B cereus

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CAPÍTULO 11
BACILLUS CEREUS
11.1. INTRODUÇÃO
Bacillus cereus é uma bactéria patogênica, cujas doenças transmitidas por alimentos (DTAs) são classificadas 
pela International Commission on Microbiological Specifications for Foods (ICMSF, 2002) no grupo de risco 
III, que inclui as doenças “de perigo moderado, usualmente de curta duração e sem ameaça de morte ou 
seqüelas, com sintomas auto limitados mas que provocam severo desconforto”.
Grupo B. cereus
As informações abaixo são do Dictionnaire de Bactériologie Vétérinaire (Euzéby, 2003).
Bacillus cereus, Bacillus anthracis, Bacillus thuringiensis, Bacillus mycoides, Bacillus pseudomycoides e 
Bacillus weihenstephanensis constituem um grupo de espécies de Bacillus (Grupo B. cereus) estreitamente 
relacionadas entre si e, do ponto de vista prático, dificilmente diferenciadas umas das outras. São bactérias 
Gram positivas, esporogênicas, anaeróbias facultativas e produzem esporos facilmente, na maioria dos meios 
de cultura. Cada uma dessas espécies é diferenciada de B. cereus, basicamente, por uma única característica.
B. anthracis e B. cereus são as únicas espécies do grupo patogênicas para humanos. B. anthracis é uma 
bactéria temida, devido ao alto potencial de uso como arma biológica. Provoca uma doença conhecida como 
carbúnculo, que atinge herbívoros (particularmente ruminantes) e pode ser transmitida para humanos, através 
do contato com os animais infectados. A transmissão se dá por exposição inalatória, cutânea ou 
gastrointestinal, atingindo principalmente profissionais de saúde animal, criadores e separadores de lã. A 
forma inalatória é muito grave, com sintomas iniciais inespecíficos (febre, mialgia, fadiga, sudorese) e, após 
dois a quatro dias dos sintomas iniciais, desconforto respiratório, choque e morte. A infecção cutânea 
normalmente ocorre na cabeça, braços e mãos, provocando úlceras negras e profundas, entre dois a seis dias. 
Geralmente não é fatal, se tratada com antibióticos. A forma gastrintestinal, rara nos países desenvolvidos, 
traduz-se por perturbações gerais (febre, estado de choque) e digestivas (dores abdominais, vômito, diarréia 
sangrenta), entre dois e sete dias. Assim como na forma inalatória, a taxa de mortalidade é elevada.
B. thuringiensis é patogênico para insetos, sendo utilizado como agente de controle biológico 
(bioinseticida) na agricultura, há mais de 30 anos (Valadares-Inglis et al., 1998). Durante o processo de 
esporulação, as células produzem inclusões cristalinas (cristais parasporais), compostas por um ou mais 
polipeptídios (delta-endotoxinas), que são codificadas pelos genes Cry. As toxinas são ativas contra as larvas 
de insetos das ordens Lepidoptera, Coleoptera e Diptera, bem como contra nematóides e ácaros (Dean, 1984). 
Não afetam o homem, os animais ou as plantas (Souza et al., 1999).
B. mycoides apresenta morfologia de colônias característica em meios sólidos (colônias rizóides), 
lembrando o crescimento fúngico. A partir do ponto de inoculação, a multiplicação ocorre em cadeias de 
células ligadas entre si, formando longos filamentos que se projetam radialmente e se curvam para a direita ou 
para a esquerda (Di Franco et al., 2002). As colônias têm aparência de raízes, de onde deriva o termo rizóide.
B. pseudomycoides é uma espécie nova, proposta por Nakamura (1998). É composta de um grupo de 
cepas de B. mycoides, com composição de ácidos graxos distinta. As características morfológicas, fisiológicas 
e de crescimento são indistinguíveis de B. mycoides, incluindo o crescimento rizóide em meios sólidos.
B. weihenstephanensis também é uma espécie nova, proposta por Lechner et al. (1998). É composta das 
linhagens psicrotróficas de B. cereus, separadas das linhagens mesófilas, que continuam na espécie cereus. 
Apresenta todas as características típicas de B. cereus, do qual se diferencia apenas pela capacidade de crescer 
entre 4 e 7ºC e não crescer a 43ºC.
Nem sempre, nos ensaios, é possível diferenciar B. cereus dos outros membros do Grupo, cujas principais 
características estão sumariadas na Tabela 11.1.
Os dados da Tabela 11.1. são do Capítulo 14 do BAM Online (FDA, 2001) que, assim como a 4ª Edição do 
Compendium, não tratam B. pseudomycoides e B. weihenstephanensis separadamente.
Tabela 11.1. Características das espécies do Grupo B. cereus (FDA, 2001).
Característica B. cereus B. thuringiensis B. mycoides B. anthracis
Coloração de Gram + + + +
Catalase + + + +
Motilidade +/- +/- - -
Redução do nitrato + + + +
Decomposição da tirosina + + +/- d
Resistência à lisozima + + + +
Reação de gema de ovo + + + +
Utilização anaeróbica da glicose + + + +
Voges-Proskauer (VP) + + + +
Ácido a partir de manitol - - - -
Hemólise + + + d
Outras características conhecidas Produz 
enterotoxinas
Produz cristais de 
endotoxinas
Crescimento rizóide Patogênico para o 
homem e outros animais
+ = 90-100% das cepas positivas, +/- = 50-50% das cepas positivas, - = 90-100% das cepas negativas, d = maioria das cepas negativas.
Principais características de B. cereus
As informações abaixo são dos livros Bacteriological Analytical Manual (BAM Online) (FDA, 2001), 
Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods (Bennett & Belay, 2001) e 
Microorganisms in Foods 5 – Microbiological Specifications of Food Pathogens (ICMSF, 1996). Nenhuma 
dessas referências separa B. weihenstephanensis de B. cereus.
As cepas de B. cereus são catalase positivas e, caracteristicamente, capazes de decompor a tirosina. A 
temperatura ótima de crescimento é de 30 a 40ºC, com mínima de 4ºC e máxima de 55ºC. O pH ótimo 
encontra-se entre 6,0 e 7,0, com mínimo de 5,0 e máximo de 8,8. A atividade de água mínima é de 0,93. 
Os esporos de B. cereus apresentam resistência térmica similar aos de outros esporos de bactérias mesófilas, 
com valor D121ºC entre 0,03 e 2,35min e valor z entre 7,9 e 9,9ºC (em tampão fosfato 0,05M). Em caldo de 
arroz a 100ºC resistem por 4,2 a 6,3min.
As doenças provocadas por B. cereus são intoxicações, resultantes da ingestão de toxinas formadas no 
alimento, quando ocorre a multiplicação das células. Dois tipos de doenças são conhecidas:
Uma é a síndrome diarreica, caracterizada por dores abdominais e diarréia, com período de incubação de oito 
a 16 horas e sintomas entre 12 e 24 horas. É provocada pela toxina diarreica, uma proteína termossensível, 
inativada por aquecimento a 56oC/5min.
A outra é a síndrome emética, caracterizada por náusea e vômito, entre uma e cinco horas depois do consumo 
do alimento contaminado. A diarréia não é o sintoma predominante nesse caso, mas pode ocorrer. É 
provocada pela toxina emética, um pequeno peptídeo altamente resistente ao calor, que pode suportar o 
cozimento e, também, tratamentos térmicos muito mais severos, como 126ºC por 90min ou 120oC por mais de 
uma hora. A temperatura ótima para a produção da toxina emética em arroz é de 25-30ºC.
A presença de B. cereus em alimentos não representa risco à saúde, a menos que possa se multiplicar e atingir 
populações maiores do que 105 células viáveis por grama. Os alimentos mais freqüentemente implicados em 
surtos são produtos cozidos ou contendo ingredientes cozidos, particularmente os ricos em amido ou 
proteínas, como arroz, massas, vegetais, sopas, saladas de vegetais, brotos de sementes e pudins e carnes. O 
cozimento ativa os esporos e, se a refrigeração não for adequada, esses esporos podem germinar e produzir as 
toxinas.
Métodos de análise
A contagem de B. cereus em alimentos pode ser feita pelo método de plaqueamento direto, mais comum, ou 
pelo método do número mais provável, recomendado quando se esperam contagens abaixo de 1000 UFC/g.
No plaqueamento direto, o meio maisutilizado é o Ágar Manitol Gema de Ovo Polimixina (MYP), que 
combina a polimixina como agente seletivo e a gema de ovo e o manitol, como agentes diferenciais. A 
produção de colônias com uma forte reação de gema de ovo (atividade de lecitinase), caracterizada por um 
grande halo de precipitação, é típica dos bacilos do Grupo B. cereus. A não fermentação do manitol confere 
ao halo em volta da colônia uma coloração rósea leitosa.
Outro meio recomendado é o KG, que apresenta a mesma sensibilidade e seletividade do MYP, mas é bem 
menos utilizado. As colônias são idênticas às do MYP, mas não apresentam a coloração, porque o meio não 
contém manitol. Formulado para estimular a formação de esporos livres em 20-24h de incubação, permite a 
imediata confirmação das colônias (diretamente das placas de contagem), através da coloração de esporos e 
de glóbulos de lipídios intracelulares (teste confirmatório rápido de Holbrook & Anderson). Para aplicar esse 
teste às colônias obtidas em MYP, é necessário repicar a cultura em Ágar Nutriente. Dessa forma, o KG é 
uma alternativa mais rápida na contagem de B. cereus. Outra vantagem do KG é que outros espécies de 
Bacillus que produzem lecitinase, como B. polymyxa, são incapazes de formar lecitinase nesse meio, 
nutricionalmente pobre.
A confirmação das colônias típicas inclui dois grupos de testes, o primeiro para verificar se a cultura isolada 
pertence ao Grupo B. cereus e o segundo para diferenciar B. cereus dos demais bacilos do Grupo.
Para confirmar a cultura no grupo B. cereus, a 4a Edição do Compendium of Methods for the Microbiological 
Examination of Foods (Bennett & Belay, 2001) recomenda o teste confirmatório rápido de Holbrook & 
Anderson (1980), uma técnica que combina a coloração de esporos de Ashby e a coloração de gordura 
intracelular de Burdon. No método de Holbrook & Anderson, o isolamento de B. cereus é feito em PEMBA 
(Polymyxin Pyruvate Egg-Yolk Bromothymol Blue Agar). Segundo os autores, apenas B. cereus, dentre as 
espécies de Bacillus capazes de crescer em PEMBA, apresentam glóbulos de lipídios intracelulares. Devido à 
similaridade na composição e características diferenciais, o PEMBA pode ser substituído pelo KG, no método 
descrito pelo Compendium.
Colônias com características típicas no MYP ou KG também podem ser confirmadas no Grupo B. cereus 
através de provas bioquímicas. As características mais típicas do grupo são determinadas, incluindo o teste de 
utilização anaeróbia da glucose, o teste de decomposição da tirosina, o teste de VP, o teste de nitrato e o teste 
de resistência à lisozima. Quando há necessidade ou interesse em uma identificação mais rigorosa, para fins 
regulatórios, por exemplo, o Compendium recomenda aplicar o teste de Holbrook & Anderson e as provas 
bioquímicas. Quando não há necessidade de uma identificação mais rigorosa e as colônias são típicas no KG 
ou no MYP, as provas bioquímicas podem substituir o teste de Holbrook & Anderson.
Para diferenciar B. cereus dos demais bacilos do Grupo, os testes aplicados são a verificação da produção de 
cristais de toxinas intracelulares, a verificação da motilidade, a verificação de crescimento rizóide e a 
verificação de atividade hemolítica.
11.2. MÉTODO DE CONTAGEM DIRETA EM PLACAS
Método da American Public Health Association (APHA), descrito no Capítulo 32 da 4o Edição do 
Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods (Bennett & Belay, 2001).
Antes de iniciar as atividades, ler atentamente as orientações do Capítulo 3, que apresenta todos os detalhes e 
cuidados envolvidos na contagem de microrganismos em placas, da seleção das diluições ao cálculo dos 
resultados. O procedimento descrito abaixo não apresenta esses detalhes, pressupondo que sejam conhecidos 
pelo analista.
11.2.1. MATERIAL REQUERIDO PARA A ANÁLISE
Preparacão da amostra e diluições seriadas
n Diluente: Água Peptonada 0,1% (H2Op) ou Tampão Fosfato pH 7,2 (PB)
n Tubos de diluição com 9ml de Água Peptonada 0,1% (H2Op) ou o Tampão Fosfato pH 7,2 (PB)
n Pipetas de 1 ou 2ml
n Observação: consultar o Anexo 2.2 do Capítulo 2 para verificar casos especiais em que o tipo ou volume de 
diluente variam em função da amostra analisada.
Contagem presuntiva
n Placas de Ágar Manitol Gema de Ovo Polimixina (MYP) ou Ágar Kim-Goepfert (KG)
n Alças de espalhamento (Drigalski)
n Estufa incubadora regulada a 30-32oC com termômetro calibrado
Confirmação do grupo B. cereus pelo teste de Holbrook & Anderson
n Solução de Verde Malaquita 5%
n Solução de Sudan Black (0,3% peso/volume em etanol 70%)
n Solução de Safranina 0,5% aquosa
n Xileno (PA)
Confirmação do grupo B. cereus por provas bioquímicas (opcional)
n Placas de MYP (se o isolamento foi feito em KG)
n Tubos de Ágar Nutriente (NA) inclinados
n Tubos de Caldo Vermelho de Fenol 1% Glucose
n Tubos de Ágar Tirosina
n Tubos de Caldo VP modificado para Bacillus
n Tubos de Caldo Nitrato
n Tubos de Ágar Nutriente 0,001% Lisozima
n Vaselina líquida ou óleo mineral estéril (ou sistema de geração de anaerobiose)
n Reagentes de Barrit para teste de VP (solução alcoólica 5% de alfa-naftol, solução aquosa de KOH 40%, 
creatina em cristais)
n Reagentes para Teste de Nitrato (solução 0,8% de ácido sulfanílico, solução 0,5% de alfa-naftol em ácido 
acético, pó de zinco livre de nitrato ou nitrito)
n Estufa incubadora regulada a 35oC com termômetro calibrado
Diferenciação dos membros do grupo B. cereus
n Tubos de NA inclinados
n Ágar Motilidade para B. cereus
n Placas de Ágar Nutriente (NA)
n Ágar Tripticase de Soja (TSA) suplementado com sangue de carneiro
n Solução de Azul Brilhante de Coomassie
n Estufa incubadora regulada a 30oC com termômetro calibrado
11.2.2. PROCEDIMENTO
O esquema geral de análise de B. cereus pelo método de plaqueamento direto encontra-se descrito na Figura 
11.1.
Inserir Figura 11.1.
Figura 11.1. Esquema de análise para contagem de B. cereus por plaqueamento direto (Bennett & Belay, 
2001).
a) Preparação da amostra, inoculação e incubação
Para a preparação da amostra e diluições seriadas, seguir os procedimentos descritos no Capítulo 2.
Selecionar três diluições adequadas da amostra e inocular 0,1ml de cada diluição em placas de Ágar Manitol 
Gema de Ovo Polimixina (MYP) ou Ágar Kim-Goepfert (KG), previamente preparadas e secadas 
(plaqueamento em superfície). Espalhar o inóculo com alças de Drigaslski, até que todo o líquido seja 
absorvido pelo meio de cultura. Recomenda-se que na contagem de B. cereus e outras bactérias 
esporogênicas, seja utilizada uma alça estéril diferente para cada diluição, porque a flambagem em álcool não 
elimina os esporos. Havendo suspeita de contagens inferiores a 100 UFC/g, inocular 1ml da primeira diluição 
da amostra, distribuindo o volume por quatro placas de MYP ou KG, três com 0,3ml e uma com 0,1ml. 
Havendo interesse em contar exclusivamente os esporos, submeter a amostra a choque térmico por 15 
minutos a 70oC.
Aguardar que as placas sequem completamente e incubar invertidas, a 30-32oC/20-24h.
b) Contagem das colônias presuntivas
Selecionar para a contagem placas com 10 a 100 colônias, contendo não mais do que 30 colônias típicas de B. 
cereus, pois estas colônias são grandes e os halos característicos podem confundir-se em placas muito cheias. 
No KG as colônias típicas de B. cereus são esféricas, com bordas perfeitas, planas e secas, translúcidas ou 
levemente creme, rodeadas por um grande halo de precipitação, devido à reação com a gema de ovo. Menos 
freqüentemente, mas ainda consideradas típicas, as bordas são irregulares e, nesses casos, normalmente são 
brancas no centro e translúcidas em redor do centro.
No MYP são idênticas às do KG, mas apresentam ainda uma coloração rósea leitosa ao redor das colônias, 
típica da não-fermentaçãodo manitol.
Cuidado: O MYP e o KG podem permitir o crescimento de B. anthracis, patogênico, com colônias 
indistinguíveis das colônias de B. cereus. Para prevenir riscos de contaminação do analista e do laboratório, 
recomenda-se: 1) que o manuseio das placas seja feito sobre bandejas e não diretamente sobre as bancadas, 2) 
que ao trabalhar em capela de fluxo laminar se utilize um modelo vertical, adequado ao manuseio de 
patógenos, 3) que se mantenha ao alcance das mãos um frasco de desinfetante como solução de cloro a 
100ppm ou solução de álcool iodado, para descontaminar qualquer descarga inadvertida de material 
contaminado, 4) que o descarte seja precedido da descontaminação em autoclave a 121oC/30min, 5) que toda 
a área de trabalho seja prontamente descontaminada, uma vez concluídas as análises.
c) Confirmação das colônias no Grupo B. cereus
Selecionar pelo menos cinco colônias típicas bem isoladas para a confirmação. Se houver menos de cinco 
colônias, selecionar todas.
Aplicar o teste confirmatório rápido de Holbrook & Anderson (descrito no item c.1). Havendo necessidade ou 
interesse em uma verificação mais rigorosa das características típicas do grupo, aplicar também as provas 
bioquímicas (descritas nos itens c.2 a c.6). Se as colônias obtidas no KG ou MYP forem bem típicas, o teste 
confirmatório rápido de Holbrook & Anderson pode ser substituído pelas provas bioquímicas.
c.1) Teste confirmatório rápido de Holbrook & Anderson (coloração de esporos e 
glóbulos de lípidios intracelulares). As colônias obtidas no KG podem ser submetidas ao teste 
confirmatório rápido diretamente da placa de contagem. As colônias obtidas no MYP devem ser repicadas em 
tubos com Ágar Nutriente (NA) inclinado e incubadas a 30oC/24h, antes da realização do teste. Procedimento:
3 Preparar um esfregaço da cultura, tomando o inóculo no centro da colônia, se a cultura estiver com 24h, 
ou na borda da colônia, se a cultura estiver com 48h. Deixar secar naturalmente e fixar na chama com o 
mínimo de calor. 
3 Cobrir o esfregaço com Solução Aquosa 5% de Verde Malaquita e corar a quente durante dois minutos. 
Para aquecer a solução de verde de malaquita, há três opções: 1) colocar a lâmina sobre um suporte 
vazado e o suporte sobre um banho ou frasco com água sob fervura, para aquecer com o vapor de água. 
2) colocar sob a lâmina um “swab” com álcool em chamas, até observar a saída de vapor (sem ferver). 3) 
passar a lâmina cuidadosamente na chama de um bico de Bunsen, até a emissão de vapor (sem ferver), 
pelo menos duas vezes, com intervalo de um minuto.
3 Após o tempo de contato de dois minutos, lavar a lâmina em água corrente, secar com lenço de papel 
(apenas encostar a lâmina no lenço de papel, sem esfregar) e cobrir com Solução de Sudan Black (0,3% 
peso/volume em etanol 70%) por 20min.
3 Descartar o excesso de corante, secar com lenço de papel e lavar a lâmina com xileno (PA), por cinco a 
dez segundos. Cuidado. O xileno é inflamável e os vapores são irritantes e depressores do sistema 
nervoso central, podendo provocar dor de cabeça, tontura, náusea, perda de consciência e outros 
sintomas. Manusear com luvas, em capela de exaustão. Não descartar o excedente na pia, manter na 
capela de exaustão até evaporar.
Nota) O Manual da Oxoid (2000), na descrição do meio Bacillus cereus Selective Agar Base (CM 617), recomenda substituir 
o xileno por Citroclear (H.D. Supplies, 44 Rabans Close, Rabans Lane Industrial Estate, Aylesbury, Buckinghamshire, 
England, HP19 3RS).
3 Secar imediatamente com com lenço de papel e cobrir com Solução de Safranina 0,5% por 20 segundos.
3 Lavar em água corrente, secar com lenço de papel e observar ao microscópio óptico com objetiva de 
imersão. Os membros do grupo B. cereus vão apresentar a) glóbulos de lipídios corados de azul escuro, 
dentro do citoplasma das células, b) esporos centrais a subterminais, sem dilatação do esporângio, 
corados de verde pálido, c) células vegetativas, coradas de vermelho.
c.2) Teste de utilização anaeróbia da glucose (opcional). Inocular uma alçada da cultura em um 
tubo de Caldo Vermelho de Fenol 1% glicose, previamente desaerado (fervura por 15 minutos em banho, com 
as tampas afrouxadas, seguida do imediato resfriamento em banho de gelo). Cobrir a superfície do caldo com 
óleo mineral ou vaselina líquida estéril e incubar a 35oC/24h. Alternativamente, em lugar de cobrir o meio 
com óleo ou vaselina, pode-se incubar os tubos em atmosfera anaeróbia, obtida por um dos métodos 
relacionados no Capítulo específico de Clostridium perfringens. Observar se há ocorrência de viragem ácida 
do indicador, alterando a cor do meio de vermelho para amarelo (teste positivo) ou se o meio permanece com 
a cor inalterada (teste negativo). As cepas de B. cereus utilizam a glucose anaerobicamente.
c.3) Teste de decomposição da tirosina (opcional). Estriar uma alçada da cultura na rampa de um 
tubo de Ágar Tirosina inclinado e incubar a 35oC/48-72h. Observar se há desenvolvimento de uma zona clara 
e transparente de decomposição e dissolução dos cristais de tirosina, na região abaixo da rampa (teste 
positivo), ou não formação dessa zona, mantendo o meio opaco inalterado (teste negativo). As cepas de B. 
cereus decompõem a tirosina rapidamente, formando uma zona de 3-4mm de profundidade em 48-72h. É 
também comum o escurecimento do meio ao longo da região de crescimento, com desenvolvimento de uma 
coloração castanha.
c.4) Teste de Voges-Proskauer (opcional). Inocular uma alçada com inóculo leve da cultura em um 
tubo de Caldo VP Modificado para Bacillus e incubar a 35oC/48h. Adicionar, para cada 1ml de cultura, 0,6ml 
de solução de α-naftol 5%, 0,2ml de solução de KOH 40% e uma pitada de cristais de creatina, na ordem 
indicada. Agitar vigorosamente, deixar descansar e observar periodicamente, por até uma hora, o 
desenvolvimento de uma cor vermelha no meio de cultura (teste positivo). A permanência do meio na cor 
amarelada dos reagentes indica teste negativo. As cepas de B. cereus são VP positivas.
c.5) Teste de redução do nitrato (opcional). Inocular uma alçada com inóculo pesado da cultura em 
um tubo com 3-4ml de Caldo Nitrato e incubar a 35oC/24h. Após a incubação, adicionar aos tubos 0,25ml de 
cada um dos reagentes para teste de nitrato (A = Solução 0,8% de ácido sulfanílico; B = Solução 0,5% de α-
naftol). Observar o desenvolvimento de uma cor rósea avermelhada em no máximo dez minutos (teste 
positivo). Em caso negativo, adicionar uma pitada de pó de zinco, deixar em repouso por dez minutos e 
observar se o meio permanece com a cor inalterada (teste positivo) ou adquire uma coloração rósea 
avermelhada (teste negativo). A maioria das cepas de B. cereus reduz o nitrato, sendo poucas as cepas 
negativas para essa característica.
c.6) Teste de resistência à lisozima (opcional). Inocular uma alçada da cultura em um tubo de 
Caldo Nutriente suplementado com 0,001% de lisozima, inoculando também um tubo de Caldo Nutriente não 
suplementado (controle). Incubar a 35oC/48h e observar se ocorre crescimento nos dois tubos (teste positivo) 
ou apenas no tubo controle (teste negativo). As cepas de B. cereus são resistentes à lisozima.
d) Diferenciação das espécies do Grupo B. cereus
Esses testes aplicam-se às culturas confirmadas como pertencentes ao Grupo B. cereus, para diferenciação das 
espécies dentro do Grupo.
d.1) Coloração de cristais de toxinas intracelulares (Método de Sharif & 
Alaeddinoglu, 1988). Inocular uma alçada da cultura na rampa de um tubo de Ágar Nutriente (NA) 
inclinado e incubar a 30oC/24h. Manter o tubo à temperatura ambiente por três dias, para envelhecer a cultura, 
permitir a formação de esporos e a lise dos esporângios. Prepararum esfregaço da cultura, fixando levemente 
pelo calor. Cobrir o esfregaço por três minutos com uma Solução de Azul Brilhante de Coomassie (0,25g de 
azul brilhante de coomassie + 50ml de etanol absoluto + 7ml de ácido acético glacial + 43ml de água 
destilada). Lavar a lâmina em água corrente, aguardar secar e observar em microscópio óptico, sob imersão. 
As cepas de B. thuringiensis vão apresentar esporos livres não corados, células vegetativas (bastonetes) 
coradas de azul e cristais livres corados de azul intenso, tetragonais e bem menores do que as células 
vegetativas. No interior das células vegetativas (coradas de azul) os esporos e os cristais aparecem brancos. 
As cepas de B. cereus não produzem cristais.
Nota d.1) O procedimento descrito no Compendium é diferente, bem mais trabalhoso e utiliza metanol, tóxico, que deve ser 
manuseado com cuidado, evitando-se inalação ou contato com a pele (trabalhar com luvas e máscara protetora): Cultivar a 
cultura da mesma forma descrita acima e preparar o esfregaço. Cobrir o esfregaço com metanol por 30 segundos, descartar o 
excesso de álcool e flambar, para fixação definitiva. Cobrir em seguida o esfregaço com uma solução aquosa 0,5% de fucsina 
básica, aquecer delicadamente à chama, até a emissão de vapores, aguardar dois minutos e aquecer novamente até nova 
emissão de vapores. Aguardar 30 segundos, lavar a lâmina em água corrente, secar e observar ao microscópio óptico, sob 
imersão. As cepas de B. thuringiensis vão apresentar esporos livres e uma grande quantidade de cristais tetragonais corados de 
vermelho.
d.2) Teste de motilidade. Inocular a cultura em um tubo de Ágar Motilidade para B. cereus, por picada, 
no centro do meio e até a profundidade de 1cm do fundo do tubo. Incubar a 30oC/18-24h e observar se 
ocorreu migração das células para as regiões fora da linha de inoculação (motilidade positiva) ou se o 
crescimento restringiu-se à linha da picada (motilidade negativa). Opcionalmente, a característica de 
motilidade pode ser observada ao microscópio. Adicionar 0,2ml de água destilada estéril à rampa de um tubo 
de NA inclinado e estriar uma alçada da cultura na rampa umidificada. Incubar a 30oC/6-8h e transferir uma 
alçada da cultura, coletada do líquido na base da rampa, para uma gota de água destilada estéril depositada 
numa lâmina de vidro. Emulsionar o material, cobrir com uma lamínula e observar ao microscópio. As cepas 
de B. cereus e B. thuringiensis geralmente são ativamente móveis, enquanto as cepas de B. anthracis e B. 
mycoides são imóveis.
d.3) Verificação de crescimento rizóide. Depositar uma alçada da cultura no centro de uma placa de 
Ágar Nutriente (NA), sem espalhar. Incubar a 30oC/24-48h e observar se a colônia desenvolvida apresenta 
crescimento rizóide (a massa de células se estende para fora do ponto de inoculação, como raízes), 
característico das cepas de B. mycoides.
d.4) Verificação de atividade hemolítica. Inocular até seis culturas em uma placa de Ágar 
Tripticase de Soja suplementado com sangue de carneiro (TSA-Sangue), transferindo o inóculo para um único 
ponto do meio, por simples contato. Incubar a 30-32oC/24h e observar se há formação de um halo claro de 
hemólise em redor das colônias (teste positivo). As cepas de B. cereus são fortemente hemolíticas, produzindo 
halos grandes e bem nítidos, enquanto B. mycoides e B. thuringiensis são fracamente hemolíticos, produzindo 
halos menores ou, eventualmente, zona de hemólise restrita à região sob a colônia. As cepas de B. anthracis 
geralmente não são hemolíticas.
e) Cálculo dos resultados
Calcular o número de UFC/g ou ml em função do número de colônias típicas, diluição inoculada e 
percentagem de colônias confirmadas.
Exemplo: Diluição 10-1, plaqueamento em superfície, seis colônias típicas, seis submetidas à confirmação, 
três confirmadas (50%). UFC/g ou ml = 6x101x10x0,5 = 3,0x102.
11.3. MÉTODO DO NÚMERO MAIS PROVÁVEL (NMP)
Método da American Public Health Association (APHA), descrito no Capítulo 32 da 4o Edição do 
Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods (Bennett & Belay, 2001).
O método do NMP é uma alternativa que pode ser utilizada quando as contagens esperadas encontram-se 
abaixo do limite de detecção do plaqueamento, que é de 100 UFC/g. Antes de iniciar as atividades, ler 
atentamente as orientações do Capítulo 4, que apresenta todos os detalhes e cuidados envolvidos na contagem 
de microrganismos pelo NMP, da seleção das diluições ao cálculo dos resultados. O procedimento descrito 
abaixo não apresenta esses detalhes, pressupondo que sejam conhecidos pelo analista.
11.3.1. MATERIAL REQUERIDO PARA A ANÁLISE
Preparacão da amostra e diluições seriadas
n Diluente: Água Peptonada 0,1% (H2Op) ou Tampão Fosfato pH 7,2 (PB)
n Tubos de diluição com 9ml de Água Peptonada 0,1% (H2Op) ou o Tampão Fosfato pH 7,2 (PB)
n Pipetas de 1 ou 2ml
n Observação: consultar o Anexo 2.2 do Capítulo 2 para verificar casos especiais em que o tipo ou volume de 
diluente variam em função da amostra analisada.
Contagem presuntiva
n Tubos de Caldo Tripticase de Soja (TSB) suplementado com polimixina
n Estufa incubadora regulada a 30oC com termômetro calibrado
Confirmação
n Os mesmos itens requeridos na contagem em placas
11.3.2. PROCEDIMENTO
O esquema geral de análise de B. cereus pelo método do NMP encontra-se descrito na Figura 11.2.
Inserir Figura 11.2.
Figura 11.2. Esquema de análise para contagem de B. cereus pelo método do NMP (Bennett & Belay, 2001).
Para a preparação da amostra e diluições seriadas, seguir as orientações do Capítulo 2.
Inocular três alíquotas de 1ml das três primeiras diluições da amostra em uma série de três tubos de Caldo 
Tripticase de Soja (TSB) suplementado com polimixina B, na mesma concentração utilizada no Ágar Ágar 
Manitol Gema de Ovo Polimixina (MYP). Incubar os tubos a 30oC/48h.
Observar crescimento denso, típico de B. cereus e estriar uma alçada de cada tubo com crescimento em placas 
de MYP ou Ágar Kim-Goepfert (KG), incubando as placas a 30-32oC/20-24h. Verificar a formação de 
colônias típicas de B. cereus, descritas no item 11.2 e selecionar uma ou mais colônias de cada placa para 
confirmação, que deve ser feita seguindo os mesmos procedimentos descritos no item 11.2.
Anotar o número de tubos cujas culturas foram confirmadas e determinar o Número Mais Provável (NMP)/g 
conforme a orientação do Capítulo 4, usando uma das tabelas de NMP.
6.4. REFERÊNCIAS
BENNETT, R.W. & BELAY, N. Bacillus cereus. In: DOWNES, F. P., and K. ITO (ed.), Compendium of 
Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4th ed. American Public Health Association, 
Washington, D. C, 2001. Chapter 32, p.311-316.
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Disponível no site: http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-14.html (acesso em 16/01/06).
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	B. cereus
	B. thuringiensis
	B. anthracis