10a Aula Apostila Enzimas 2017.1

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Universidade Federal de Sergipe
Centro de Ciências Biológicas e da Saúde
Departamento de Fisiologia
Apostila
Enzimas
Professor: Paulo de Tarso Gonçalves Leopoldo
São Cristóvão
 2017
I. Dados de Identificação:
 Instituição: Universidade Federal de Sergipe
 Centro de Ciências Biológicas e da Saúde
 Departamento de Fisiologia
 Matéria de Ensino: Bioquímica
II. Tema Central: Enzimas
III. Duração: 4 horas aulas
IV. Estratégia: Aula Expositiva
V. Meta
Apresentar a estrutura e a função biológicas das enzimas, bem como os fatores que interferem nas reações enzimáticas.
VI Objetivos específicos
Ao final dessa aula você será capaz de:
6.2.1 Diferenciar catalisador químico de catalisador biológico
6.2.2 Reconhecer as propriedades das enzimas que fazem delas catalisadores únicos
6.2.3 Classificar as enzimas com base no tipo de reação catalisada
6.2.4 Descrever o papel do catalisador na atividade catalítica
6.2.5 Avaliar o efeito da concentração do substrato na catálise enzimática
6.2.6 Conceituar KM
6.2.7 Avaliar os efeitos da temperatura e do pH na catálise enzimática
6.2.8 Descrever a especificidade enzimática
6.2.9 Descrever os modelos chave fechadura e ajuste induzido da enzima ao substrato
6.2.10 Definir e classificar inibição enzimática
6.2.11 Descrever e exemplificar inibição irreversível
6.2.12 Descrever e exemplificar inibição reversível competitiva
6.2.13 Descrever e exemplificar inibição reversível não competitiva
6.2.14 Descrever e classificar enzimas reguladoras
6.2.15 Descrever as propriedades das enzimas alostéricas
6.2.16 Descrever as propriedades das enzimas reguladas covalentes
6.2.17 Definir zimogênios e descrever a sua formação
VII Conteúdo Programático:
7.1 Catalisadores químicos e biológicos
7.2 Alguns conceitos importantes
7.3 Classificação das enzimas
7.4 O papel do catalisador
7.5 Efeito da concentração do substrato na catálise enzimática
7.6 O significado do termo KM
7.7 Efeitos da temperatura e do pH na catálise enzimática
7.8 Especificidade enzimática
7.8.1 O modelo Chave fechadura
7.8.1 O modelo do Ajuste induzido da enzima ao substrato
7.9 Estrutura do sítio ativo
7.10 Inibição enzimática
7.10.1 Inibição enzimática irreversível
7.10.1 Inibição enzimática reversível
7.11 Enzimas reguladoras
7.11.1 Enzimas reguladas não covalentemente ou alostéricas
7.11.2 Enzimas reguladas covalentemente
7.12 Zimogênios
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 Capítulo 10
Enzimas
1. Introdução
Uma das funções mais notáveis de algumas proteínas globulares é a propriedade de poderem atuar como enzimas. As enzimas são os catalisadores biológicos, apresentando atividade catalítica, ou seja, aumentam a velocidade de reações químicas. Todos os seres vivos utilizam a energia dos nutrientes para manter os seus processos vitais, como por exemplo, a produção de energia na célula requer a participação de um número bastante elevado de enzimas. As enzimas são catalisadores específicos tanto para seus substratos (a molécula que vai sofrer a reação química) como para o tipo de reação efetuada sobre o substrato. Essa especificidade inerente da enzima se deve a ela apresentar uma cavidade ou fenda para ligação do substrato, denominada sítio ativo. O sítio ativo é um arranjo de grupos químicos das cadeias laterais de aminoácidos, localizado na sua superfície globular. Os substratos se ligam a grupos químicos da cadeia lateral dos aminoácidos por interações não covalentes. 
A maioria das enzimas é proteína globular, excetuando-se as ribozimas, que são enzimas de ribonucleotídeos, as unidades fundamentais do RNA. As ribozimas catalisam apenas reações químicas envolvidas no processamento do RNA. As enzimas são os catalisadores mais notáveis, sendo suas propriedades catalíticas incomparáveis, como descritas abaixo:
1.1 Catalisam reações nas condições do ambiente celular. As enzimas são capazes de acelerar velocidades de reações nas condições do ambiente celular, ou seja, a uma temperatura de 37oC e pH de 7,4. Os catalisadores químicos, por sua vez, como platina e níquel só atuam sob condições de valores extremos de temperatura, pressão e pH, condições essas que seriam incompatíveis com o ambiente celular. 
1.2 Apresentam especificidade por seu substrato. Uma enzima geralmente catalisa uma única reação química ou um conjunto de reações intimamente relacionadas. As reações catalisadas pelas enzimas não levam à formação de subprodutos (ou contaminantes). Isso se deve à especificidade extraordinária que elas apresentam por seus substratos, chegando muitas vezes a diferenciar até mesmo moléculas muito parecidas, como os isômeros ópticos (propriedade estereoespecífica). As enzimas apresentam especificidade para o seu substrato porque se liga a eles, formando complexos. Na estrutura das proteínas somente os aminoácidos com configuração absoluta L podem entrar em sua formação. Essa propriedade das enzimas, de poder discriminar moléculas de acordo com a sua forma é denominada estereoespecifidade. As enzimas são estereoespecíficas por que o seu sítio ativo é assimétrico, uma vez que é formado por L-aminoácidos.
Se o exemplo anterior demonstra a situação de enzimas que apresentam uma especificidade absoluta por seus substratos, por outro lado, há enzimas que podem aceitar mais de um substrato, como a desidrogenase alcoólica, enzima que metaboliza os alcoóis na célula. Tanto o metanol como o etanol são substratos dessa enzima, isso ocorre porque esses compostos apresentam um grupo químico comum, a hidroxila (OH), podendo desta forma, ser reconhecido pela enzima. Essas enzimas apresentam especificidade relativa por seus substratos. Por sua vez, os catalisadores químicos não demonstram especificidade por seus substratos.
1.3 Apresentam alto poder catalítico. As enzimas podem acelerar velocidade de reações químicas multiplicando-a por fatores de 1017. Na ausência de enzimas, a maioria das reações biológicas seria tão lenta, que não ocorreria nas condições de temperatura e pH das células (Tabela 1). Por exemplo, a reação de hidratação do dióxido de carbono (CO2,) formando o ácido carbônico (H2CO3) na célula, pode ocorrer sem a presença de enzima, no entanto, essa reação levaria muito tempo para se completar, o que não seria compatível com as necessidades vitais das células. A hidratação do CO2, catalisada pela anidrase carbônica, ocorre a uma velocidade incomparavelmente alta.
1.4 Apresentam regulação de sua atividade catalítica. As enzimas reguladoras (alostéricas e as enzimas reguladas covalentemente) têm suas ações catalíticas reguladas de acordo com as necessidades metabólicas das células. As moléculas que se ligam à estrutura protéica da enzima alostéricas, regulando a sua atividade catalítica são denominados moduladores, efetores ou reguladores. Os moduladores podem ser tanto ativadores quanto inibidores da atividade catalítica.
O termo enzima foi introduzido por Kuhne em 1878 para designar a ocorrência no lêvedo de um princípio químico responsável por sua atividade fermentativa. Em 1828 Berzelius observou a presença de fermentos de ocorrência natural que promoviam reações químicas, antecipando dessa forma o conceito de catalisadores biológicos. Berzelius classificou os fermentos em “organizados” e “não-organizados” com base na ausência ou presença de microorganismos intactos, respectivamente. Kuhne aplicou o termo enzima aos fermentos derivados de extratos de lêvedos, ou seja, “fermentos não-organizados”. Em 1897 Büchner preparou um filtrado de extratos de levedo, primeiro extrato enzimático removido de células vivas, que catalisava as reações de fermentação. A natureza química das enzimas permaneceu controversa. Em 1926 Sumner cristalizou a urease a partir de extratos de feijão, no entanto, a preparação apresentava baixa atividade catalítica, atribuindo-se essa atividade a contaminantes e não à proteína. Willstätter,por outro lado, purificou a peroxidase com elevada capacidade catalítica em preparações puras, ou seja, destituídas de contaminantes protéicos. No início dos anos 30, Northrop e colaboradores cristalizaram a pepsina e a tripsina demonstrando definitivamente a natureza protéica das enzimas.
Tabela .1 Velocidade de reações não−catalisadas e catalisadas por enzimas
	Enzima 
	Não−catalisada (s−1) 
	Catalisada (s−1) 
	Aumento da velocidade 
	Anidrase carbônica 
	1,3 x 10−1 
	1.000.000 
	7,7 x 106
	Adenosina−deaminase
	1,8 x 10−10 
	370 
	2,1 x 1012
	Nuclease estafilocócica 
	1,7 x 10−13 
	95 
	5,6 x 1014
	Triose−fosfato−isomerase 
	4,3 x 10−6 
	4.300 
	1,0 x 109
	Quimotripsina 
	1,0 x 10−9 
	190 
	1,7 x 1011
	Orotidina−descarboxilase
	2,8 x 10−16 
	39 
	1,4 x 1017
2. Cofatores e coenzimas
Algumas enzimas requerem moléculas de natureza química orgânica ou inorgânica para exercer suas atividades catalíticas denominadas cofatores. Os cofatores se ligam transitória e frouxamente ao sítio ativo da enzima (por meio de interações químicas não covalentes), como também podem se ligar permanentemente (por ligação covalente). Nem toda enzima requer um cofator para exercer a sua atividade catalítica, exemplo desta classe são as enzimas ribonuclease, tripsina, quimotripsina, etc. 
Os cofatores inorgânicos são normalmente íons metálicos, como Fe2+, Cu2+, Zn2+ (Tabela 2). O cofator orgânico é denominado coenzima (Tabela 2). Essas enzimas que requerem cofatores são as enzimas conjugadas. A porção protéica da enzima conjugada é a apoproteína ou apoenzima. Quando o cofator se liga firme e permanentemente ao sítio ativo da enzima é denominado grupo prostético. Exemplo: o grupo heme da hemoglobina. Desta forma, a enzima conjugada cataliticamente ativa, ou seja, ligada ao seu cofator é denominada holoenzima.
Tabela 2: cofatores metálicos
	Cofator 
	Enzima 
	Zn2+
	Anidrase carbônica
carboxipeptidase
	Mg2+
	hexocinase
	Ni2+
	urease
	Mo
	Nitrato redutase
	Se
	Glutationa peroxidase
	Mn2+
	Superóxido dismutase
	K+
	Propionil-CoA -carboxilase
A Tabela 3 lista exemplos das coenzimas mais comuns nas reações catalisadas por enzimas, bem como o tipo de grupo químico que elas transferem. As coenzimas são derivadas de vitaminas, que são moléculas orgânicas essencias, devendo por tanto ser obtidas da alimentação.
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Tabela 3: Vitaminas e Coenzimas
	Vitamina
	Coenzima
	Grupo químico transferido
	Tiamina (B1)
	Tiamina pirofosfato
	Aldeídos
	Riboflavina (B2)
	Flavina adenina dinucleotídeo (FAD)
	Átomos de hidrogênio
	Niacina (B3)
	Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo (NAD)
	Íon hidreto (:H-)
	Pantotenato (B5)
	Coenzima A
	Grupo acila
	Piridoxina (B6)
	Piridoxal-fosfato
	Grupo amino
	Vitamina B12
	5(-Desoxiadenosilcobalamina (coenzima B12)
	Átomos de hidrogênio e unidade de carbono
	Biotina (vitamina H)
	Biocitina
	CO2
	Ácido Fólico
	Tetraidrofolato
	Unidade de carbono
3. Nomenclatura e classificação das enzimas
A União Internacional de Bioquímica e Biologia Molecular (IUBMB) adotou um sistema racional e prático de nomenclatura identificando as enzimas em seis classes, de acordo com a natureza da reação química que catalisam. Para cada enzima, são atribuídos dois nomes e um número de classificação de quatro dígitos que identificam as classes, as subclasses e as sub-subclasses. Na classificação internacional sistemática as enzimas são agrupadas em seis classes segundo o tipo de reação catalisada: oxirredutases, transferases, hidrolases, liases, isomerases e ligases. 
3.1 Oxirredutases. Catalisam reações de óxido-redução. Essa classe é subdivida em várias subclasses como, por exemplo:
Desidrogenases. Catalisam reações de óxido redução removendo elétrons na forma de um íon hidreto de seus substratos;
Redutases. Catalisam reações de redução, ou seja, adiciona átomos de hidrogênio ao substrato
Oxigenases. Catalisam a adição do oxigênio molecular ao substrato.
Transferases. São enzimas que catalisam reações de transferência de grupos, como por exemplo:
Transaminases ou aminotransferases. Transferem grupos amino de um aminoácido para um cetoácido.
Quinases ou cinases. Transferem um grupo fosfato de um composto fosforilado, como o ATP, para seus substratos.
Hidrolases. São enzimas que catalisam reações de hidrólise, como por exemplo:
Hidroxilases – adicionam um átomo de oxigênio do O2 no substrato, produzindo um grupo hidroxila (OH).
Glicosidases. Hidrolisam ligações glicosídicas, ligações covalentes que unem os monossacarídeos 
Peptidases. Hidrolisam ligações peptídicas.
Liases. Catalisam reações de adição de grupos químicos a duplas ligações ou retiram esses grupos, 	produzindo duplas ligações.
Isomerases. Catalisam reações que levam a formação de isômeros.
Ligases. Catalisam reações em que há formação de ligações covalentes C-C, C-S, C-O e C-N 	acopladas à 	energia de hidrólise de compostos do tipo nucleotídeo trifosfato como ATP, ou de 	outros compostos ricos em energia que não nucleotídeos trifosfatos.
Como exemplo do sistema de classificação adotada pela IUBMB temos a enzima glicose-6-fosfatase (nome trivial), cujo nome sistemático é D-Glicose−6−fosfato fosfohidrolase e número de classificação EC 3.1.3.9. A sigla “EC” é a abreviatura de Enzyme Comission. 
O primeiro número indica a classe a que a enzima pertence, sendo o número 3 indicativo da classe das hidrolases; 
O segundo número indica a subclasse (o número 1 indica que essa hidrolase atua sobre ligações éster);
O terceiro número indica a sub-subclasse (o número 3 indica fosforil monoéster hidrolase);
O número 9 indica seu número de série dentro da sub-subclasse . 
Muitas enzimas são ainda designadas em livros textos de bioquímica por seu nome trivial, cuja regra na maioria dos casos é feita de duas formas a saber:
a) Pela adição do sufixo -ase ao nome do substrato sobre os quais elas atuam; por exemplo, a enzima que hidrolisa a uréia é denominada urease; o amido, a amilase; ésteres do fosfato, as fosfatases. Outras são designadas pelo tipo de ação catalítica que realizam, tais como, anidrase carbônica; D-amino oxidase; lactato desidrogenase. Algumas levam nomes vulgares como a tripsina, pepsina, emulsina, etc.
b) Pela designação de nomes comuns, como os das proteínas, que se caracteriza pela terminação ina, como: tripsina, pepsina, emulsina, etc. 
4. O papel do catalisador na reação química
Uma reação química, tal como A(P, somente ocorrerá no sentido de formação do produto P, se uma determinada fração das moléculas de A, em qualquer instante considerado, possuir energia suficiente para ser levada ao topo da colina de energia, o estado de transição (Figura 1). A quantidade de energia necessária para que isso ocorra é denominada energia de ativação. 
No estado de transição há igual probabilidade dos reagentes formarem os produtos da reação, ou retornarem à condição inicial. Para reações reversíveis como A ((P podemos fazer as observações seguintes: 
1 Se a reação se dá no sentido de formação do produto P, diz-se que ela é energeticamente favorável, portanto, exotérmica. As reações exotérmicas liberam calor. 
2. Se a reação ocorre no sentido de formação de A, diz-se que ela é energeticamente desfavorável, portanto, endotérmica e para que ela ocorra é necessária a adição de energia. Os valores de variação de energia (G) das reações exotérmicas são negativos e os das reações endotérmicas são positivos (Tabela 4). 
A velocidade de qualquer reação química é proporcional à concentração de reagentes no estado de transição. Portanto, a velocidade de uma reação química será muito alta se uma grande fração das moléculas de reagentes estiver no estado de transição, mas essa velocidade será muito baixa se apenas uma pequena fração de reagentes estiver no estado de transição.
A velocidade de uma reação química pode ser acelerada pela elevação da temperatura da reação. Issoprovoca um aumento da energia cinética das moléculas, resultando em colisões freqüentes entre elas, o que faz com que grande parte delas possua energia interna suficiente para alcançar o estado de transição. Geralmente a velocidade de uma reação dobra quando a temperatura sobe a cada 10 OC. A velocidade de uma reação pode ser aumentada também pela adição de um catalisador, que direciona as reações, por uma via de mais baixa barreira energética de ativação. Desta forma, os catalisadores diminuem a energia de ativação das reações, permitindo que uma fração muito maior de moléculas de uma dada reação forme produtos por unidade de tempo (Figura 1). 
Figura 1:Variação de energia livre ((G) e a energia de Ativação ((G≠) de reações catalisadas e não catalisadas
Os catalisadores aumentam a velocidade de uma reação química diminuindo a energia de ativação. Eles não são transformados ou consumidos na etapa final, nem modificam os parâmetros termodinâmicos da reação como a constante de equilíbrio (Keq) e a variação de energia livre da reação ((G). A Energia Livre de Gibbs (G) é a forma de energia que realiza trabalho sob temperatura e pressão constantes. Como as reações das células ocorrem num ambiente de temperaturas e pressão constantes, diz-se que a energia livre é a energia das reações celulares. A Energia Livre de Gibbs padrão (Go) é a energia das células em que reagentes estão em concentrações padrões, ou seja, 1M, temperatura a 25oC, pressão de 1 atm e pH 7,0. A variação da energia livre padrão de Gibbs é representada por ((Go). A constante de equilíbrio (keq) mede a concentração de reagentes e produtos quando a reação atinge o equilíbrio. A relação entre a constante de equilibro (Keq) de uma reação e a variação da energia livre padrão de Gibbs ((Go) é destacada na Tabela 4.
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Tabela 4. Relação entre (Go e Keq a 25º C.
	Keq
	K’Cal mol -1
	Quanto à energia da reação
	10-5
	+ 6,82
	Endergônica
	10-4
	+ 5,46
	Endergônica
	10-3
	+ 4,09
	Endergônica
	10-2
	+ 2,73
	Endergônica
	10-1
	+ 1,36
	Endergônica
	1
	0
	
	10
	-1,36
	Exergônica
	102
	-2,73
	Exergônica
	103
	-4,09
	Exergônica
	104
	-5,46
	Exergônica
	105
	-6,82
	Exergônica
5 Mecanismos catalíticos
As reações químicas envolvidas na transformação dos substratos variam com os mecanismos de ação das enzimas. Os principais tipos de mecanismos catalíticos que as enzimas utilizam são: (1) efeitos de proximidade e orientação, (2) catálise eletrostática, (3) catálise ácido básica e (4) catálise covalente.
5.1 Efeitos de proximidade e orientação. Os substratos se aproximam dos grupos funcionais catalíticos da enzima em uma orientação espacial apropriada para que a reação possa ocorrer. Após o correto posicionamento do substrato, uma modificação na conformação da enzima resulta em um complexo enzima substrato orientado. Essa orientação leva o complexo enzima substrato ao estado de transição.
5.2 Catálise por íons metálicos. A força das interações eletrostáticas está relacionada com a capacidade das moléculas solventes vizinhas em reduzir os efeitos de atração entre os grupos químicos. Como a água é excluída do sítio ativo quando o substrato se liga, a constante dielétrica local é muitas vezes baixa. A distribuição de cargas nos sítios ativos das enzimas pode influenciar a reatividade química do substrato. Uma ligação mais eficiente do substrato reduz a energia livre do estado de transição, que acelera a reação.
5.3 Catálise ácido-básica geral. Os grupos químicos podem se tornar mais reativos pela adição ou remoção de prótons. Os sítios ativos das enzimas contêm cadeias laterais que podem atuar como doadores ou receptores de prótons. Esses grupos são denominados ácidos gerais ou bases gerais. Por exemplo, a cadeia lateral da histidina (grupo imidazol) muitas vezes atua como catalisador ácido ou básico porque apresenta pKa na faixa de pH fisiológico.
5.4 Catálise covalente. Acelera a velocidade da reação pela formação de uma ligação covalente transitória entre a enzima e o substrato. Um grupo nucleofílico da cadeia lateral do catalisador forma uma ligação covalente instável com um grupo eletrofílico do substrato. O complexo enzima-substrato então forma o produto.
6. Cinética enzimática
A cinética é a parte da enzimologia que trata do estudo da velocidade das reações. Uma reação enzimática ocorre com a ligação do substrato (S) ao sítio ativo de uma enzima (E), formando um complexo enzima-substrato (ES), numa etapa cuja reação é rápida e reversível. O complexo ES se dissocia posteriormente formando o produto da reação e a enzima é liberada conforme demonstra a equação abaixo:
Em que:
k1 = constante de velocidade para a formação do complexo enzima substrato (ES)
k2 = constante de velocidade para a dissociação de ES , liberando o produto (P) da reação 
k3 = constante de velocidade para a dissociação de ES em enzima livre (E) e substrato (S).
Em 1913 Leonor Michaelis e Maud Menten estabeleceram a relação quantitativa entre a velocidade de reação enzimática e a concentração do substrato por meio da equação matemática denominada equação de Michaelis-Menten. No desenvolvimento da equação deve-se supor que:
 a) A constante de velocidade (k2) é negligenciável quando comparada a constante k1 e 
 b) A velocidade de formação do complexo ES é igual a velocidade de sua degradação não sofrendo alterações durante a medida da velocidade (postulado do estado estacionário):
A velocidade de formação de ES é igual a k1[E] [S], enquanto a velocidade de dissociação de ES é igual a (k2 + k3)[ES]. O postulado do estado estacionário iguala essas duas velocidades:
Michaelis e Menten introduziram uma nova constante, denominada constante de Michaelis e Menten (Km)
Dessa forma , a velocidade da reação em função da concentração do substrato pode ser obtida a partir dos dados da equação 6.5:
A equação de Michalis-Menten relaciona a velocidade inicial (νo) de uma reação enzimática à concentração do substrato [S]. A velocidade máxima (Vmax), obtida em condições de saturação da enzima, e a constante de Michalis-Menten (Km) são próprias de cada enzima, sob condições específicas de pH e temperatura. Para aquelas, onde k3<<k2, a Km torna-se a recíproca da constante de ligação enzima-substrato:
e a Vmax reflete a fase catalítica do mecanismo enzimático conforme sugere a equação 6.5. A atividade enzimática distingue duas fases: inicialmente a ligação do substrato seguida por sua transformação química. Se for permitido à velocidade inicial de reação, ν0, ser igual a metade da velocidade máxima (v0 = ½ Vmax) na equação 6.7, o Km será igual a [S]:
Dividindo por Vmax, obtém-se
Reorganizando a equação:
6.1 Conceito da constante de Michaelis-Menten (KM)
Desta forma, a Km é definida como sendo a concentração do substrato (mol por litro) na qual a velocidade inicial da reação é metade da velocidade máxima.
Ou seja, na concentração de substrato em que [S] = Km, a equação de Michaelis-Menten torna-se ν0 = Vmax/2. A concentração da enzima não afeta o valor do Km.
Figura 2 Determinação do Km pelo gráfico de velocidade inicial (v0) versus concentração do substrato, [S]. 
6.2 Significado da constante de Michaelis-Menten (KM)
O conhecimento do valor da constante de Michelis-Menten (KM) das enzimas é de grande importância uma vez que a partir dele podemos tirar várias informações sobre a reação catalisada, tais como:
A constante KM estabelece um valor aproximado da concentração intracelular do substrato, tendo em vista que ela mede a concentração de substrato que leva uma enzima a produzir metade de sua velocidade máxima. Portanto, é improvável que a sua concentração seja significativamente maior ou menor do que a KM.
A constante de Michaelis-Menten indica a afinidade da enzima por seus substratos, de maneira que o substrato que apresentar o menor valor de KM terá uma maior afinidade pela enzima. Os substratoscom um KM elevado apresentarão uma baixa afinidade pelo substrato. A Tabela 5 mostra o exemplo de duas enzimas, hexocinase e quimotripsina, que têm mais de um substrato. O substrato que apresenta uma maior afinidade pela enzima hexocinase é a glicose, já a frutose é o de menor especificidade. Para a enzima quimotripsina, o substrato N-Benzoiltirosinamida apresenta uma maior afinidade do que o tripeptídeo Gliciltirosinilglicina.
Tabela 5. Valores de KM de algumas enzimas
	Enzimas
	Substratos
	KM, mM
	
Hexocinase
	ATP
	 0,4
	
	Glicose
	0,05
	
	Frutose
	1,5
	Quimotripsina
	Gliciltirosinilglicina
	108
	
	N-Benzoiltirosinamida
	2,5
6.3 Constante catalítica (kcat)
As enzimas nas células e fluídos do corpo normalmente não atuam em condições de saturação do substrato. Para avaliar a eficiência catalítica de uma enzima, define-se a constante catalítica, kcat também conhecida como número de reciclagem (turnover number):
O kcat representa o número de moléculas de substrato convertidos em produto por segundo por molécula de enzima (ou por mol de sítio ativo nas enzimas oligoméricas) sob condições de saturação. Em outras palavras, o Kcat indica o número máximo de moléculas convertidas em produto por segundo por cada sítio ativo. [E] total = concentração total da enzima (Tabela 6).
 Tabela 6 Constantes catalíticas (kcat) de algumas enzimas
	Enzima 
	Kcat (s−1) 
	Nuclease estafilocócica 
	95 
	Citidina deaminase 
	299 
	Triose fosfato isomerase 
	4.300 
	Ciclofilina
	 13.000 
	Cetoesteróide isomerase 
	66.000 
	Anidrase carbônica 
	1.000.000 
6.4 Gráfico de Lineweaver-Burk
Os valores do Km e da Vmax de uma enzima são determinados pela medida das velocidades iniciais para várias concentrações de substrato. Pela construção do gráfico mostrado na Figura 2 só é possível calcular valores aproximados de Km e da Vmax. A determinação mais acurada desses valores é possível pela modificação algébrica da equação de Michaelis-Menten:
Utilizando o inverso da equação de Michaelis Menten obtemos:
A representação gráfica da recíproca de velocidade inicial, 1/ν0, versus a recíproca da concentração do substrato, 1/ [S], fornece uma linha reta com inclinação Km/Vmax em um gráfico duplo-recíproco ou Lineweaver-Burk. O ponto onde essa linha intercepta a ordenada é igual a 1/Vmax, e o ponto de intersecção na abscissa é igual a-1/Km (Figura 3). A utilização do gráfico permite calcular com precisão Vmax e Km pela medida da inclinação e do intercepto.
Figura 3. Determinação da Vmax e Km a partir do gráfico duplo-recíproco de Lineweaver-Burk. O gráfico 1/ν0 versus 1/[S] derivado de medidas das velocidades iniciais em várias concentrações diferentes de substratos. A linha reta obtida pela ligação de pontos individuais é ampliada para interceptar a ordenada e abscissa. Os valores de Km e Vmax são determinados pela medida das inclinações e intersecções.
7. Efeito do pH na atividade enzimática
A maioria das enzimas apresenta um valor de pH característico em que a sua atividade catalítica é máxima (Figura 4), valor de pH esse denominado pH ótimo. Acima ou abaixo desse valor de pH a atividade catalítica é diminuída. As curvas de variação da atividade das enzimas em diferentes valores de pH refletem o pH no qual importantes grupos doadores ou receptores de prótons no sítio catalítico estão em seus estados de ionização adequados.
Figura 4: Efeito do pH na atividade enzimática. Essa curva demonstra o efeito do pH na atividade enzimática da enzima tripsina, pepsina, papaína e acetilcolinesterase, que apresentam pH ótimo de 8,0, 2,0, 8,0 e 10, respectivamente. Essas enzimas apresentam ainda atividade catalítica em faixa de valores de pH em torno do ótimo, mas essa atividade é um pouco mais baixa do que elas teriam no pH ótimo. 
O pH ótimo de uma enzima não é necessariamente idêntico ao pH do meio em que normalmente ela se encontra; esse pode estar um pouco acima ou abaixo do valor do pH ótimo. Variações bruscas de pH, tanto para valores ácido como alcalino, podem causar a desnaturação da enzima com conseqüente perda da sua atividade biológica. A tabela 7 apresenta valores de pH ótimo de algumas enzimas.
Tabela 7: Valor de pH ótimo de algumas enzimas
	Enzima
	pH Ótimo
	Pepsina
	1,5
	Tripsina
	7,7
	Catalase
	7,6
	Arginase
	9,7
	Fumarase
	7,8
	Ribonuclease
	7,8
8. Efeito da temperatura na atividade enzimática
A velocidade das reações catalisadas por enzima aumenta com a temperatura, dentro de determinada faixa na qual a enzima é estável e mantém a atividade catalítica integral. A velocidade da maioria das reações enzimáticas duplica para cada elevação de 10o C em temperatura. A razão de aumento na atividade catalítica a cada valor de 10º C, numa faixa em que a enzima ainda é estável, ou seja, apresenta atividade enzimática é denominada Q10. O Q10 para a maioria das enzimas é igual a 2. Mesmo que as reações catalisadas por enzimas pareçam muitas vezes apresentar uma temperatura ótima (Figura 5), o pico desse gráfico de atividade catalítica contra a temperatura ocorre desta forma porque as enzimas, sendo proteínas, são desnaturadas pelo calor e se tornam inativas à medida que a temperatura é elevada. O “ótimo” de temperatura é assim resultante de dois processos:
1- o aumento usual na velocidade de reação com a temperatura e 
2- o valor crescente de desnaturação térmica da enzima acima de uma temperatura crítica.
A maioria das enzimas é inativa a temperaturas acima de 55o C, outras são bastante estáveis e mantêm a atividade a temperaturas muito mais elevadas, como por exemplo, as enzimas de várias espécies de bactérias termofílicas (que habitam as fontes de água quente). As enzimas dessas bactérias são ativas a temperaturas tão elevadas quanto 85o C. A taq-polimerase, uma enzima obtida de bactérias termofílicas é utilizada em técnicas de Biologia Molecular, para amplificar moléculas de DNA. Algumas enzimas, como a ribonuclease, perdem sua atividade pelo aquecimento, mas podem recuperá-la com o abaixamento da temperatura. 
Figura 5: Curva de atividade enzimática das enzimas em função da temperatura
9. Especificidade enzimática
Algumas enzimas apresentam especificidade quase absoluta para um dado substrato, não permitindo a ligação em seu sítio ativo nem mesmo moléculas bastante semelhantes, como estereoisômeros. Um bom exemplo disso é a enzima aspartase, encontrada em muitas plantas e bactérias. Essa enzima catalisa a adição reversível de íon amônio (+NH4) à dupla ligação do ácido fumárico, produzindo o L-aspartato (Figura 6a). Entretanto, a aspartase não promove a adição de íon amônio a nenhum outro ácido insaturado (ou seja, que apresenta dupla ligação). A aspartase tem rígida especificidade por seu substrato: ela não aceita o D-aspartato como substrato nem o maleato, que é o isômero cis do fumarato (Figura 6b).
9.1 Especificidade absoluta. A aspartase apresenta tanto especificidade óptica por seu substrato, reconhecendo diferenças entre as formas D- e L- dos aminoácidos, quanto especificidade geométrica, discriminado as forma trans e cis, fumarato e maleato, respectivamente. Portanto, podemos dizer que a aspartase é uma enzima estereoespecífica, ou seja, apresenta a propriedade estereoespecífica (ou estereoespecificidade), que é a de reconhecer moléculas de acordo com as suas formas.
Figura 6: Especificidade absoluta da enzima por seu substrato. (a) Reação catalisada pela enzima aspartase, uma liase, que adiciona grupo amino a dupla ligação do fumarato produzindo o L-aspartato. Na reação reversa, ela retira o íon amônio (+NH4), produzindo o fumarato. (b) Isômeros do L-Aspartato e Fumarato, D-aspartato e Maleato, respectivamente
9.2 Especificidade relativa. Por outro lado, as enzimas que apresentam especificidade relativamente ampla por seus substratos reconhecem grupos químicos comuns encontrados em suas estruturas. A quimotripsinaé uma enzima desta classe, ela catalisa a hidrólise de muitos peptídeos ou polipeptídios diferentes (Figura 7) atuando em ligações peptídicas formadas a partir do grupo carbonila dos aminoácidos aromáticos (fenilalanina, tirosina e triptofano). Outro exemplo é dado pela hexocinase, uma enzima da via glicolítica, que atua fosforilando hidroxilas de monossacarídeos como glicose e frutose.
Figura 7: Especificidade relativa da enzima por seu substrato. O exemplo da quimotripsina
9.1 Modelos que explicam a relação enzima-substrato
O alto grau de especificidade da enzima por seu substrato levou Emil Fischer em 1894 a propor um modelo que explicasse a ligação do substrato ao sítio ativo da enzima, esse modelo hipotético foi denominado “encaixe chave-fechadura”, que considera que a enzima possui uma região, chamada sítio ativo, complementar em tamanho, forma e natureza química à molécula do substrato, proporcionando, assim, um encaixe perfeito entre a enzima, a fechadura; e o substrato, a chave (Figura 8). Esse modelo não é suficiente para explicar a relação da enzima com o seu substrato por que as estruturas tridimensionais das enzimas não são estáticas como uma fechadura, mas sim, dinâmicas, podendo sofrer mudanças conformacionais quando na interação com o substrato. 
Daniel E. Koshland propôs em 1958 um novo modelo para explicar o encaixe da enzima ao seu substrato, modelo esse denominado “ajuste induzido”. Para o modelo do ajuste induzido o sítio ativo não precisa preexistir sob uma forma geométrica rígida como no modelo chave fechadura. O sítio ativo se apresenta como um arranjo espacial preciso e específico dos grupamentos R dos aminoácidos, arranjo esse que é induzido pelo contato do sítio ativo com o substrato. Desta forma uma vez que o substrato interaja com a cadeia polipeptídica da enzima, induz nela uma mudança conformacional. Ao se distorcer a enzima induz também uma mudança na estrutura do substrato, para que ele possa se ajustar adequadamente ao seu sítio ativo (Figura 8).
Figura 8: Relação do encaixe do substrato à enzima substrato de acordo com os modelos chave-fechadura e do ajuste da enzima ao substrato.
9.2. Estrutura do sítio ativo das enzimas
O substrato deve ser capaz de se ligar de forma específica à enzima que, por meio desta interação, facilita a transformação do substrato em produto. Dessa forma, a estrutura do catalisador deve favorecer o conjunto de interações que permitem a ligação do substrato expondo grupos químicos capazes de interagir entre si formando, transitoriamente, um complexo enzima-substrato [ES]. O sítio ativo da enzima é uma fenda (sulco) tridimensional localizada na superfície da enzima. O sítio ativo é formado por grupos da cadeia lateral dos aminoácidos, distantes entre si na seqüência primária da enzima, mas que se aproximam com o enovelamento da cadeia polipeptídica. 
O sítio ativo de uma enzima ocupa somente uma pequena parte da molécula de enzima. De fato, deve existir somente em torno de uma dúzia de resíduos de aminoácidos envolvidos na formação do sítio ativo e, desses, apenas dois ou três podem realmente participar da ligação com substrato. Esses resíduos de aminoácidos que participam diretamente da catálise denominam-se grupos catalíticos. 
Então, qual é a lógica molecular que explica o fato das enzimas serem proteínas grandes e não moléculas pequenas como di e tripeptídeos? Se considerarmos que dois ou três grupamentos R cruciais devem se justapor perfeitamente num espaço tridimensional, um peptídeo pequeno, linear, pode conter todos os grupos fundamentais nessa ligação do substrato ao sítio ativo da enzima. No entanto as distâncias fixas das ligações e dos ângulos não permitiriam que os grupamentos R nesse dipeptídeo assumissem a relação espacial necessária. Assim, uma proteína grande composta de centenas de resíduos de aminoácidos pode se curvar, torcer e se enrolar sobre si mesma e, portanto, fixar exatamente a posição dos grupamentos R no espaço. 
Os outros resíduos de aminoácidos (não catalíticos) têm função igualmente importante, como a de manter a estrutura terciária da enzima. E a manutenção dessa estrutura terciária ocorre através das ligações não covalentes como: pontes de hidrogênio, ligação iônica, interação hidrofóbica e a ligação covalente: ponte dissulfeto (S-S). O substrato liga-se ao sítio ativo da enzima, região em que ocorrerá a reação. É nesse sítio, também, que estão os resíduos de aminoácidos, bem como os cofatores e coenzimas que diretamente participam da ruptura e estabelecimento de ligações químicas que resultam na formação do produto. 
10. Inibição enzimática
Toda substância que se liga à porção protéica de uma enzima diminuindo sua velocidade de reação é denominada inibidor enzimático. Os inibidores enzimáticos contribuíram no estudo das enzimas permitindo identificar os aminoácidos que participam na formação do sítio ativo, contribuíram também na elucidação de seqüências metabólicas e no esclarecimento do mecanismo de ação de algumas drogas terapêuticas, como por exemplo, o ácido acetilsalicílico, usado como analgésico, é um inibidor irreversível da enzima ciclo-oxigenase. 
Os compostos que apresentam estruturas químicas diferentes do substrato natural e atuam como inibidores de vias metabólicas são denominados antimetabólitos, como as sulfas (a sulfanilamida compete com o ácido p-aminobenzóico vital no crescimento bacteriano), o metotrexato (compete com o diidrofolato e é usado no tratamento da leucemia infantil).
Substratos suicidas (geram uma espécie altamente reativa que reage de forma irreversível com o sítio ativo, exemplo, o Omeprazol usado no tratamento de excessiva acidez estomacal), fluorouracil (inibidor irreversível da timidilato sintetase) e 6−mercaptopurina (compete com a adenina e guanina e é efetiva no tratamento de leucemias infantis).
A inibição enzimática é classificada em irreversível e reversível, classificação essa baseada na natureza química da ligação do inibidor à enzima.
10.1 Inibição irreversível – Na inibição irreversível o inibidor se liga através de ligação covalente ao sítio ativo da enzima impedindo a ligação do substrato. Exemplos: Inibição da enzima acetilcolinesterase por organofosforados como o diisopropilfluorofosfato (DFP), inibição da enzima do transporte de elétrons, citocromo oxidase, por azida e cianeto, etc. 
Inibição da acetilcolinesterase por organofosforados
Os organofosforados inibem a atividade enzimática da acetilcolinesterase, que catalisa a hidrólise da acetilcolina em acetato e colina. A acetilcolina é um neurotransmissor sintetizado pela célula transmissora ou pré-sináptica. Ela é armazenada em vesículas sinápticas até que um potencial de ação leve a uma despolarização da membrana plasmática das células pré-sinápticas. Isto resulta na entrada de Ca2+ seguida pela fusão de vesículas sinápticas com a membrana plasmática. A acetilcolina é liberada na fenda sináptica e se difunde até o receptor, o neurônio pós-sináptico. A acetilcolina se liga ao seu receptor no neurônio pós-sináptico, podendo atuar como um canal catiônico. O receptor sofre uma mudança conformacional logo após se ligar à acetilcolina. Esta mudança na estrutura tridimensional resulta em uma entrada de Na+, que despolariza a membrana plasmática na célula pós-sináptica, desencadeando um potencial de ação. É necessário que a acetilcolina seja removida da fenda sináptica antes que a sinapse seja capaz de responder a outro sinal. Isto requer a ação da acetilcolinesterase, que catalisa a reação abaixo:
Acetilcolina + H2O ----------> acetato + colina 
A colina é absorvida pelas células pré-sinápticas e usada na síntese de mais acetilcolina. O acetato é transportado para outros tecidos e metabolizado. 
O diisopropilfluorofosfato se liga a um resíduo de serina localizado no sítio ativo da enzima acetilcolinesterase (Figura 9). Como essa ligação química é covalente, portanto, forte e duradoura, o inibidor destrói o sítio ativo da enzima, impedindo a ligaçãodo substrato, daí porque essa inibição é irreversível.
Figura 9: Inibição irreversível da enzima acetilcolinesterase pelo diisopropilfluorofosfato
10.2 Inibição reversível. Na inibição reversível o inibidor se liga ao sítio ativo ou a outro domínio na cadeia polipeptídica da enzima, impedindo a transformação do substrato em produto. A ligação do inibidor à enzima ocorre através de uma ou mais interação não covalente como: pontes de hidrogênio, interação hidrofóbica, ligação iônica, van der Walls, dipolo-dipolo. A inibição reversível é de três tipos, a saber: Competitiva, incompetitiva e mista.
10.2.1 Inibição competitiva. Como o inibidor se assemelha ao substrato, ele pode se ligar ao sítio ativo da enzima, impedindo a ligação do substrato. Exemplo: Inibição da desidrogenase succníca pelo malonato (Figuras 10a e 9b), a inibição da acetilcolinesterase por carbamatos. A reação abaixo descreve a ação catalítica da enzima desidrogenase succínica sobre o seu substrato, o succinato.
O succinato (Figura 10b), um ácido orgânico que apresenta dois grupos carboxilatos (COO-), se liga ao sítio ativo da desidrogenase succínica através de ligação iônica. Essa ligação se faz com a atração das cargas negativas dos carboxilatos e a carga positiva, dos íons amônio (+NH3). Os aminoácidos com cadeia lateral com cargas positivas são os aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina). 
O malonato e o oxaloacetato, inibidores competitivos dessa enzima, apresentam estruturas químicas semelhantes a do succinato (Figura 10b). O malonato se liga ao sítio ativo através de ligação iônica. Este exemplo explica como o conhecimento desse inibidor permitiu mapear o sítio ativo da enzima desidrogenase succínica. Assim, se tanto o substrato como os inibidores dessa enzima apresentam carga negativa no pH 7,0 (conferida pelos grupos COO-), é indicativo de que o sítio ativo dessas enzimas deve conter aminoácidos com carga positiva (aminoácidos básicos). Dessa forma, os substratos e inibidores com carga negativa (COO-) interagem com os aminoácidos básicos do sítio ativo dessa enzima por formação de ligação iônica. 
A inibição competitiva é revertida aumentando-se a concentração do substrato, dessa forma o substrato irá competir com o inibidor pela ligação ao sítio ativo da enzima. O inibidor competitivo aumenta o KM mas não interfere no valo da Vmax (Figuras 11a e 11b).
Figura 10 a ) Inibição reversível da enzima desidrogenase succínica pelo malonato. b) Estruturas químicas do succinato, malonato e oxaloacetato. c) Representação esquemática da inibição competitiva.
Figura 11. a) Representação esquemática da inibição competitiva. O Complexo ES representa a enzima ligada ao seu substrato e EI, a enzima ligada ao seu inibidor competitivo. b) Gráfico Lineweaver-Burk para uma inibição competitiva. I representa o Inibidor, [I] concentração molar do inibidor e +2 [I] concentração do inibidor aumentada de suas vezes
�
10.2.2 Inibição incompetitiva
Nessa inibição o inibidor se liga apenas ao complexo ES da enzima originando um complexo inativo, ESI. O inibidor incompetitivo não se liga com a enzima livre. O esquema abaixo demonstra como ocorre a reação enzimática em presença do inibidor incompetitivo
E + S ( ES + I (EIS  Não há formação de produto
Essa inibição não é revertida pelo aumento na concentração do substrato. Em presença do inibidor incompetitivo verifica-se tanto diminuição do KM quanto da Vmax. (Figura 12).
Figura 12. Gráfico de Michaelis-Menten (à esquerda) e Lineweaver-Burk (à direita) para uma inibição incompetitiva. Ambos os gráficos demonstram que em presença do inibidor incompetitivo tanto a Vmax quanto o KM diminuem.
10.2.3 Inibição Mista 
Na inibição mista o inibidor se liga a uma região da enzima, diferente do sítio ativo, sem interferir na ligação do substrato ao sítio catalítico, como também o substrato não impede a ligação do inibidor. O inibidor pode se ligar tanto a enzima livre [E] quanto ao complexo enzima-substrato [ES], formando [ESI]. O substrato, por sua vez, se liga a [E] e ao complexo enzima-inibidor [EI], contudo, o complexo enzima-substrato-inibidor [ESI] é cataliticamente inativo, ou seja, o substrato não vai ser transformado no produto da reação (Figura 13). São exemplos de inibidores mistos os metais pesados como chumbo (Pb2+), prata (Ag2+), mercúrio (Hg2+), etc, que se ligam a sulfidrila (SH), de resíduos de cisteína.
Figura 13. Representação esquemática da inibição mista. O Complexo ES representa a enzima ligada ao seu substrato; ESI a enzima ligada ao seu inibidor misto e ao seu substrato. Nesta inibição o inibidor se liga a uma região da enzima diferente do sítio catalítico, que é o local de ligação do substrato. A inibição não competitiva pode ser revertida através da diálise da enzima.
Como o inibidor misto se liga a uma porção da cadeia polipeptídica da enzima que não o sítio ativo, a velocidade máxima (vmax) da reação diminui ( por diminuir o número de enzimas ativas). A constante de Michaelis-Menten (KM,) não se altera, pois aumentos na concentração de substrato não revertem essa inibição (Figura 14). 
A inibição mista é revertida por diálise da enzima, ligada ao inibidor. Essa técnica química consiste em utilizar um saco de diálise, cuja membrana porosa permite a passagem em meio aquoso de moléculas pequenas, um inibidor, e retêm as grandes, as enzimas. Cabe ressaltar que esse é um procedimento feito em laboratório, para reverter a inibição de experimentos devidamente planejados.
Figura 13. Gráfico Lineweaver-Burk para uma inibição mista. Em presença do inibidor misto se observa uma diminuição da Vmax e o KM não se altera.
11. Enzimas reguladoras
A regulação das vias metabólicas envolve mecanismos sofisticados e complexos como:
Regulação não covalente ou (controle alostérico). Essa regulação se caracteriza pela ligação não covalente do efetor ou modulador ao sítio regulador das enzimas alostéricas (sítio alostérico ou sítio modulador). O modulador pode ativar ou inibir a atividade enzimática.
Modificação covalente reversível. As propriedades catalíticas de muitas enzimas são alternadas pela ligação covalente de um grupo químico a cadeia polipeptídica ou sítio ativo da enzima. No metabolismo celular é freqüente a regulação de enzimas reguladoras das vias metabólicas por transferência de fosfatos. Essa transferência de fosfatos normalmente é feita do ATP para os sítios ativos de enzimas (fosforilação) ou pela hidrólise desses grupos fosforilados (desfosforilação) dos sítios ativos de enzimas.
Clivagem proteolítica. Nesse mecanismo de controle as enzimas se alternam entre dois estados a saber, inativo (proenzimas ou zimogênios) e enzimas cataliticamente ativas.
Formas múltiplas de enzimas. Esse tipo de regulação se dá por formas múltiplas de enzimas relacionadas denominas isoenzimas ou isozimas. As isozimas são enzimas homólogas dentro de um mesmo organismo que catalisam a mesma reação, mas diferem levemente em suas estruturas e nos valores de seus parâmetros cinéticos como KM e Vmax. 
12. Sistema multienzimático ou via metabólica
Uma via metabólica é uma seqüência de reações químicas em que um grupo de enzimas (sistema multienzimático) atua em conjunto para converter um determinado substrato em um ou mais produtos. Os produtos das ações dessas enzimas do metabolismo são denominados intermediários metabólicos ou metabólitos (Figura 15).
A glicólise anaeróbica (metabolismo da glicose na ausência de oxigênio), que pode ocorrer em células dos músculos e das hemácias, é um exemplo de uma via metabólica. Nessa via metabólica o monossacarídeo glicose, um dos principais substratos dessa via, vai ser transformado em duas moléculas de ácido láctico, sob a ação conjunta de onze enzimas (Estudaremos esse metabolismo com mais detalhes na aula metabolismo aeróbico e anaeróbico dos carboidratos). Normalmente, a primeira enzima de uma via metabólicaé uma enzima reguladora. Em regra, a enzima reguladora que catalisa a reação mais lenta de uma via metabólica é a enzima marca passo. As enzimas marca passos são enzimas reguladoras, sendo classificadas em dois tipos: enzimas alostéricas (ou reguladas de forma não covalente) e enzimas reguladas covalentemente.
A
(E1
B	
(E2
C
(E3
D
(E4
E
(E5
F
(E6
P
Figura 15: Via metabólica. Neste esquema E1 a E6 representam as seis enzimas que catalisam a transformação do substrato A no produto P. As letras B, C, D, E e F representam os intermediários metabólicos.
13. Regulação alostérica ou regulação não-covalentemente 
As enzimas alostéricas são proteínas reguladoras que apresentam um sítio catalítico e um sítio alostérico ou regulador em suas cadeias polipeptídicas. Ao sítio alostérico se liga o efetor ou modulador, que é a molécula que regula a atividade dessas enzimas. Esses dois sítios são localizados em regiões distintas da cadeia polipeptídica, como podem também, estar em domínios separados, ou mesmo em subunidades distintas da proteína. As enzimas alostéricas existem em duas formas: T (Tensa), não ligada ao substrato, e a forma R (Relaxada) ligada ao substrato (Figura 16). As enzimas alostéricas demonstram especificidade tanto para o seu substrato quanto para o modulador. Os moduladores são ativadores ou inibidores da atividade catalítica (Figura 16).
Figura 16. Enzimas Alostéricas. O sítio Catalítico é representado por C e o sítio regulador, por R.
13. 1 Enzimas alostéricas homotrópica e heterotrópica
De acordo com a regulação, as enzimas alostéricas classificam-se em homotrópica ou heterotrópica. Na regulação homotrópica o modulador é o próprio substrato da enzima. Quando o substrato atua como modulador homotrópico ele se liga ao sítio alostérico, regulando assim, a atividade da enzima. O regulador heterotrópico é qualquer substância diferente do substrato. Algumas enzimas alostéricas apresentam ambos os tipos de regulação homotrópica e heterotrópica. 
A enzima hexocinase, que catalisa a fosforilação da glicose produzindo glicose-6-PO4 (Figura 17a) é uma enzima que apresenta tanto a regulação homotrópica quanto a heterotrópica. Na regulação homotrópica, aumentos da concentração de glicose ativam a sua atividade catalítica. Na regulação heterotrópica, o produto de sua ação catalítica, a glicose-6-PO4-, a inibe, sempre que a sua concentração se eleva na célula. 
A enzima fosfofrutocinase, que converte a frutose-6-PO-4 a frutose-1,6-bifosfato apresenta tanto a regulação alostérica homotrópica quanto a heterotrópica (Figura 17b). A fosfofrutocinase é ativada em função da elevação de frutose-2,6-bifosfato, uma molécula diferente do substrato. Por outro lado, elevação da concentração de ATP ou citrato inativa a sua ação catalítica. A ativação da fosfofrutocinase por frutose-2,6-bifosfato e sua inibição por um dos seus substratos o ATP, é regulação do tipo homotrópica. A inibição por elevação da concentração do citrato é do tipo heterotrópica. 
 13.2 Efeito da concentração do substrato na atividade enzimática das enzimas alostéricas
As enzimas alostéricas são enzimas complexas, que possuem duas ou mais cadeias polipeptídicas. Assim, as enzimas alostéricas são proteínas oligoméricas. A curva de velocidade de reação em função do aumento da concentração de substrato para as enzimas do tipo Michaelis-Menten, é uma hipérbole retangular, como pode ser visto na Figura 2. As enzimas alostéricas, por sua vez, descrevem uma curva do tipo sigmóide (Figura 18). Outro aspecto que merece ser destacado sobre as enzimas alostéricas e que a diferenciam das enzimas do tipo Michaelis-Menten, é que a concentração de substrato que corresponde a metade da velocidade máxima das enzimas alostéricas é denominada K0,5.
As enzimas alostéricas apresentam propriedades cooperativas, ou seja, comunicação entre as suas cadeias polipeptídicas. Essa comunicação das cadeias polipeptídicas se caracteriza por uma mudança conformacional da enzima, quando a ela se ligam os seus moduladores. Isto pode ser constatado pelo efeito da concentração do substrato na velocidade da reação. Sob concentrações baixas de substrato, a velocidade da reação vai ser igualmente baixa, aumentos subseqüentes podem elevar a velocidade da reação, multiplicando-a por um fator de 500 vezes a velocidade inicial (Figura 18).
A ligação de um modulador ativador a um sítio regulador pode facilitar a ligação de moléculas de substratos aos outros sítios catalíticos. Essa é a cooperatividade positiva. No entanto, a ligação do modulador inibidor a um sítio regulador, diminuirá a ligação da enzima pelo substrato, verificando-se, portanto, a cooperatividade negativa.
Figura 18. Curva de velocidade das enzimas alostéricas em função da variação da concentração do substrato e efeitos dos moduladores alostéricos heterotrópico positivo (M+) e negativo (M-) na sua curva de saturação. 
13.3 Modelos das enzimas alostéricas
Dois modelos explicam o comportamento cinético das enzimas alostéricas com curvas de saturação sigmóide, o que é reflexo das interações cooperativas entre as subunidades: o modelo de simetria e o modelo seqüencial.
Modelo de simetria. O modelo de simetria foi proposto por Monod, Wynmax e Changuy. Para esse modelo todas as subunidades estão ou no estado T ou no estado R. Essas mudanças são atingidas por uma mudança conformacional num protômero. Quando o substrato se liga a um sítio ativo de um protômero, provoca mudança correspondente em todos os outros protômeros. Os estados T e R estão em equilíbrio. Moduladores positivos e o substrato favorecem o estado R enquanto os moduladores negativos favorecem o estado T.
 Modelo de seqüencial. O modelo seqüencial foi proposto por Koshland, Nemethy e Frymer. Para esse modelo, cada protômero sofre mudança conformacional isoladamente quando da ligação do substrato. A ligação do substrato aumenta a possibilidade de mudança conformacional dos outros protômeros, o que torna mais provável a ligação de uma segunda molécula de substrato.
13.4 Propriedades das enzimas alostéricas
São proteínas oligoméricas, apresentando duas ou mais cadeias polipeptídicas;.
São reguladas pela ligação não covalente do efetor ou modulador ao sítio regulador ou alostérico;
Apresentam curva de saturação pelo substrato do tipo sigmóide;
Apresentam propriedades cooperativas, ou seja, cooperação ou comunicação entre as suas cadeias polipeptídicas;
Não seguem o comportamento cinético descrito por Michaelis-Menten, para as enzimas simples, ou seja, não apresentam curvas de velocidade em função do aumento do substrato do tipo hiperbólico;
A concentração do substrato que corresponde a metade da velocidade máxima é denominada K0,5.
14. Enzimas reguladas covalentemente
Estas enzimas são reguladas pela interconversão de suas formas ativa e inativa, através da ligação covalente de um grupo químico a um átomo ou grupo de átomos da cadeia lateral dos aminoácidos encontrados nos sítios ativos de enzimas. Um exemplo muito importante dessa regulação é o que ocorre com a enzima fosforilase do glicogênio. A fosforilase do glicogênio é uma enzima encontrada em células dos músculos e do fígado, e catalisa a seguinte reação.
(Glicogênio) + Fosfato ( (Glicogênio encurtado de um resíduo de glicose)+ glicose-1-fosfato
As fosforilases do glicogênio ocorrem em duas formas: a forma ativa, “fosforilase a” e a forma relativamente inativa, “fosforilase b”. A fosforilase a tem duas subunidades polipeptídicas, cada uma delas com um resíduo de serina, que é fosforilado no seu grupo hidroxila. Esses resíduos de serina fosfato são necessários para a atividade máxima da enzima. Os grupos fosfatos podem ser removidos por hidrólise, catalisada por uma terceira enzima denominada fosforilase fosfatase. Nesta reação a fosforilase a é transformada em fosforilase b.
Fosforilase fosfatase
Fosforilase a + 2H2O ((((((((((( Fosforilase b + 2PiA fosforilase-b, por sua vez, pode ser convertida em fosforilase-a ativa, por meio de uma quarta enzima chamada fosforilase cinase. A fosforilase cinase catalisa a transferência de grupo fosfato do ATP para o grupo hidroxila de resíduos específicos de serina na fosforilase-b.
Fosforilase cinase
Fosforilase b + 2ATP ((((((((((( Fosforilase a+ 2ADP
15. Zimogênios
Um grande número de enzimas como as enzimas proteolíticas são sintetizadas na forma de precursores inativos denominados zimogênios ou proenzimas. Os zimogênios são convertidos em suas formas ativas em órgãos diferentes daqueles em que foram produzidos, pela ação de enzimas proteolíticas. Essas enzimas proteolíticas hidrolisam ligações peptídicas específicas, produzindo proteínas encurtadas de alguns aminoácidos (forma ativa) e peptídeos pequenos. Assim sendo, os zimogênios apresentam cadeias polipeptídicas maiores do que suas formas ativas.
Os zimogênios das enzimas digestivas quimotripsina e tripsina, sintetizados nas células pancreáticas, são, respectivamente, quimotripsinogênio e tripsinogênio. Um dos motivos pelo qual se explica a síntese de proteínas na forma inativa é a de que a síntese dessas enzimas como proenzimas evita que elas possam hidrolisar proteínas constitutivas desse órgão. Se essas enzimas fossem produzidas em suas formas ativas elas poderiam causar a destruição desse órgão. Um exemplo que ilustra bem isso é a pancreatite aguda. Na pancreatite aguda verifica-se a síntese das proenzimas de tripsina e quimotripsina nas células pancreáticas em suas formas ativas. A produção dessas proenzimas em suas formas ativas está associado com todos os sintomas letais observados nessa doença.
15.1 Ativação da tripsina. A conversão do tripsinogênio pancreático em tripsina no intestino pode ocorrer de duas formas distintas, como demonstram as reações 1 e 2. Na reação 1, essa conversão é feita pela enzima intestinal enteroquinase (também conhecida por enteropeptidase). A própria tripsina intestinal pode converter o tripsinogênio em tripsina, como pode ser verificado na reação 2.
enteroquinase
 Tripsinogênio (((((((((( Tripsina + hexapeptídeo
Tripsina
 Tripsinogênio (((((((( Tripsina + hexapeptídeo
15.2 Ativação da quimotripsina. O quimotripsinogênio pancreático, que possui uma cadeia polipeptídica composta de 245 resíduos de aminoácidos, é convertido em quimotripsina no intestino de duas formas distintas como mostram as reações 1 e 2. Na reação 1, a tripsina intestinal hidrolisa ao quimotripsinogênio, em duas cadeias polipeptídicas, que formam a proteína ativa (-quimotripsina. A reação de ativação, catalisada pela (-quimotripsina, hidrolisa a (-quimotripsina, formando três cadeias polipeptídicas, A, B e C, que compõem a (-Quimotripsina (Figura 19).
Tripsina
Quimotripsinogênio (((((((( (-Quimotripsina
(-Quimotripsina
(-Quimotripsina (((((((( (-Quimotripsina + 2 dipeptídeos
Figura 19 Ativação do quimotripsinogênio
Os zimogênios são enzimas inativas porque não possuem um sítio ativo, mas uma vez que ocorram hidrólise em pontos específicos da cadeia polipeptídica pelas enzimas hidrolíticas, interações antes não permitidas entre os aminoácidos são descobertas, proporcionando mudanças conformacionais da cadeia polipeptídica, fazendo com que o sítio ativo da enzima constitua-se como uma estrutura tridimensional bem definida.
16 Isoenzimas
Outro fenômeno de regulação metabólica e que depende da estrutura quaternária das proteínas enzimáticas são as isoenzimas. As isoenzimas ou isozimas são formas moleculares múltiplas de uma enzima, que realizam a mesma ação catalítica e ocorrem na mesma espécie animal. O exemplo clássico é a lactato-desidrogenase (LDH) um tetrâmero formado por duas espécies diferentes de cadeias polipeptídicas, denominadas M (músculo) e H (coração). Essas subunidades são codificadas por genes diferentes. A combinação das duas cadeias produz cinco isoenzimas que podem ser separadas eletroforeticamente (tabela 7).
Tabela 7. Composição das subunidades da lactato-desidrogenase e suas principais localizações
	Tipo
	Composição
	Localização
	LDH−1
	HHHH
	Miocárdio e eritrócitos
	LDH−2
	HHHM
	Miocárdio e eritrócitos
	LDH−3
	HHMM
	Cérebro e fígado
	LDH−4
	HMMM
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	LDH−5
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	Músculo esquelético e fígado
A lactato desidrogenase catalisa a redução reversível do piruvato a lactato. Desse modo, no músculo esquelético a isoenzima LDH−5 apresenta Vmax elevada para o piruvato e, portanto, converte rapidamente o piruvato a lactato. No caso da LDH−1, encontrada no coração a Vmax é relativamente baixa para o piruvato, não favorecendo a formação do lactato. O excesso de piruvato inibe a isoenzima LDH−1. O músculo cardíaco, um tecido essencialmente aeróbico, metaboliza a glicose a piruvato e, a seguir, a CO2 e H2O, produzindo pouco lactato. Entretanto, em situações de déficit de oxigênio, o piruvato pode ser convertido a lactato como medida de emergência. Assim, as características cinéticas distintas das duas enzimas determinam o tipo de metabolismo em cada tecido. Foram estudadas isoenzimas de várias enzimas diferentes, sendo as mais importantes, do ponto de vista clínico, além da lactato desidrogenase, a creatina cinase e a fosfatase alcalina.
A pancreatite é uma inflamação do pâncreas que pode resultar de um número de condições, incluindo cálculos biliares, alcoolismo crônico, e o bloqueio do ducto pancreático que podem ocorrer na fibrose cística. Danos células pancreáticas resultam na ativação precoce das proteases digestivas no pâncreas, resultando em autodigestão do pâncreas. Os níveis séricos elevados de enzimas pancreáticas, especialmente lipase e amilase pancreáticas, constituem um critério clínico para o diagnóstico da pancreatite aguda.
17. Referências bibliográficas:
 01 BOHINSKI, ROBERT C. Modern concepts in biochemistry, 5th edition , Prentice-Hall international, Inc,
1987.
 02 HORTON, H.ROBERT, MORAN, LAURENCE. A., OCHS, RAYMOND. S., RAWN, J.DAVID,SCRIMGEOUR, K. GRAY. Fundamentos de Bioquímica, Editora Prentice-Hall do Brasil.
 03. LEHNINGER, A. Princípios de Bioquímica. 1a edição, Editora Sarvier, 1986
 04. LEHNINGER, A. Princípios de Bioquímica. 2a edição, Editora Sarvier, 1995
 05. MCKEE, TRUDY, . MCKEE, JAMES. Biochemistry. Wm. C. Brown Publishers.
 06. STRYER, LUBERT. Bioquímica, 4a edição, Editora Guanabara-Koogan, 1995.
07. VOET, DONALD, VOET, VOET, JUDITH G. Biochemistry, 2nd edition, John Wiley & Sons, INC, 1995
18. Guia para estudo
1. Defina os termos abaixo:
a) substrato		e) holoenzima	i) Energia livre de Gibbs	 		
b) sítio ativo		f) KM 		j) Variação de energia livre de Gibbs ((G) 	
c) cofator 		g) Vmax		l) Variação de energia livre de Gibbs padrão ((Go)
d) apoenzima		h) modulador	m) Constante de equilíbrio (Keq) 	 									 
2. Como são classificadas as enzimas e qual a base dessa classificação?
3. Que tipo de reação catalisa as enzimas abaixo e como são classificadas cada uma delas?
a) oxigenases 	b) oxidases c) transaminases d) desidrogenases 	c) hidrolases? 
4. Como as enzimas aumentam a velocidade de uma reação?
5. Como a concentração do substrato pode influenciar a velocidade de uma reação enzimática?
6. Qual a importância do conhecimento do valor de KM no estudo de enzimas? 
7. Como variações do valor de pH afetam a velocidade de uma reação enzimática?
8. O sabor adocicado do milho recém colhido é devido ao alto nível de açúcar nos seus grãos. O milho comprado no mercado (vários dias após a colheita) não é mais tão doce por que 50% do açúcar livre do milho (glicose) é convertido em amido um dia após a colheita. Para preservar o sabor doce do milho fresco, as espigas descascadas são mergulhadas em água fervente por alguns minutos e depois são resfriadas em água fria. O milho tratado dessa maneira e depois guardado em congelador mantém o seu sabor adocicado. Qual é a base bioquímica desse procedimento?9. Explique com exemplos a especificidades relativa e absoluta das enzimas por seus substratos.
10. Como o modelo Chave-fechadura explica a relação da enzima com o seu substrato?
11. Como o modelo do ajuste induzido explica a relação da enzima com o seu substrato?
12. Por que o modelo do ajuste induzido é mais aceito na explicação da relação da enzima com o seu substrato do que o modelo chave-fechadura?
13. O que são inibidores enzimáticos? Como eles contribuíram no estudo de enzimas?
14. O que é uma inibição irreversível? Exemplifique-a.
15. O que é uma inibição reversível? Como são classificados os inibidores reversíveis?
16. Como ocorre a inibição competitiva? Como essa inibição é revertida?
17. Como ocorre a inibição não competitiva? Como essa inibição é revertida?
18. O metanol é um solvente comercial muito tóxico e pode causar a morte de uma pessoa se esta ingerir uma dose de 30ml. Para reverter o efeito tóxico do metanol deve-se dar ao paciente etanol por via oral ou por via intravenosa em doses tão altas que causariam a intoxicação num indivíduo normal. Explique por que esse tratamento é efetivo.
19. O que são enzimas reguladoras? Como elas se classificam?
20. O que são enzimas alostéricas e como elas se diferenciam das enzimas do tipo Michaelis-Menten?
21. Diferencie regulação homotrópica de regulação heterotrópica das enzimas alostéricas.
22. Qual a importância dos zimogênios serem sintetizados numa forma inativa?
23. Explique como ocorre a regulação covalente.
24. O que são isoenzima�
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