Slide RT PCR - Biologia molecular

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CENTRO UNIVERSITÁRIO UNA
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E SAÚDE
RT-PCR
Reverse transcription polymerase chain reaction
Belo Horizonte
2017
CONCEITO
É a combinação da síntese de cDNA com a amplificação in vitro por PCR, possibilitando a clonagem de genes a partir dos respectivos mRNAs e análise de expressão genética.
A técnica de RT-PCR utiliza uma enzima especial, a transcriptase reversa, que produz uma molécula de RNA, à partir de uma molécula de DNA complementar (cDNA).
A reação de PCR é feita com uma polimerase de DNA, tendo como molde o cDNA da reação anterior. 
Fonte: <https://www.thermofisher.com/br/en/home/life-science/cloning/cloning-learning-center/invitrogen-school-of-molecular-biology/rt-education/reverse-transcription-applications.html>
PRIMERS
Condicionam a especificidade do fragmento amplificado.
Na transcriptase reversa, podem ser usados primers específicos para o gene em análise, oligo(dT) ou, então, oligonucleótidos de constituição aleatória. 
No PCR subsequente são sempre usados primers específicos para o gene em análise.
PROTOCOLO
Extrai-se e purifica-se as sequências de mRNA presentes na amostra a ser estudada.
O mRNA é convertido em cDNA pela transcriptase reversa, contudo esta enzima apenas sintetiza uma cadeia simples. 
DNA Polimerase produz a cadeia dupla através da ligação de um primer específico à cadeia de cDNA simples.
São adicionados 2 primers complementares, que são previamente desenhados, ao cDNA, onde somente se ligará se a sequência que se quer estudar estiver presente na amostra.
Neste caso, ocorre a amplificação do cDNA.
Os ciclos de amplificação ocorrem inúmeras vezes, gerando milhões de cópias de cDNA, que será analisado posteriormente por eletroforese.
ONE-STEP / TWO-STEP
One-step: a síntese do cDNA e a reação de PCR ocorrem no mesmo tubo. Este protocolo simplifica o processo e minimiza a ocorrência de contaminações por diminuir o número de manipulações. Apresenta elevada sensibilidade, uma vez que os primers a utilizar têm de ser específicos de apenas uma sequência; 
Two-step: a primeira etapa inclui a síntese do cDNA. Após a síntese da cadeia simples, o cDNA é transferido para um novo tubo, onde irá ocorrer a reação de PCR. Permite uma maior flexibilidade dos componentes a usar em cada reação e é ideal para a detecção e quantificação de várias sequências.
Fonte: <https://www.thermofisher.com/br/en/home/life-science/cloning/cloning-learning-center/invitrogen-school-of-molecular-biology/rt-education/reverse-transcription-applications/_jcr_content/MainParsys/image_1b4d/backgroundimg.img.png/1498999542155.png>
One-Step RT-PCR
Two-Step RT-PCR
CONFIGURAÇÃO
PRIMERS
USO IDEAL
VANTAGEM
Reação combinada sob condições que suportam transcrição reversa e PCR.
Reações otimizadas separadas para transcrição reversa e PCR.
Primers específicos para o gene.
Oligo (dT), hexâmeros aleatórios ou primers específicos de genes.
Análise de um ou dois genes; Plataformas de alto rendimento.
Análise de genes múltiplos.
Conveniente, alto rendimento, mais rápido.
Flexível.
Fonte:<https://www.thermofisher.com/br/pt/home/life-science/cloning/cloning-learning-center/invitrogen-school-of-molecular-biology/rt-education/reverse-transcription-applications.html>
TABELA DE COMPARAÇÃO ONE-STEP X 
TWO-STEP
PONTOS POSITIVOS X
PONTOS NEGATIVOS
Técnica altamente sensível, superando outras técnicas de análise de expressão genética, requerendo menores quantidades de RNA para análise.
Por outro lado, a contaminação do RNA por quantidades mínimas de DNA genômico leva a falsos positivos ou à impossibilidade de distinção da amplificação obtida a partir de cDNA ou de DNA genômico. 
APLICAÇÕES
Detecção do vírus RNA em amostras clínicas.
Estudos de expressão gênica.
Clonagem de genes à partir dos respectivos mRNAs.
Entendimento do processo oncogênico.
REFERÊNCIAS
 BIBLIOGRÁFICAS
SILVA, MARGARIDA (2015) “Apresentação do conceito de RT-PCR”.
Disponível em: http://www.old.knoow.net/ciencterravida/biologia/rt-pcr.htm
AZEVEDO, F.C (2013) “A transcriptase reversa como alvo terapêutico em doenças retrovirais”. Universade Fernando Pessoa – Porto Alegre.
Disponível em: http://bdigital.ufp.pt/bitstream/10284/4082/1/Tese%20Final%20-%20Filipe%20Azevedo%20n%C2%BA20186.pdf
OLIVEIRA, R.P.S (2000) “Biologia Molecular – Expressão génica (RT-PCR)”. 
Disponível em:
<https://repositorium.sdum.uminho.pt/bitstream/1822/7497/1/Protocolo%20MGM%20RT-PCR.pdf>