PRÁTICA 3 COLORAÇÃO

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IFPR – INSTITUTO FEDERAL DO PARANÁ
BRUNA ALMEIDA, NATHALIA TONIAL E PALOMA ÁVILA
RELATÓRIO 
AULA PRÁTICA: COLORAÇÃO DE GRAM
Relatório apresentado a disciplina de microbiologia, pelas acadêmicas do 6º período curso de Licenciatura em Ciências Biológicas, pelo IFPR – Campus Palmas, como pré-requisito de nota ao professor Dr. Rafael Ernesto Balen. 
PALMAS – PR.
2017
Relatório – Aula Prática 3
COLORAÇÃO DE GRAM
1. Introdução
	A Técnica de Gram ou Coloração de Gram é utilizada para a preparação de amostras a serem observadas no microscópio, usando corantes para diferenciar microrganismos com base na composição química e integridade da sua parede celular.
	O método de coloração foi desenvolvido pelo patologista dinamarquês Hans Christian Joachim Gram. Gram, em 1885, publicou na revista cientifica Fortschritte der Medlzin, em Berlim, Alemanha, um método de coloração de bactérias que até hoje vem sendo usado para fins de classificação de micróbios.
	A ideia da técnica surgiu enquanto o pesquisador examinava o tecido pulmonar de pacientes que haviam morrido por pneumonia. Ele percebeu que alguns dos corantes utilizados eram retidos, preferencialmente pelas células bacterianas. A técnica foi gradativamente aperfeiçoada pela adição de outras etapas de coloração.
	A coloração de Gram é muito utilizada na bacteriologia permitindo a distinção entre bactérias Gram positivas (púrpura) e Gram negativas (rosa). A diferença entre os dois tipos de células relaciona-se com a estrutura da parece celular das bactérias: a parece celular das Gram positivas é formada por uma camada espessa de peptideoglicano, enquanto que a parece das Gram negativas é formada por uma camada fina de peptideoglicano, rodeada por uma camada externa de lipopolissacarídeos e proteínas. 
	Diferenças na permeabilidade dessas membranas aos reagentes químicos levam a diferença de coloração. A grande maioria das bactérias pode ser corada por tal método, mas algumas espécies exigem técnicas especiais de coloração, como as micobactérias, espiroquetas, micoplasma, riquétsias e clamídias.
2. Objetivos
Corar uma lâmina pelo método de Gram;
Reconhecer bactérias Gram positivas e Gram negativas ao microscópio;
Compreender a importância dessa coloração para a microbiologia clínica;
Compreender cada etapa do processo de coloração, bem como a função de cada substância utilizada.
3. Material
Placa de Petri contendo crescimento bacteriano;
Lâminas para preparação do esfregaço;
Solução salina;
Alça de platina;
Lamparina;
Bateria de corantes para o Gram.
4. Métodos
	
	Em primeiro passo, se limpa a lâmina de vidro com algodão embebecido em álcool 70%, logo após colocando uma gota de água destilada sobre a lâmina e com uma alça de inoculação, colher uma pequena quantidade de crescimento bacteriano da superfície do Agar e suspendê-la na gota de água destilada, espalhando suficientemente para obter um esfregaço fino. Em seguida, deixar a lâmina secar em temperatura ambiente, fixando na chama da lamparina de modo a cortá-la por três vezes.
COLORAÇÃO DE GRAM
	Utilizando a técnica de coloração de Gram, é importante cobrir o esfregaço bacteriano com cristal violeta, deixando um minuto e verter o corante na cuba, removendo então o excesso da solução em uma lavagem levemente com água corrente. Após, cobrir o esfregaço com solução de lugol, deixando por um minuto e retirando a seguir, lavando com filete de água. Em seguida, descorar o esfregaço usando uma solução de álcool acetona, rapidamente por 10 a 15 segundos. Lava-se com água corrente e cobre o esfregaço, novamente, com Fucsina, deixando por 30 segundos e, após, lavar com água corrente e secar com papel absorvente.
	Com as lâminas prontas, levar ao microscópio para observação: focalizar, colocando uma gota de óleo de imersão sobre o esfregaço corado e observar com objetiva de 100x.
5. Resultados
	Tanto as células Gram-positivas quantos as Gram-negativas adquirem, de maneira idêntica, a coloração da etapa rpimária, e passam a apresentar um tom violeta resultante da formação do composto iodo para rosanilina, produto da reação do cristal violeta com o iodo. Este composto é hidrofóbico, insolúvel em água, havendo melhor dissolução nos lipídios da membrana plasmática.
	Ao utilizar o solvente orgânico (etanol) para lavar o esfregaço corado, dissolve a porção lipídica das membranas externas das células, que estavam impregnadas com o complexo iodo-para-rosanilina, deixando-as descoradas. A lavagem com álcool é crucial no processo de coloração, pois se houver exposição prolongada a este solvente, mesmo nas Gram-positivas, o corante será removido.
	Na observação das lâminas existem muitos micróbios. Atentando-se para a estrutura visualizada, pode-se observar a variação das células bacterianas, variando de 0,5 a 2 micrômeros. A imagem ali observada foi ampliada 100 vezes na parte da objetiva do microscópio e mais 10 vezes pela lente da ocular, o que faz com que qualquer objeto visualizado esteja 1000 vezes aumentado.
	Ao observar as lâminas, algumas células estão coradas em roxo e outras em rosa. As primeiras são aquelas que retiveram o corante da primeira fase (iodo-para-rosanilina), mesmo após a lavagem com álcool. Estas são definidas como Gram-positivas. Aquelas que descoraram são as Gram-negativas que, para serem visualizadas devem sofrer coloração de contraste com a fucsina.
	Bancada Suja
	Mão Suja
	Terra
6. Conclusão
	Com o término do experimento, Coloração de Gram, podemos notar que a técnica de Coloração de Gram permite diferenciar bactérias em função de seus envoltórios de superfície. As diferenças estruturais dos envoltórios bacterianos característicos das células Gram-positivas e Gram-negativas compreendem, na Gram-positiva a camada de peptídeoglicano (mureína) cobre a membrana plasmática da célula e, na Gram-negativa além da camada de mureína ser menos espessa, existe ainda uma segunda camada, que é a membrana externa.
	De ambas as células, as membranas são dissolvidas quando tratadas pelo álcol, fazendo com que estas células fiquem descoradas e passíveis de adquirirem a cor do corante contrastante. 
 	Sendo assim, a diferença em função dos envoltórios bacterianos pode ser utilizada como critério de classificação, pois as estruturas de superfície celulares são expressões do caráter genético de cada célula.
7. Referências 
BALEN, Rafael Ernesto. Roteiro de prática 3: Coloração de Gram. IFPR – Instituto Federal do Paraná. Microbiologia. Colegiado de Ciências Biológicas. 2017. Disponibilizado pelo professor.
PELCZAR, J.R.; PELCZAR, M. F. Microbilogia: conceitos e aplicações. 2ª Ed. São Paulo. Editora Makron Books. 2009.