APS Biologia molecular aplicada a Hemo

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UNIVERSIDADE PAULISTA
INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
CURSO DE BIOMEDICINA
APS – ATIVIDADE DE PRÁTICA SUPERVISIONADA
DISCIPLINA: BIOLOGIA MOLECULAR
 AVANÇOS TECNOLÓGICOS EM HEMATOLOGIA LABORATORIAL E TÉCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR APLICADAS.
Nome: Beatriz Chagas e Silva Pinto			 RA:B2041C-2
	 Camila Maira Azevedo				 B51AGB-5
	 
 	
 
SÃO PAULO
2014
Beatriz Chagas e Camila Maira
AVANÇOS TECNOLÓGICOS EM HEMATOLOGIA LABORATORIAL E TÉCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR APLICADAS.
sentado para avaliação na disciplina de
 psicologia aplicada a fisioterapia
 do curso de 
fisioterapia, 
turno 
noturno
 da Universidade 
Paulista – UNIP
.
Trabalho apresentado para avaliação na disciplina de
 psicologia aplicada a fisioterapia
 do curso de 
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 da Universidade 
Paulista – UNIP
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Trabalho apresentado para avaliação na disciplina de
 psicologia aplicada a fisioterapia
 do curso de 
fisioterapia, 
turno 
noturno
 da Universidade 
Paulista – UNIP
.Trabalho apresentado para avaliação na disciplina de Biologia Molecular do curso de Biomedicina, turno noturno da Universidade Paulista – UNIP.
						 Orientador: Profº Carlos Francischini
São Paulo
2014
RESUMO
	Durante as últimas décadas observou-se uma grande evolução tecnológica na realização de exames, e as técnicas manuais têm sido substituídas por sistemas automatizados que apresentam maior precisão nos resultados e em um menor intervalo de tempo. Essas inovações mudaram a rotina dos laboratórios, tornando-os mais eficientes e ágeis, além de apresentarem uma melhor qualidade nos resultados. "A automatização assegura a confiabilidade dos testes hematológicos em todas as fases, pois a padronização garante a eficiência dos resultados"
	
	A Biologia Molecular, apresenta especial preocupação com o estudo das características genéticas passadas de geração em geração. A chamada hereditariedade tem participação de uma série de fatores como o DNA, os genes, cromossomos e ainda outros fatores a serem considerados, a Biologia Molecular abre uma série de possibilidades para tratamentos, fabricação de remédios e ainda outras soluções para saúde. Estudar como funciona o sistema de herança genética pode ajudar a descobrir doenças que uma pessoa recém-nascida ou que ainda vai nascer tem mais possibilidade de obter ao longo da vida. Sendo assim, essa pessoa pode receber tratamento antes mesmo que a doença se manifeste ou que a mesma seja atingida pela tal doença.
	A prática das aplicações das técnicas de PCR e suas técnicas derivadas em diagnósticos moleculares tem se mostrado de grande efetividade, especialmente no diagnóstico de doenças cujo diagnóstico precoce é crucial no sucesso do tratamento. A reação de PCR constitui-se em um instrumento diagnóstico valioso, notadamente no caso de doenças infecciosas graves, por exemplo, devido à sua capacidade em detectar agentes infecciosos com maior sensibilidade e especificidade ,sem necessidade de se encontrarem parasitas viáveis na amostra biológica. A técnica de PCR possibilita uma nova estratégia na análise dos genes, dispensando todas as trabalhosas etapas de clonagem gênica. Ainda, há a possibilidade de adaptações da técnica de PCR a fim de melhorar a especificidade e a eficiência da reação.
	
	Com relação ao Fish (hibridação in situ com fluorescência) , essa técnica detecta DNA localizados dentro do cromossomo, usa laminas de microscopia, cromossomos estão em metáfase , anáfase e interfase , usa sondas de DNA específicos. E sobre o Southern blot é uma técnica de biologia molecular utilizada para conferir se uma determinada sequência de DNA encontra-se ou não presente em uma amostra de DNA analisada. Isto é realizado por meio de um realce da eletroforese em gel de agarose.
INTRODUÇÃO
	Os principais avanços científicos e tecnológicos são as principais causas de mudanças na prática da Imuno-hematologia,  promovendo excepcional desenvolvimento no diagnóstico laboratorial de diversas doenças hematológicas. O progresso obtido através de aplicações das técnicas de biologia molecular se tornam cada vez mais instrumentos laboratoriais de grande definição no diagnóstico e na prevenção de doenças hematológicas, notadamente aquelas de origem hereditária. O crescimento das aplicações tecnológicas que resultaram na automação dos laboratórios, além de produzir maior grau de reprodutibilidade dos resultados de exames e rapidez nas suas determinações, avançou para um grau de especificidade tal que deverá exigir dos médicos e dos profissionais de laboratórios constantes atualizações.
	O conhecimento das bases genéticas dos polimorfismos dos grupos sanguíneos, adquirido nos últimos anos, permitiu o desenvolvimento de diversos protocolos para deduzir o fenótipo eritrocitário, usando técnicas de biologia molecular, com aplicação na prática transfusional. Essas metodologias são vantajosas, em muitos casos, em relação aos métodos sorológicos utilizados na fenotipagem eritrocitária.
	
	A determinação do perfil de antígenos eritrocitários em doadores de sangue e pacientes que recebem transfusão sanguínea é importante na prevenção de aloimunização. Pacientes recentemente transfundidos ou com anemia hemolítica autoimune nem sempre conseguem ser fenotipados, e para estes casos a genotipagem vem se apresentando como uma ferramenta auxiliar na tipagem sanguínea.
	O uso da genotipagem também mostrou-se útil na identificação de anticorpos irregulares. Por sua precisão, facilidade de execução e viabilidade de custo, as técnicas para tipagem de DNA para sistemas sanguíneos vêm sendo usadas na prática transfusional, contribuindo para aumento da segurança dos pacientes cronicamente transfundidos ou com anemia hemolítica autoimune, como, por exemplo, pacientes com anemia falciforme. Além disso, ela vem permitindo o melhor uso de unidades de sangue com fenótipos menos frequentes na nossa população de doadores de sangue.
LISTA DE TABELAS
TABELA 1- Relação entre alguns antígenos CD, células e funções...........................10
TABELA 2- Relação entre determinantes celulares - CD e subpopulações de células identificadas................................................................................................................11
TABELA 3- Marcadores usados para auxiliar o diagnóstico das leucemias agudas e crônicas......................................................................................................................12 
TABELA 4- Síntese e ação das Interleucinas...........................................................14
HEMATOLOGIA LABORATORIAL
	
O Serviço de Hematologia Laboratorial é composto por duas áreas distintas que se complementam, a área da morfologia hematológica e a área da citometria de fluxo, cuja missão é a realização de análises na área Laboratorial, incluídas nos meios complementares de diagnóstico e terapêutica. Estas tarefas são efetuadas segundoo estado de arte e em tempo útil e adequado, tendo como destinatários todos os doentes em regime de internamento e/ou ambulatório que estão em tratamento da sua patologia oncológica.( 28)
	Apesar dos avanços científicos e da sofisticação da tecnologia laboratorial, o diagnóstico das doenças hematológicas depende quase exclusivamente da correlação entre a clínica e os aspectos morfológicos no esfregaço de sangue periférico.
	Na Unidade de Hematologia Laboratorial é efectuada a análise qualitativa e quantitativa dos elementos figurados do sangue (hemograma e medulograma), velocidade de sedimentação eritrocitária, o estudo de populações linfocitárias e a pesquisa e identificação de Malária (citometria e métodos imunológicos) bem como de outras parasitoses do sangue e medula, através da aplicação e desenvolvimento da tecnologia disponível.
	Todos os pedidos são, obrigatoriamente, acompanhados de informação clínica que é correlacionada com os parâmetros hematológicos, sendo a sua execução técnica e interpretação efetuada por pessoal com formação específica e experiente.
	Os estudos morfológicos das amostras de medula óssea são efetuados pelo Hematologista responsável pelo doente.( 29)
AVANÇOS TECNOLÓGICOS EM HEMATOLOGIA LABORATORIAL
	Os principais avanços científicos e tecnológicos são as principais causas de mudanças na prática da moderna hematologia, influindo especialmente no diagnóstico laboratorial e nos procedimentos terapêuticos de algumas patologias com destaques para anemia falciforme, hemofilias e leucemias. O progresso obtido pela imunologia tem alavancado o desenvolvimento do diagnóstico laboratorial de diversas doenças hematológicas mielo e linfoproliferativas, bem como determinando especificidades da fisiologia leucocitária diante das toxicidades de proveniências bacterianas e virais. Essas conquistas ultrapassaram as fronteiras das aplicações laboratoriais e forneceram conhecimentos importantes nos procedimentos terapêuticos (1, 5, 8).
	O crescimento das aplicações tecnológicas que resultaram na automação dos laboratórios, além de produzir maior grau de reprodutibilidade dos resultados de exames e rapidez nas suas determinações, avançou para um grau de especificidade tal que deverá exigir dos médicos e dos profissionais de laboratórios constantes atualizações. Os exemplos mais recentes se baseiam na moderna imunohematologia direcionada à diferenciação das células, em especial dos leucócitos, por meio da identificação de seus antígenos conhecidos por "cluster of differentiation" ou CD, bem como da caracterização funcional das citocinas. Por outro lado, a biologia molecular se torna cada vez mais um instrumento laboratorial de grande definição (9).
DIFERENCIAÇÃO CELULAR OU CD
	Todas as células possuem em suas composições estruturais de membranas proteínas específicas capazes de serem reconhecidas por anticorpos sintetizados em laboratórios – os anticorpos monoclonais. Para os anticorpos monoclonais as proteínas de membrana de células blásticas, linfócitos, monócitos, entre outras, são identificadas como "antígenos celulares". Porém, observou-se que grupos de diferentes anticorpos monoclonais reconheciam o mesmo antígeno celular presente em mais de uma célula, quer fossem normais, malignas ou células de linhagens evolutivas. Esses antígenos de diferenciação celular reconhecidos por grupos de anticorpos monoclonais foram denominados por grupo de diferenciação celular ou CD (6, 7). Foram reconhecidos em experimentação laboratorial perto de 170 diferentes tipos de CD, conhecidos por CD1, CD2, CD3, CD4, etc., cujas relações entre as células identificadas e suas funções específicas também foram relacionadas. A tabela 1mostra a relação entre alguns antígenos CD selecionados com distribuição celular e funções específicas. Um dos exemplos mais conhecidos da aplicação de marcadores CD se refere à avaliação laboratorial da resistência imunológica em pacientes com AIDS por meio da determinação dos linfócitos CD4 (auxiliar) e CD 8 (citotóxico). Da mesma forma, a determinação do marcador CD 34 tem sido importante na determinação da presença de células progenitoras do sistema hematopoiético em sangue de medula óssea (8). As figuras 1a e 1b mostram a expressão dos antígenos de superfície durante a maturação dos linfócitos T e B.
	Entretanto, é com relação aos linfócitos e macrófagos que é possível antever a importância da determinação dos CD para diferenciar subpopulações das importantes células do nosso sistema imunológico, conforme mostra a tabela 2 (3, 6).
	Atualmente o uso de anticorpos monoclonais para identificar antígenos de diferenciação celular está sendo aplicado para investigar e caracterizar laboratorialmente a maioria das leucemias agudas e crônicas de origens mielóide e linfóide (Tabela 3)(9).
 
 
CITOCINAS
	Citocinas é o termo genérico empregado para designar um grupo muito extenso de moléculas envolvidas na emissão de sinais entre as células durante o desencadeamento das respostas imunes (figura 2). Todas as citocinas são pequenas proteínas ou peptídeos, algumas contendo moléculas de açúcar ligadas (glicoproteínas). As diferentes citocinas podem ser enquadradas em diversas categorias: interferons (IFN), interleucinas (IL), fator estimulador de colônias (CSF), fator de necrose tumoral (TNFa e TNFb), e fator de transformação de crescimento (TGF b).
	
	Os interferons são moléculas proteicas particularmente importantes na limitação da propagação de determinadas infecções virais. Um grupo de interferons (IFN a e IFNb) é produzido por células infectadas por vírus, e um outro grupo (IFN g) é sintetizado por determinadas células ou linfócitos T ativados. Os interferons induzem um estado de resistência antiviral em células teciduais não infectadas. Os IFN são produzidos na fase inicial da infecção e constituem a primeira linha de resistência a muitas viroses (3, 4).
	As interleucinas compõem um grande grupo de citocinas denominadas por IL-1 a IL-15, produzidas principalmente por células T, embora algumas sejam sintetizadas também por macrófagos e células teciduais. As interleucinas possuem uma variedade de funções, mas a maioria delas está envolvida na indução da divisão de outras células. Cada interleucina atua sobre um grupo limitado e específico de células que expressam receptores adequados para cada interleucina (tabela 4). É importante destacar que a hematopoiese é regulada por mais de uma interleucina. As IL-1 e IL-6 estão envolvidas na ativação do ciclo celular das células-tronco em repouso (ou autorenováveis). A IL-3 está envolvida no crescimento dos precursores das linhagens hemopoiéticas da mesma forma que o fator estimulador de colônias de granulócitos/macrófagos (GM – CSF). Na medida em que as células se diferenciam, citocinas específicas de linhagens apresentam atividades importantes; a eritropoietina para os eritrócitos, o fator estimulador de colônias de macrófagos (M – CSF) para os macrófagos, o fator estimulador de colônias de granulócitos (G – CSF) para os granulócitos, entre outros (1, 6).
	Os fatores estimuladores de colônias (CSF) estão diretamente relacionados na divisão e diferenciação das células-tronco na medula óssea, bem como dos precursores dos leucócitos sanguíneos. A quantidade de diferentes CSF é parcialmente responsável pelas proporções dos diferentes tipos celulares que serão produzidos. Alguns CSF também promovem a diferenciação extramedular de células (3, 8).
	Finalmente outras citocinas além das acima citadas, como são os casos do fator de necrose tumoral - TNFa e TNFb e do fator de transformação de crescimento (TGF b) que, embora possuem várias funções, são particularmente importantes nas reações inflamatórias e citotóxicas (6).
	Nesse contexto específico das citocinas, o futuro da hematologia laboratorial certamente deverá estar direcionada na monitoração quantitativa e na determinação qualitativa das diferentes interleucinas, bem comonas respostas às reações fisiopatológicas causadas por processos inflamatórios e citotóxicos(9).
 BIOLOGIA MOLECULAR
	A Biologia Molecular tem como campo de estudo as interações bioquímicas celulares envolvidas na duplicação do material genético e na síntese protéica.
	É uma área intimamente ligada à genética e à bioquímica. A Biologia Molecular consiste principalmente em estudar as interações entre os vários sistemas da célula, partindo da relação entre o DNA, o RNA e a síntese de proteínas, e o modo como essas interações são reguladas.
	Assim, o cerne da Biologia Molecular compreende o estudo dos processos de replicação, transcrição e tradução do material genético e a regulação desses processos. (30)
	Ao longo da história, os estudos de como cada parte de nosso corpo funciona têm se intensificado. Biologia, Química, Física e outras áreas de estudo como Biofísica, Genética, Bioquímica, incluem, em alguma parte de seus estudos, pesquisas que buscam desvendar mistérios do nosso corpo.
	Uma dessas áreas é a Biologia Molecular, apontada por muitos como tendo início no ano de 1953. Apresenta especial preocupação com o estudo das características genéticas passadas de geração em geração. A chamada hereditariedade tem participação de uma série de fatores como o DNA, os genes, cromossomos e ainda outros fatores a serem considerados. A genética também estuda esses fenômenos, a diferença fica por conta do nível em que se trabalha: a genética faz análises em nível celular, por isso o nome biologia celular; enquanto a Biologia Molecular, como o próprio nome fala, estuda esses acontecimentos em nível molecular.
	Essa área é, relativamente, nova. Antes, já havia outras ciências que já trabalham com seu material de estudo, talvez por isso, a Biologia Molecular esteja intimamente ligada a outras áreas. Sua história se mistura com a de outras ciências e mesmo hoje sua atuação tem a cooperação de ciências como Bioquímica, Genética e outras.
Com a possibilidade de estudar essas características em condições mais aprofundadas, a Biologia Molecular abre uma série de possibilidades para tratamentos, fabricação de remédios e ainda outras soluções para saúde. Estudar como funciona o sistema de herança genética pode ajudar a descobrir doenças que uma pessoa recém-nascida ou que ainda vai nascer tem mais possibilidade de obter ao longo da vida. Sendo assim, essa pessoa pode receber tratamento antes mesmo que a doença se manifeste ou que a mesma seja atingida pela tal doença.
	Pelo grande potencial que tem, a Biologia Molecular é uma área vista como promissora num cenário científico de tradicionais campos de pesquisas. Além do mais, qualquer estudo que busque entender o funcionamento do corpo é válido e merece atenção. (31)
TÉCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR APLICADAS EM ANÁLISES CLÍNICAS
	A aplicação cada vez mais abrangente de técnicas de biologia molecular em análises clínicas pode ser resumida por meio do uso de três métodos cientificamente aprovados para este fim: "Southern blotting", Reação em Cadeia da Polimerase ou PCR, e Hibridização "In Situ" por Fluorescência ou FISH.
Southern blotting
	Nesta metodologia, o DNA é extraído de células e tratado com enzimas que rompem as ligações químicas entre determinadas bases nitrogenadas da molécula de DNA. Essas enzimas, extraídas de bactérias, são conhecidas por endonucleases de restrição. Os fragmentos da molécula de DNA resultantes do tratamento enzimático são separados (ou fracionados) eletroforeticamente. Entretanto, a separação dos fragmentos de DNA somente poderá ser revelada por meio das suas impressões extraídas do gel de agarose da eletroforese para uma membrana de náilon ou de nitrocelulose, como se fosse um "mata borrão" ou "blotting" (em inglês) e reveladas por sondas radioativas. Essa técnica foi descrita pelo pesquisador E. M. Southern em 1975, surgindo daí o "Southern blotting". O grande problema atual deste método é o tempo consumido para a revelação dos resultados que chega a ser de aproximadamente uma semana (1, 2, 5).
	Southern blotting é então, a transferência de DNA desnaturado de um gel de agarose para uma membrana (em geral de nylon ou material semelhante), onde ele poderá ser analisado com o uso de uma sonda de DNA ou de RNA.
	As figuras abaixo resumem o processo que vai desde a separação eletroforética do DNA fragmentado até a visualização das bandas (fragmentos) reativos com a sonda.
	Inicialmente o processo pede que o DNA do organismo em estudo seja quebrado em pedaços que possam migrar na eletroforese, isto pode ser feito mecanicamente (por nebulização, por exemplo), ou com o uso de enzimas de restrição). 
	O resultado será sempre um conjunto muito grande de fragmentos com tamanhos diferentes, que formarão uma faixa (mancha de arraste) borrada no gel, quando tentamos verificar o resultado da corrida eletroforética. Em geral empregamos um gel de agarose para isto. A cuba é horizontal e as amostras são aplicadas em pequenos poços moldados no gel antes que ele endureça com o auxílio de um pente adequado. Os fragmentos de DNA, normalmente negativos, vão correr para o pólo positivo (veja figura 1).
Figura 1: O gel de agarose (em vermelho) vai separar os fragmentos de DNA aproximadamente de acordo com seus tamanhos. Ao ser aplicado um campo elétrico entre um lado e o outro do gel, as amostras vão atravessar o gel. Após a eletroforese o DNA é desnaturado (através da adição de NaOH ou de outros produtos químicos adequados); o uso de um tampão 3M NaCl estabiliza a desnaturação.
	Uma vez separados os fragmentos e desnaturados com NaOH, eles serão transferidos para uma membrana de nylon através de um sistema baseado no arraste hidrodinâmico capilar, exatamente da mesma forma como a tinta é absorvida por um papel mata-borrão. Este processo é o blot, propriamente dito, e está ilustrado na figura abaixo.
Figura 2: O gel é colocado sobre um papel de filtro Whatman, cujas pontas estão imersas em tampão citrato/ NaCl 3M (chamado tampão de transferência). Sobre o gel coloca-se a membrana de nylon e sobre ela uma pilha de papel absorvente comum (papel toalha, por exemplo). Por fim coloca-se uma placa de plástico resistente e um peso sobre tudo. O tampão que está em baixo do gel será chupado por capilaridade através da membrana de nylon (que é porosa) para a pilha de papel absorvente. Este movimento de líquido transfere mecanicamente o DNA que está no gel para o filtro. A membrana de nylon adere o DNA.
	Por fim, o DNA na membrana tem que ser "sondado". Para tal a membrana deve ser seca e o DNA fortemente ligado ao nylon, o que é obtido com a exposição do material ao UV. Em seguida coloca-se a membrana num saco para congelamento contendo a solução de hibridização e a sonda marcada. Após várias horas ou dias a membrana, já com a sonda aderida às regiões com complementariedade, é retirada, lavada extensivamente e cuidadosamente colocada em contato com um filme próprio (que será exposto pela marcação da sonda: se a sonda for radiativa, por exemplo, será um filme de raio X). Por fim, o filme é retirado, revelado e as bandas observadas indicarão aa posições no gel onde houve reconhecimento de sequências pelas sonda. 
Figura 3: Revelação do Southern blot. A membrana seca e com o DNA já submetido ao cross linking com a membrana é colocada para hibridizar com a sonda a -80 oC. Em seguida ela é acondicionada num cassete junto com o filme que deve ser sensível à marcação da sonda e por fim o filme é revelado.( 32)
 
Reação em Cadeia da Polimerase – PCR 
	O processo de PCR foi descrito por Kary Mullis no final da década de 1980, tendo-lhe sido posteriormente, em 1993, atribuído o Prêmio Nobel de Química pelo seu trabalho. Em 1989, a Hoffman La Roche & Perkin-Elmer Corporationpatentearam este processo. 
Princípios da Reação de PCR
	A reação de polimerização em cadeia (“Polimerase chain reaction”, PCR) é a técnica que permite a amplificação do DNA ou cDNA in vitro, utilizando-se basicamente de uma reação enzimáticacatalizada pela polimerase (enzima termoestável) cuja atividade depende de ions Mg++
Ocorre em 3 etapas: 
	
	I) “Melting”(ou desnaturação que consiste na separação da dupla fita do DNA a ser amplificado). Inicialmente é necessário que as duas fitas de DNA a ser amplificado sejam separadas. A elevação da temperatura entre 90 a 95 ºC promove a separação da fita dupla de DNA em duas fitas simples. Muitas vezes a temperatura de desnaturação é determinada empiricamente e depende de alguns fatores como a quantidade de guanina e citosina (GC) do fragmento DNA alvo ou de interesse.
	II) “annealing”( anelamento ou hibridização- ligação do iniciador ou “primer” ao DNA a ser amplificado). A polimerase para anexar as bases complementares, transformando as fitas simples em fitas duplas, necessita de um fragmento de DNA já ligado na região previamente escolhida. Para isso adicionam-se, à solução, os “primers” ou iniciadores que são pequenos fragmentos sintéticos de DNA de fita simples, oligonucleotídeos de 20 a 30 bases nitrogenadas de comprimento, que são sintetizados in vitro baseado na sequência do DNA a ser amplificado sendo eles complementares à seqüência do segmento de DNA de interesse. Nas duas fitas surgem, assim, um pequeno fragmento de DNA de dupla fita intacta. A hibridização dos “primers” descrito como “Annealing” (do inglês), deve ser feito a uma tempertura inferior à da desnaturação (45 a 70°C).
	III) “extension” (extensão ou seja a polimerização propriamente dita). Quando os '' primers'' encontram e ligam-se aos segmentos complementares, a DNA-Polimerase liga aos nucleotídeos entre si, completando assim as fitas simples e tornando-as duplas (extensão) A DNA-Polimerase não reconhece apenas o bloco de início como também consegue diferenciar as duas extremidades dos ''primers'' (3' e 5'). Ela inicia a reação sempre pela extremidade 3’ do “primer”, completando a fita simples daí em diante, portanto, sempre na direção do fragmento procurado.
Automação da PCR
	Um aparelho de PCR, ou um termociclador, repete o correspondente a programa de temperaturas. O operador deve apenas programar e dar início para que transcorra a amplificação. Técnicamente muitas mudanças tem sido introduzidas melhorando cada vez mais e ampliando a sua utilização. Para cada situação experimental, novas modificações têm de ser introduzidas, de tal forma que é muito difícil descrever um único procedimento para um uso generalizado. Por outro lado, é fundamental o conhecimento básico das etapas envolvidas na técnica, para um desenho experimental com sucesso.
	Após cada ciclo, o número de fragmentos se duplica: de um formando-se 2, e então novamente 4, 8, 16, 32, 64, 128... de tal forma que pode ser definida matematicamente por:
N = número de moléculas amplificadas
No = número de moléculas iniciais
n = número de ciclos de amplificação
	
	Cada uma das novas fitas de DNA extendidas a partir dos primers serve como molde para a síntese de uma nova fita. Isso garante o aumento exponencial do
número de novas fitas.
	Todas as fitas de DNA sintetizadas durante a PCR tem a sequência dos primers na extremidade 5’ e a sequência complementar aos primers na posição 3’.( 33)
	O advento do PCR revolucionou a tecnologia molecular em muitas especialidades médicas. Seu uso laboratorial teve grande progresso devido à simplicidade técnica e à rapidez em se obter os resultados. A técnica do PCR é um processo rápido de replicação seletiva de um determinado trecho do DNA genômico "in vitro". A replicação se faz por etapas, tal como se segue:
	a) Após a extração do DNA seleciona-se o trecho que se deseja reproduzir ou amplificar até obter a quantidade suficiente para análise;
	b) Com drogas específicas desnatura-se a dupla hélice do DNA, separando-a em duas fitas simples e correspondentes de bases nitrogenadas;
	c) Com o uso da DNA polimerase (obtido da bactéria Thermus aquaticus – Taq polimerase) submetida a condições específicas de tempo e temperatura (ou ciclos), cada fita simples se duplica em duas novas moléculas de DNA; e este processo é repetido em número suficiente de vezes para obter a quantidade necessária para análise, cerca de um milhão de cópias do original.
	Os produtos obtidos pela técnica do PCR podem ser analisados por várias técnicas suplementares das quais a mais comum é a eletroforese em gel de agarose. Uma variação do PCR é o PCR-transcriptase reversa ou RT-PCR, que usa o RNA extraído da amostra que se deseja analisar e dele se faz cópias de DNA. O DNA copiado é posteriormente replicado conforme exposição acima. O RT-PCR é particularmente usado para análises de translocações cromossômicas (5).
Hibridização "in situ" por fluorescência – FISH 
	Esse método molecular usa sondas fluorescentes para observar genes ou sequências de DNA em cromossomos.
	Seres humanos normalmente têm 23 pares de cromossomos: 22 pares independentes do sexo (autossomos) e um par de cromossomos sexuais (XX em mulheres e XY em homens). Os cromossomos contêm DNA (ácido desoxirribonucleico) e proteínas associadas. O DNA é uma sequência de quatro bases que se repetem formando milhares de genes que dirigem a produção de proteínas no corpo e determinam nossas características físicas. Contem duas cadeias complementares que formam uma hélice dupla, como uma escada em espiral.
	No método FISH, uma amostra de células da pessoa é fixada em uma lâmina de vidro, incluindo células do sangue, da medula óssea, do líquido amniótico ou de tumores, dependendo da indicação do exame. As lâminas são, então, aquecidas para separar as duas cadeias do DNA das células. Sondas fluorescentes que contêm sequências de DNA complementares à que se deseja observar são adicionadas e se ligarão à sequência pretendida nas células. Quando as lâminas são examinadas em um microscópio de fluorescência, os genes correspondentes às sondas podem ser observados como manchas fluorescentes brilhantes contra um fundo escuro.
	Esse método é usado para mostrar a presença de um excesso de cópias de um gene (genes duplicados ou amplificados) e sequências que estão em falta (deleções de genes) ou se moveram (translocação de genes). Um aumento do número de cromossomos, como na trissomia 21, ou síndrome de Down, também pode ser diagnosticado com esse método. Diversas sequências de DNA podem ser investigadas na mesma lâmina usando sondas com corantes fluorescentes de cores diferentes.( 34)
	Exemplo em Hematologia:
Leucemia A Figura mostra o método FISH usado para pesquisar a sequência BCR-ABL na leucemia mieloide crônica. Essa sequência anormal é formada pela translocação de uma parte do cromossomo 22 (BCR, em verde) com uma parte do cromossomo 9 (ABL1, em vermelho). A mancha amarela (mistura de vermelho e verde) mostra o gene formado pela fusão. O achado da sequência BCR-ABL confirma o diagnóstico de leucemia mieloide crônica e permite prever a resposta ao medicamento imatinib.(34)
	A técnica de FISH se resume na detecção de sequências específicas de DNA ou RNA diretamente nos cromossomos de células previamente isoladas para este fim. A análise é realizada em microscópio por meio da geração de um sinal brilhante e colorido nos núcleos das células em metafase e interfase. A FISH é particularmente útil na demonstração de monossomias ou trissomias cromossômicas, bem como nas translocações – notadamente para a identificação da leucemia mielóide crônica – e também na detecção de deleções e amplificações de genes específicos (4).
USO DA GENOTIPAGEM DE GRUPOS SANGUÍNEOS NA ELUCIDAÇÃO DE CASOS INCONCLUSIVOS NA FENOTIPAGEM ERITROCITÁRIA 
	Os sistemas de grupos sanguíneos são caracterizados por antígenos na membrana eritrocitária, com características funcionais e polimórficas definidas. Atualmente, já foram descritos 30 sistemas de grupos sanguíneos, de acordo com a ISBT (International Society for Blood Transfusion)(10). Na medicina transfusional, a compatibilidade para o sistema ABO e para o antígeno D do sistema Rh é fundamental naprevenção de reações hemolíticas, embora seja desejável que outros antígenos sejam compatibilizados, especialmente C, c, E, e do sistema Rh, assim como os principais antígenos dos sistemas Kell, Kidd, Duffy e MNS(11,12,13). O conhecimento das bases genéticas dos polimorfismos dos grupos sanguíneos, adquirido nos últimos anos, permitiu o desenvolvimento de diversos protocolos para deduzir o fenótipo eritrocitário, usando técnicas de biologia molecular, com aplicação na prática transfusional(14,15). Essas metodologias são vantajosas, em muitos casos, em relação aos métodos sorológicos utilizados na fenotipagem eritrocitária, como: identificação do risco para a doença hemolítica do recém-nascido, determinação dos grupos sanguíneos quando os anticorpos (reagentes) não estão disponíveis, identificação de variantes raras, auxílio na identificação de anticorpos irregulares e, principalmente, na conclusão do grupo sanguíneo em pacientes que receberam transfusão recente ou apresentam resultado positivo no teste direto de antiglobulina humana (TAD). Na hemoterapia, a determinação correta do grupo sanguíneo é importante não apenas para prevenir problemas devido a transfusões incompatíveis, mas também para permitir um melhor uso das unidades de hemocomponentes com fenótipos menos frequentes, já que a frequência dos grupos sanguíneos depende da etinicidade da população(16).
APLICAÇÃO DA BIOLOGIA MOLECULAR EM HEMATOLOGIA 
	As aplicações da tecnologia molecular em hematologia poderão elucidar o conhecimento das alterações moleculares de doenças, tal como ocorre atualmente na caracterização das lesões do gene da globina beta nas talassemias do tipo beta e na identificação dos haplótipos da Hb S. Entre as técnicas de biologia molecular, o PCR revolucionou as tendências de aplicabilidade da biologia molecular, não somente pela sua simplicidade, mas pelo rápido diagnóstico de doenças infecciosas, na detecção de doença residual mínima em diversas malignidades hematológicas onde se conhece o defeito molecular, e notadamente na detecção de portadores e no diagnóstico pré-natal de hemofilias e anemias hereditárias. Finalmente, os objetivos mais profundos das aplicações dos conhecimentos de biologia molecular se direcionam na clonagem e sequenciamento de genes para identificar, caracterizar e manipular os gene responsáveis por doenças e produtos tóxicos específicos(1,5).
TÉCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR APLICADAS EM HEMOTERAPIA E BANCO DE SANGUE
	O conhecimento atual sobre genética dos grupos sanguíneos tem permitido o uso das técnicas de biologia molecular como uma importante ferramenta na prática hemoterápica. Além da acurácia na determinação do fenótipo eritrocitário, a genotipagem de grupos sanguíneos pode auxiliar na identificação de anticorpos irregulares, bem como na economia de unidades de sangue de fenótipos menos freqüentes na população. Isto pode ser exemplificado em resultados encontrados em pacientes portadores de anemia falciforme, cujos fenótipos RhD eram indeterminados e puderam ser concluídos como RhD positivo por genotipagem. Estes pacientes, que antes recebiam transfusões com hemocomponentes RhD negativo, passaram a receber sangue RhD positivo com segurança(10).
	A eficiência dos testes moleculares na genotipagem de grupos sanguíneos deve considerar a complexidade dos sistemas, em relação aos polimorfismos de seus alelos. A aloimunização é comum em pacientes politransfundidos. Embora não obrigatória pela legislação vigente, a frequência de aloimunização pode ser diminuída com o uso da fenotipagem estendida para doadores e pacientes, que pode ser auxiliada pela genotipagem.
	A genotipagem de grupos sanguíneos já vem sendo utilizada com êxito na medicina transfusional. Atualmente, muito se tem falado sobre novas metodologias de genotipagem, especialmente as que permitem sua utilização em larga escala(23,24). A esperança é que esta metodologia permita a realização da genotipagem de grupos sanguíneos em larga escala, de forma automatizada, rápida e segura e que possa ser utilizada nas rotinas dos bancos de sangue(27). Estudos demonstram que mesmo as técnicas moleculares convencionais (PCR alelo-específica e PCR-RFLP) podem ser usadas com sucesso em um banco de sangue de grande porte, no esclarecimento de casos em que as técnicas sorológicas são ineficazes para conclusão dos resultados. O sucesso dessa metodologia reside principalmente na ausência da necessidade de equipamentos especializados e de alta tecnologia, o que frequentemente inviabiliza a aplicação de determinadas técnicas. Ao contrário, a metodologia empregada necessita apenas de equipamentos e insumos básicos de biologia molecular. Além disso, os custos não são elevados, o que permite seu uso rotineiro como metodologia auxiliar na hemoterapia(10). 
	A utilização das ferramentas de biologia molecular tem sido fundamental para a inserção de novas metodologias na rotina laboratorial da Imuno-hematologia, aumentando a segurança e eficácia transfusional de pacientes politransfundidos. Isto pode ser facilmente visualizado durante os procedimentos de genotipagem de grupos sanguíneos, onde as técnicas moleculares suprem as deficiências das técnicas de hemaglutinação, principalmente na fenotipagem de pacientes com transfusão recente, quando há hemácias do doador na circulação do receptor e em pacientes com autoanticorpos. Estudos mostram que a presença de leucócitos nos produtos de sangue transfundidos não interfere na genotipagem de grupos sanguíneos. Assim, pacientes politransfundidos com transfusão recente podem ser genotipados para a determinação do seu perfil antigênico, possibilitando a utilização de transfusões fenótipo compatível e maior segurança na investigação sorológica e identificação do(s) anticorpo(s)(27).
	A aplicação da biologia molecular em imuno-hematologia sem dúvida terá um grande impacto na medicina transfusional. Os problemas encontrados na rotina de doadores de sangue, como a busca de hemácias antígeno-negativo e a identificação correta de indivíduos RhD-negativo serão facilmente solucionados(27). 
	Na área da medicina transfusional, a possibilidade de fornecer sangue fenótipo compatível para pacientes politransfundidos abre uma nova perspectiva, podendo inclusive reduzir o número de testes pré-transfusionais. Embora seja pouco provável que a genotipagem molecular venha a substituir totalmente a hemaglutinação nos próximos anos, estas técnicas utilizadas em conjunto têm um valor potencial importante na segurança transfusional e materno-fetal(27).
	No Brasil, esta abordagem vem sendo introduzida aos poucos em algumas instituições de reconhecida competência na Hemoterapia, mas sua disponibilização deve tornar-se mais generalizada, através da formação de centros de referência para atendimento das diversas unidades hemoterápicas. Mostrando que é possível implantar o aprimoramento tecnológico para aplicação de novos métodos diagnósticos no atendimento aos pacientes da rede SUS. Pelo nosso conhecimento, este é o primeiro serviço público de saúde a usar técnicas de genotipagem de grupos sangüíneos para atendimento a seus pacientes(10).
CONSIDERAÇÕES FINAIS
	Biologia Molecular apresenta especial preocupação com o estudo das características genéticas passadas de geração em geração. Pelo grande potencial que tem, a Biologia Molecular é uma área vista como promissora em um cenário científico de tradicionais campos de pesquisas. Além do mais, qualquer estudo que busque entender o funcionamento do corpo é válido e merece atenção.
	Das técnicas mencionadas no contexto, podemos notar que :
	
	A reação em cadeia de polimerase (PCR) aumentou a acurácia diagnóstica, mas as técnicas ainda não foram padronizadas e os resultados variam entre os laboratórios Também tornou-se possível determinar o genótipo do patógeno por método de diagnóstico molecular em laboratórios clínicos, o que pode ser útil em situações específicas. A disponibilidade de diferentes testesviabiliza o diagnóstico precoce, minimizando o potencial para disseminação da infecção e torna relevante a discussão das indicações de cada teste a partir de sua sensibilidade e especificidade.Há quase vinte anos após os primeiros relatos do emprego da PCR para o diagnóstico molecular terem sido publicados, tais testes ainda não foram disponibilizados comercialmente e não são usados além do ambiente de pesquisa. Além do custo, pode ser citada a necessidade de sua execução em laboratórios com elevada tecnologia e com espaço exclusivo para a sua realização, como os principais fatores limitantes no que diz respeito ao emprego do teste de PCR em situação ambulatorial ou hospitalar, ou mesmo na rotina dos bancos de sangue. Diante desta situação, existe a necessidade de padronização das técnicas de PCR em diagnósticos por meio de mais estudos de como devem ser os padrões-ouro, para depois ocorrer uma padronização nas técnicas que culminem, inclusive, na sua redução de custo, tornando-a disponível nos ambientes clínicos e hospitalares. A FISH demonstra ser uma técnica com grande potencialidade de uso rotineiro, pois associa agilidade de execução, alta sensibilidade e especificidade e visualização do agente infeccioso viável no tecido.
	Em alguns casos, os patologistas são forçados a utilizar métodos in situ, como a imunofluorescência , para detecção dos micro-organismos, porém, o número de anticorpos disponíveis comercialmente é restrito, e a aplicação desse método requer uma suspeita etiológica prévia. A possibilidade de associar lesões histológicas com análise molecular de genes que abrangem domínios como “gêneros” atendem essa demanda. Outra grande vantagem da técnica é a possibilidade de estudos retrospectivos, pois a hibridização é feita em cortes histológicos fixados em formalina e parafinizados, portanto, materiais de arquivo ou museus representam um estoque único de uma doença específica a ser confirmada.
REFERÊNCIAS
1. Fielding A.K., Ager S., Russell S.J. The future of haematology, molecular biology, and gene therapy. In: ABC of Clinical Haematology, edited by Drew Provan and Andrew Henson. BMJ Publishing Group, London, 1998.        
2. Hoffbrand A.V., Lewis S.M., Tuddenham E.G.D. Postgraduate Haematology, 4th ed. Buttenworth-Heinemann Publishers, 1999.        
3. Janeway Jr C.A., Travers P. Imunobiologia. Editora Artes Médicas, Porto Alegre, 1997.        
4. Playfair J.H.L., Lydyard P.M. Medical immunology, 2nd. Ed. Churchill Livingstone Publ., Endinburgh, 2000.        
5. Provan D., Gribben J. Molecular haematology. Blackwell Sciences Ltd, Oxford, 2000.        
6. Roitt I., Brostoff J., Male D. Imunologia. Editora Manole Ltda, São Paulo, 1997.        
7. Stiene-Martin A.E., Lotspeich-Steininger C.A., Koepke J.A. Clinical Haematology. Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1998.        
8. Todryk S. Roads that lead to tumour immunotherapy? Mod. Asp. Immunobiol., 2000; 1: 114-118.
9. NAOUM, P. C. Avanços tecnológicos em hematologia laboratorial. Rev. Bras. Hematol. Hemoter. vol.23 no.2 São José do Rio Preto May/Aug. 2001.
10.MARTINS M. L.; CRUZ K. V. D.; SILVA M. C. F.; VIEIRA Z. M. Uso da genotipagem de grupos sanguíneos na elucidação de casos inconclusivos na fenotipagem eritrocitária de pacientes atendidos na Fundação Hemominas. Rev. Bras. Hematol. Hemoter. vol.31 no.4 São Paulo July/Aug. 2009 Epub Aug 2009
11. Daniels GL, Fletcher A, Garratty G, Henry S, Jørgensen J, Judd WJ, et al. Blood group terminology 2004: from the International Society of Blood Transfusion committee on terminology for red cell surface antigens. Vox Sang. 2004;87(4):304-16.         
12. Castro O, Sandler SG, Houston-Yu P, Rana S. Predicting the effect of transfusing only phenotype-matched RBCs to patients with sickle cell disease: theoretical and practical implications. Transfusion 2002;42:684-690.         
13. Osby M, Shulman IA. Phenotype matching of donor red blood cell units for nonalloimmunized sickle cell disease patients: a survey of 1182 North American laboratories. Arch Pathol Lab Med. 2005; 129(2):190-3.         
14. Schonewille H, van de Watering LM, Loomans DS, Brand A. Red blood cell alloantibodies after transfusion: factors influencing incidence and specificity. Transfusion. 2006;46(2):250-6.
15. Daniels G, van der Schoot CE, Olsson ML. Report of the First International Workshop on molecular blood group genotyping. Vox Sang. 2005;88(2):136-42.        
16. Westhoff CM. Molecular testing for transfusion medicine. Curr Opin Hematol. 2006;13(6):471-5.       
17. Castilho L, Rios M, Bianco C, Pellegrino J Jr, Alberto FL, Saad ST, et al. DNA-based typing of blood groups for the management of multiply-transfused sickle cell disease patients. Transfusion. 2002; 42(2):232-8.         
18. Maaskant-van Wijk PA, Faas BH, de Ruijter JA, Overbeeke MA, von dem Borne AE, van Rhenen DJ, et al. Genotyping of RHD by multiplex polymerase chain reaction analysis of six RHD-specific exons. Transfusion. 1998;38(11-12):1015-21.
19. Singleton BK, Green CA, Avent ND, Martin PG, Smart E, Daka A, et al. The presence of an RHD pseudogene containing a 37 base pair duplication and a nonsense mutation in africans with the Rh D-negative blood group phenotype. Blood. 2000;95(1):12-8.       
20. Gassner C, Schmarda A, Kilga-Nogler S, Jenny-Feldkircher B, Rainer E, Müller TH, et al. RHD/CE typing by polymerase chain reaction using sequence-specific primers. Transfusion. 1997;37 (10):1020-6.         
21. Reid ME, Rios M, Powell VI, Charles-Pierre D, Malavade V. DNA from blood samples can be used to genotype patients who have recently received a transfusion. Transfusion. 2000;40(1):48-53.         
22. Flegel WA. How I manage donors and patients with a weak D phenotype. Curr Opin Hematol. 2006;13(6):476-83
23. Avent ND, Reid ME. The Rh blood group system: a review. Blood. 2000;95(2):375-87.         
24. Flegel WA. Molecular genetics of RH and its clinical application. Transfus Clin Biol. 2006;13(1-2):4-12.
25. Rodrigues A, Rios M, Pellegrino J Jr, Costa FF, Castilho L. Presence of the RHD pseudogene and the hybrid RHD-CE-D(s) gene in Brazilians with the D-negative phenotype. Braz J Med Biol Res. 2002;35(7):767-73.         
26. Martins PRJ, Alves VM, Pereira GA, Moraes-Souza H. Freqüência de anticorpos irregulares em politransfundidos no Hemocentro Regional de Uberaba-MG, de 1997 a 2005. Rev Bras Hematol Hemoter. 2008;30:272-276.         
27.Imuno-hematologia molecular:onde estamos e para onde vamos? Rev. Bras. Hematol. Hemoter.2009.
REFERÊNCIAS ELETRÔNICAS
28.http://ipoporto.pt/servico/hematologia-laboratorial/
29.http://www.chc-hematologia.org/index.php?module=units&id=733
30.http://www.biomol.org/
31.http://biologia-molecular.info/)
32.https://www.ufpe.br/biolmol/Genetica-Medicina/southern_blot.htm
33.http://www.dag.ufla.br/site/_adm/upload/file/Luciane%20Vilela%20Resende/PCR_2_[Modo_de_Compatibilidade][1].pdf
34.http://labtestsonline.org.br/understanding/features/methods/start/4/