do
mRNA também ocorre ao nível dos corpos de Cajal. Cada célula eucariótica tem entre 3 e 10 corpos de
Cajal e estes são identificados graças à presença de coilina, o seu principal componente. Esta proteína,
que pernite a ligação do corpo de Cajal ao nucléolo, hibridiza com a GFP, permitindo a detecção dos
corpos de Cajal.
Os corpos nucleares PML (Promyelocyüc Leukemia)apresentam essa designação (associada à leucemia),
pois neles está presente uma mutação em indivíduos que padecem de leucemia. Existem entre 10 e 30
corpos nucleares PML por núcleo, embora não haja certeza relativamente à sua função. Provavelmente,
estes corpos funcionam como locais para modificação de complexos proteicos envolvidos na reparação
de DNA e na indução de apoptose.
Os corpos nucleares simples e os corpos nucleares complexos têm ainda função desconhecida, embora
se saiba que surgem aquando de um estímulo hormonal.
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33
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Faculdade