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aula expressao proteinas

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03/03/2017
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Proteínas e 
Sistemas de expressão I
Aula 3 - Profa Dra Ilana L. B. C. Camargo
Ciências Físicas e Biomoleculares
IFSC - USP
Síntese de proteínas: 
Tradução e transcrição em procarioto e eucarioto;
Objetivos da expressão de proteínas na produção industrial;
A escolha do Sistema de expressão
1. Sistema de expressão 1: bactéria E. coli
1.1. Vetores comerciais
1.2. Problemas com expressão em E. coli
1.2.1. Gene exógeno
1.2.2. Ìntrons
1.2.3. Sequências de terminação
1.2.4. Viés de códons
1.3. Como escapar de códons raros
2- Problemas devido às limitações de E. coli como hospedeira 
para a síntese
2.1 – Produção de proteases
2.2 – Glicosilação
2.3 – Ligações dissulfeto
2.4 – Sistema de secreção
2.5 – Enovelamento incorreto
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Biotecnologia Clonagem gênica
Produtos úteis são obtidos de culturas microbianas
Passado: Limitação da lista de produtos aos compostos 
naturalmente sintetizados por microrganismos
Muitos medicamentos importantes que não são produzidos por 
microrganismos, mas sim por organismos mais complexos, não 
podiam ser obtidos por essa maneira
Mudança: Clonagem gênica
Biotecnologia Clonagem gênica
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 –
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Lodish et al.,Molecular Cell Biology, 5th ed 
Vetor de clonagem
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Digestão
Biotecnologia
Clonagem gênica
E. coli DH5
Ligação
transformação
Produção de 
grandes quantidades 
de plasmídeos com 
o gene de interesse
MiniPrep
E. coli DH5a é a mais usada para clonagem de rotina.
Genótipo:
dlacZ DeltaM15 Delta(lacZYA-argF) U169 recA1 endA1 hsdR17(rK-
mK+) supE44 thi-1 gyrA96 relA1
- blue/white screening 
- Mutação lacZDelta M15 permite a triagem para células 
blue/white;
- Mutações em recA1 and endA1 aumenta a estabilidade do 
inserto e melhora a qualidade do plasmídeo preparado por
minipreps.
- Mutação recA1 reduz recombinação homóloga para um inserto 
mais estável.
- Mutação em endA1 reduz a digestão por endonuclease de 
restrição de plasmídeos para um rendimento mais alto na 
extração plasmideal.
- hsdR17(rK-mK+) reduz atividade da endonuclease de restrição 
EcoK.
Biotecnologia
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+
1 2 3
1 – Vetor + gene ligados
2 – marcador de peso molecular 1kb Plus
3 – Vetor + gene após digestão
Vetor de 
expressão
E. coli BL21
Indução
Purificação
Biotecnologia Clonagem gênica
Expression vector appropriate host strain
pBAD vectors Top10, >LMG194
pET vectors BL21 (DE3)
pGEX vectors BL21
pMal vectors BL21, TB1
pProEx vectors BL21, DH10B
pQE vectors M15 or M15 [pREP4]
pRSET vectors BL21 (DE3) pLysS
pTrcHis vectors BL21
Biotecnologia Clonagem gênica
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Prática: produção de proteínas recombinantes 
não é tão fácil!!
1) Organismos específicos 
2) Vetores especiais
3) Rendimento satisfatório
Síntese de proteínas
Tradução e transcrição em procarioto e eucarioto
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Síntese de proteínas
Tradução em procarioto
Procariotos
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Procariotos
Transcrição
DNA mRNA
Procariotos
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Transcrição e tradução em bactérias
5´3´
20 Aminoácidos
Gly – Glicina
Ala- Alanina
Val – Valina
Leu – Leucina
Ile – Isoleucina
Ser- Serina
Thr – Treonina
Cys – Cisteína
Met – Metionina
Glu – Ácido glutâmico
Asp – Ácido aspártico
Lys – Lisina
Arg – Arginina
Asn – Asparagina
Gln – Glutamina
Phe – Fenilalanina
Tyr – Tirosina
His – Histidina
Trp – Triptofano
Pro - Prolina
3 nucleotídeos = 1 códon = 1 aminoácido 
N-formilmetionina
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Tradução em Procariotos
mRNA Proteínas
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Expressão em E. coli
Amplamente direcionada 
para 3 diferentes locais:
- Citoplasma;
- Periplasma (ambiente 
mais oxidante);
- Meio de cultura através 
da secreção
Sistemas de transporte de proteínas em procariotos
ou
Peptídeo sinal
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Síntese de proteínas
Tradução e transcrição em eucarioto
Eucariotos
Célula animal
Célula vegetal
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Eucariotos
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1) Clivagem proteolítica 
(RE, CG e vesículas)
2) Glicosilação (adição de cadeias 
de carboidratos)
3) Pontes de dissulfeto
4) Folding apropriado e 
organização multimérica 
(somente protéinas com 
folding apropriados passam 
para o CG e para a membrana)
Modificações principais 
em proteínas que 
passam pelo Retículo 
Endoplasmático:
Glicosilação
Ligações dissulfeto
(adição de cadeias de carboidratos)
Reação ocorre na asparagina-alvo
Promove:
Folding correto
estabilidade
Auxilia estabilizar estrutura terciária e quaternária
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• Lúmen do retículo endoplasmático 
rugosoEucariotos
• Espaço periplasmático somente em 
proteínas secretadas e nos domínios 
exoplasmáticos das proteínas de 
membrana
Procariotos
(bactérias)
Ligações dissulfeto
Protein disulfide isomerase (PDI) DsbA
Modificações principais em proteínas que passam 
pelo Retículo Endoplasmático:
Chaperonas que auxiliam no processo
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Proteínas
Estrutura Primária
(Sequência de aa)
Estrutura Secundária
(folding local – α hélice e β folha)
Estrutura Terciária
(conformação tridimensional do polipeptídeo)
Estrutura Quaternária
(complexo de mais de um polipeptídeo)
Funções
Regulação
Estrutura
Movimento
catálise
Transporte
Sinalização
Sequência
Estrutura
Função
Objetivos da expressão de proteínas na 
produção industrial:
- Fermentação segura e controlada
- Fermentação barata
- Alto Nível de Produção recombinante (escala de g/L e não de mg/L)
- Fácil recuperação das proteínas expressadas
- Não degradação da proteína expressada
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A escolha do Sistema de expressão
Biotecnologia Industrial – vários sistemas de expressão:
- Bactérias
- Fungos leveduriformes (Leveduras)
- Fungos filamentosos 
-Animais
- Plantas
A escolha do Sistema de expressão
Microrganismos possuem crescimento extremamente rápido, 
superando qualquer organismo superior como plantas e animais. 
Quantidades imensas podem ser produzidas sob condições 
ambientais corretas em pequenos períodos de tempo e requerem 
um pequeno espaço físico
Bactérias (Procariotos)
Leveduras (Eucariotos)
Fungos filamentosos (Eucariotos)
Algas (Eucariotos)
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Sistema de expressão 1
Procarioto - Bactérias
Preferencialmente utilizadas porque oferecem:
1. Requerimento de fontes de carbono baratas;
2. Acúmulo de biomassa rápido;
3. Amenabilidade para fermentação em alta densidade celular
4. Processo de escalonamento (Scale up) simples
Sahdev et al., Mol Cell Biochem (2008) 307:249–264
A escolha do Sistema de expressão
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Sistema de expressão 1
Procarioto - Bactérias
Escherichia coli – é o microrganismo mais utilizado para expressão de 
proteínas heterólogas
- Geneticamente bem caracterizada;
- Várias ferramentas já surgiram e foram melhoradas;
E. coli DH5a é a mais usada para clonagem de rotina.
Genótipo:
dlacZ DeltaM15 Delta(lacZYA-argF) U169 recA1 endA1 hsdR17(rK-
mK+) supE44 thi-1 gyrA96 relA1
- Mutação lacZDelta M15 permite a triagem para células 
blue/white;
- Mutações em recA1 and endA1 aumenta a estabilidade do inserto
e melhora a qualidade do plasmídeo preparado por minipreps.
- Mutação recA1 reduz recombinação homóloga para um inserto 
mais estável.
- Mutação em endA1 reduz a digestãopor endonuclease de 
restrição de plasmídeos para um rendimento mais alto na 
extração plasmideal.
- hsdR17(rK-mK+) reduz atividade da endonuclease de restrição 
EcoK.
Biotecnologia
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Expression vector appropriate host strain
pBAD vectors Top10, >LMG194
pET vectors BL21 (DE3)
pGEX vectors BL21
pMal vectors BL21, TB1
pProEx vectors BL21, DH10B
pQE vectors M15 or M15 [pREP4]
pRSET vectors BL21 (DE3) pLysS
pTrcHis vectors BL21
Biotecnologia Clonagem gênica
Escherichia coli – é o mais utilizado
Clonagem 
Expressão
Bem sucedida
Proteína ativa Proteína inativa
Não há expressão
Sistema de expressão 1
Procarioto - Bactérias
Desafios!!
Transformação
http://anatomias.mediasmile.net/biologia.htm
Hospedeira para replicação
Hospedeira para expressão
Vetores de replicação
Vetores de expressão
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Apesar de haver sistemas sofisticados de expressão em 
E. coli, existem muitas dificuldades associadas à produção 
de proteínas nesse hospedeiro
2 Grupos de Problemas
1- Aqueles devido à sequência do gene exógeno
2- Aqueles devido às limitações de E. coli como hospedeira 
para a síntese
Os sinais de cada organismo
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A expressão do gene depende de este estar 
cercado por uma coleção de sinais que 
podem ser reconhecidos pela bactéria. 
1) Promotor: marca onde a transcrição deve iniciar (reconhecida pela 
RNA polimerase)
2) Terminador: marca onde a transcrição deve parar
3) Sítio de ligação do ribossomo (RBS): sequência nucleotídica curta 
reconhecida pelo ribossomo no qual ele deve se ligar no mRNA
Sistema de expressão 1
Procarioto - Bactérias
Os genes de organismos superiores também são cercados por 
sinais de expressão, mas suas SEQUÊNCIAS não são as mesmas
que as de E. coli. Por isso, um gene exógeno (não bacteriano) 
pode permanecer inativo em E. coli - a bactéria pode não 
reconhecer seus sinais!!
Solução:
Inserção do gene exógeno em um VETOR de modo a colocá-lo sob o
controle de um conjunto de sinais de expressão de E. coli
Se for possível: gene será transcrito e traduzido
Sistema de expressão 1
Procarioto - Bactérias
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Vetores de expressão
Veículos de clonagem que suprem a falta desses sinais e por isso são 
utilizados na produção de proteínas recombinantes
Promotor
Componente crítico do vetor de expressão 
A) Controla o primeiro estágio de expressão gênica, a ligação do RNA-
polimerase ao DNA;
B) Determina a frequência na qual o mRNA é sintetizado.
C) Possibilidade de regulação do promotor (Indução e Repressão)
Existem os PROMOTORES FRACOS E OS FORTES
Sistema de expressão 1
Procarioto - Bactérias
Por que regular a expressão de um gene?
-Efeito tóxico da proteína recombinante: efeito danoso sobre a
bactéria. Monitorar a sua síntese pode impedir a acumulação em
níveis tóxicos;
-Diminuição do nível de transcrição: um nível muito alto pode
afetar a capacidade de replicação do plasmídeo recombinante,
levando à sua eventual perda na cultura
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CAP (proteína ativadora de catabolismo) e lacI controlam o operon lac
- CAP possibilita que a bactéria utilize fontes alternativas de 
carbono, como lactose, na ausência de glicose;
- lacI – repressor que impede a expressão do operon lac na 
ausência de lactose.
Regulação gênica é um processo complexo, que envolve o promotor 
apenas indiretamente. Contudo muitas sequências importantes para a 
indução ou a repressão estão em regiões adjacentes ao promotor.
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RNA 
polimerase
Operon lac
Promotor lac
IPTG
Por que usar vetores comerciais?
http://www.resourcesgraphics.com/vector-graphic/vector-icon-vector-graphic/a-classic-expression-vector-material.html
http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/PEIA-Misc/pcDNA3-3-
TOPO-Mammalian-Vector.html
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Vetor de expressão comercial
Vetores comerciais voltados para expressão de proteínas 
heterólogas usam o mesmo tipo de controle de expressão, sendo 
induzidos com a presença de IPTG que é análogo à Lactose, mas 
nunca é degradado no meio de cultura
Novagen
IPTG
Remove a 
proteína lacI 
repressora do 
operador
Vetor de expressão comercial
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1ª fase – Clonagem em
Vetor e E. coli para clonagem
Primers com sítio 
de restrição
2ª fase – Clonagem em
Vetor de Expressão em E. coli para 
clonagem
De acordo com o gene de resistência 
apresentado no plasmídeo
3ª fase – Transformação do
Vetor de Expressão em E. coli para 
Expressão
Miniprep
Transformação
E. coli BL21 (DE3)
E. coli DH5α
Controle de expressão 1
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3ª fase – Transformação do
Vetor de Expressão em E. coli para 
Expressão
Miniprep
E. coli DH5α
Transformação
E. coli BL21 (DE3) pLysS
Controle de expressão2
Em caso de toxicidade!
Vetor de expressão e linhagens de E. coli
Atenção com o vetor 
e com a linhagem 
da bactéria!!
Neste caso:
lacI no plasmídeo
em cis
Ou 
em trans
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Por que usar vetores comerciais?
http://www.resourcesgraphics.com/vector-graphic/vector-icon-vector-graphic/a-classic-expression-vector-material.html
http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/PEIA-Misc/pcDNA3-3-
TOPO-Mammalian-Vector.html
1) Possibilidade de controle de expressão
2) Sistema de fusão - vantagens
Novagen
Cassetes:
Promotor + operador +RBS+start codon+ HIS6 +gene+stop codon
Sistema de fusão
Vetor de expressão comercial
Sistema de fusão
Sítio múltiplo 
de clonagem
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Vetor de expressão comercial
Sistema de fusão Peptídeo curto + Proteína
Produto é uma proteína híbrida: peptídeo curto, codificado pela fase de 
leitura de E. coli, fusionado à porção aminoterminal da proteína exógena
Vantagens:
1) Impedimento de pareamentos de base intracadeia causados por estruturas 
secundárias o que interfere na interação do ribossomo com seu sítio de 
ligação;
2) Presença de peptídeo bacteriano no início da proteína pode estabilizar a 
molécula e impedir degradação pela célula hospedeira;
3) O segmento bacteriano pode ser um peptídeo sinal e direcionar a proteína de 
E. coli para sua posição correta na célula;
4) O segmento bacteriano pode ajudar na purificação permitindo que a proteína 
de fusão seja recuperada por cromatografia de afinidade.
4ª fase: Expressão e purificação
IPTG
Antibiótico de acordo com o gene de 
resistência presente no vetor
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Vetor de expressão comercial
Sistema de fusão
Desvantagem
Pode haver alterações na proteína recombinante decorrentes da presença
deste segmento bacteriano remoção deste fragmento através de um
tratamento da proteína de fusão com um composto químico, ou enzima, que
cliva a cadeia polipeptídica na junção entre seus 2 componentes ou em um
sítio próximo à ela.
Peptídeo curto - - Proteína
Não permite clivagem!! Permite clivagem!!
Vetor de expressão comercial
Sistema de fusão
His-
Tag
Proteína de 
interesse
His-
Tag
Proteína de 
interesse
+ TROMBINA
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Qual linhagem de E. coli usar?
http://anatomias.mediasmile.net/incompetent.jpg
Vetor de expressão e linhagens de E. coli
BL21 Star™(DE3): F- ompT hsdSB (rB-mB-) gal dcm rne131 (DE3)
BL21 Star™(DE3)pLysS: F- ompT hsdSB (rB-mB-) gal dcm rne131 (DE3) 
pLysS (CamR)
- DE3 – contém lisogene DE3 que contém o gene da T7 RNA polimerase sob o 
controle do promotor lacUV5, o qual requer IPTG para induzir a expressão.
-Mutação no rne gene (rne131) codifica uma enzima RNase E truncada que 
perdea habilidade em degradar RNAm, resultando em um aumento da estabilidade 
do RNAm.  São úteis para expressão de proteínas recombinantes em altos níveis, 
com isso não são indicadas para expressar genes tóxicos. 
- E. coli B/r strains – não contém lon protease e são deficientes na protease da 
membrana celular OmpT  redução da degradação de proteínas heterólogas
-BL21 Star™(DE3)pLysS –contém o plasmídeo pLysS que produz lisozima T7 
para reduzir o nível da expressão basal do gene de interesse. Contém o gene para 
resistência ao cloranfenicol e contém origem p15A que permite compatibilidade 
com os plasmídeos pUC- ou pBR322-derived.
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Vetores e linhagens comerciais são 
interessantes, pois permitem:
- Regular a expressão do gene em estudo;
- Permitem estabilidade dos RNAm;
- Diminuição da degradação por não apresentar algumas proteases;
- Alguns permitem que a purificação da proteína seja mais fácil 
e/ou eficiente;
5ª fase: Eletroforese em gel de poliacrilamida
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Purificação por afinidade da proteína His6-Ers em resina de íons
níquel. Legenda: M-marcador, FS-fração solúvel, FI-fração
insolúvel, NL-proteínas não ligadas, LAV-lavagem, 25-25 mM
imidazol,50-50 mM imidazol, 100- 100 mM imidazol, 200- 200
mM imidazol, 300-300 mM immidazol.
By Raissa Gutierrez
Problemas com expressão 
em E. coli?
http://1.bp.blogspot.com/_aguR8wNTXac/SfPbYf1ODII/AAAAAAAAAbk/UevCilGLZ4Q/s400/Microbiology+cartoon2.JPG
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Sistema de expressão: bactérias – E. coli
1- Problemas devido à sequência do gene exógeno
1.1 – Íntrons – bactérias não removem íntrons dos transcritos
Alternativa: usar o DNA complementar (cDNA) preparado a
partir do mRNA;
1.2 – Sequências que agem como sinais de terminação em E. coli.
Alternativa: alterar através de mutação dirigida por
oligonucleotídeos;
1.3 – Viés de códons do gene pode não ser o ideal para a tradução em
E. coli e os tRNA podem ter dificuldades na tradução do gene. Isso pode
reduzir a quantidade de proteína a ser sintetizada.
3 nucleotídeos = 1 códon = 1 aminoácido 
Sistema de expressão 1
Procarioto - Bactérias
Códons raros em E. coli
Há sempre uma tendência da célula a utilizar 
mais um códon do que outro para o mesmo 
aminoácido códons raros
Os RNAs de transferência de cada célula reflete a 
tendência de códons do seu RNA mensageiro
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Sistema de expressão 1
Procarioto - Bactérias
Códons raros ou menos utilizados em E. coli
Sistema de expressão 1
Procarioto - Bactérias
Códons raros em E. coli
❖ O requerimento de um ou mais tRNA durante a superexpressão de um gene
alvo heterólogo em E. coli resulta em uma taxa de tradução mais baixa
devido a diferenças no uso de códons.
❖ Se sistemas de vetores de expressão de altos níveis em E. coli são
utilizados, a presença de pequeno número de códons raros no gene
heterólogo não leva a redução significante na síntese da proteína alvo. No
entanto, se há um grupo de códons raros em um gene a ser expressado, há
lentidão, especialmente quando há sucessivos códons raros na região N-
terminal.
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Códons raros em E. coli 
- como escapar 
dessa??
http://chapabranca.files.wordpress.com/2008/10/desespero.gif
Sistema de expressão 1
Procarioto - Bactérias
Códons raros em E. coli - como escapar dessa??
http://img.dailymail.co.uk/i/pix/2007/09_01/littleCartoon0609_468x305.jpg
A) Em alguns casos, aumentar a concentração do
aminoácido limitante no meio de cultura pode
melhorar a expressão!! Não tem papel
significante na mudança dos níveis de utilização
de códons da maioria dos tRNA isoaceptores
correspondentes àquele códon raro.
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Sistema de expressão 1
Procarioto - Bactérias
Códons raros em E. coli - como escapar dessa??
B.1) Manipular o número de cópias do gene de tRNA
respectivo através de plasmídeo. Ex.: pRIG, pRARE,
pACYC, pSC101
http://2.bp.blogspot.com/_ymBY53jID_w/SiCR-aW-xII/AAAAAAAAJuo/YOyhmR7Aca4/s400/desesperada.jpg
B) Estudos já mostraram melhoras no rendimento quando E. 
coli hospedeira é utilizada com expressão adicional de 
argU (AGG/AGA), glyT (GGA), ileX (AUA), leuW (CUA), 
proL (CCC) através do aumento da dose gênica dos 
respectivos tRNA.
Sistema de expressão 1
Procarioto - Bactérias
Códons raros em E. coli - como escapar dessa??
http://chapabranca.files.wordpress.com/2008/10/desespero.gif
B.2) Células que já possuem cópias extra de tRNAs
BL21-CodonPlus (DE3)-RIPL (Stratagene, USA)  cópias extra
de tRNAs (argU, ileY, leuW e proL), contorna os problemas de
expressão de genes ricos em CG heterólogos.
Rosetta™ possui tRNAs para os códons AUA, AGG, AGA, CUA, CCC, 
GGA.
Rosetta 2™ possui tRNA para o códon CGG.
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Apesar destes avanços, a utilização ótima de 
códons raros para a superprodução de uma 
proteína eucariótica ativa cataliticamente em um 
nível industrial ainda permanece como um desafio.
Sistema de expressão 1
Procarioto - Bactérias
Códons raros em E. coli - como escapar dessa??
Glazer Microbial Biotechnology – Fundamentals of Applied Microbiology
Sistema de expressão: bactérias – E. coli
Quando obtém-se corpos de inclusão... 
Citoplasma 
não 
diferenciado
Alta 
concentração 
de proteína
Grandes 
chances de 
associação 
intermolecular
Grandes 
chances de 
agregação
Condições do citoplasma: pH, força iônica e potencial redox 
diferentes do ambiente normal de enovelamento destas proteínas nas 
suas conformações finais
E. coli
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Sistema de expressão: bactérias – E. coli
Quando obtém-se corpos de inclusão... 
Corpos de inclusão: agregados insolúveis de proteínas inativas
- Facilmente purificados do homogenado de E. coli;
- São obtidos em altos níveis de expressão;
- Resistentes a proteases celulares o que confere menor degradação;
- Retém o mínimo de impurezas e portanto necessitam de menos 
passos de purificação  mais rapidez;
- Há uma perda de proteína ao se recuperar, mas esta é compensada 
por um nível muito alto de expressão
Sistema de expressão: bactérias – E. coli
Quando obtém-se corpos de inclusão... 
Principal desafio: converter em produto corretamente enovelado, solúvel e 
eficiente;
Desvantagens: 
-Recuperação reduzida;
-Necessidade de otimização rigorosa de condições de refolding para cada tipo 
de proteína;
-Possibilidade de que o procedimento de re-solubilização possa afetar a 
atividade da proteína reenovelada.
Portanto, as vezes, a purificação de uma proteína solúvel é menos cara e mais 
rápida quando comparada a purificação e refolding de corpos de inclusão
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Sistema de expressão: bactérias – E. coli
2- Problemas devido às limitações de E. coli como
hospedeira para a síntese
2.1 – Produção de proteases
2.2 – Glicosilação
2.3 – Ligações dissulfeto
2.4 – Sistema de secreção
2.5 – Enovelamento incorreto
2.1 - E. coli pode produzir proteases que podem degradar a
proteína recombinante.
• E. coli BL21 (Novagen, USA) é o organismo ideal para a rotina de
expressão de proteína
•Deficientes nas proteases lon e OmpT, da membrana
externa, através de uma modificação genética que reduz
a degradação de proteínas heterólogas expressadas.
Sistema de expressão: bactérias – E. coli
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Sistema de expressão 1
Procarioto - Bactérias
2.2 – E. coli pode não processar a proteína recombinante
corretamente. Algumas proteínas eucarióticas são
glicosiladas e a glicosilação é extremamente incomum em
bactérias;
Glicosilação – existe uma certa glicosilação não enzimática em E. coli, 
mas o produto em geral resulta com algumas variações com relação 
à produzida nas célulaseucarióticas. Neste caso, em geral, não tem 
solução, é uma limitação da utilização de E. coli para sintetizar 
proteínas eucarióticas
Sistema de expressão: bactérias – E. coli
2.3 - E. coli geralmente é incapaz de sintetizar as ligações
dissulfeto presentes em muitas proteínas eucarióticas. Com
isso, a proteína pode ficar insolúvel e formar corpos de
inclusão e pode ser inativa.
• Proteínas com formação de ligação dissulfeto estável somente ocorre no periplasma,
catalisada pelas oxidoredutases tiol-dissulfeto conhecidas como proteínas Dsb (DsbA e DsbC)
http://www.sciencemag.org/content/303/5657/534.full.pdf?sid=7f6370d4-2232-45a2-895c-788c9b24548f
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A família Origami possui mutações na tireodoxina redutase e
na glutationa redutase que facilita a formação de pontes de
dissulfeto no citoplasma e, consequentemente, permitem um
arranjo (forma) da proteína apropriada, aumentando a solubilidade
da mesma.
 inclui as deficiências de Ion e OmpT das linhagens BL21,
melhorando a solubilidade das proteínas recombinantes
Linhagens E. coli Origami-B são derivadas de uma mutante de lacZY da
BL21 para controlar precisamente os níveis de expressão pelo ajuste fino da
concentração do IPTG como no caso do mutante lacY
OrigamiTM2 (Novagen)
Sistema de expressão 1
Procarioto - Bactérias
2.4 - Falta um sistema eficiente de secreção em E. coli
A maioria das linhagens de E. coli não tem uma via bem organizada 
de translocação pela membrana externa
Algumas sequências sinais podem auxiliar esta secreção para o meio 
extra-celular através de uma via dependente de partícula de 
reconhecimento de sinal (SRP dependente).
GTPase pode se ligar tanto à uma sequência sinal 
de certas proteínas a serem secretadas (sendo 
altamente hidrofóbica) ou à segmentos 
transmembrânicos de proteínas de membrana 
interna assim que elas emergem dos ribossomos 
 complexo é direcionado à membrana
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Sistema de expressão 1
Procarioto - Bactérias
2.4 - Falta um sistema eficiente de secreção em E. coli
• Sequência sinal da OmpA tem sido usado em alguns estudos 
para translocar alguns peptídeos recombinantes para o periplasma 
para provável secreção no meio de cultura;
• Co-expressão de dois fatores de secreção (secY e secE) tem 
sido utilizado para aumentar a secreção de algumas proteínas.
Sistema de expressão: bactérias – E. coli
2.5 - E. coli pode não enovelar a proteína corretamente 
Enovelamento correto – E. coli que sintetize grandes quantidades de 
proteínas chaperonas  adaptadas para auxiliar no dobramento de novo da 
proteína, facilitando a obtenção conformacional própria do polipeptídeo 
expressado, e/ou localização celular sem se tornar parte da estrutura final
Chaperonas evitam a formação de corpos de inclusão e agregação
DnaK e GroEL (chaperonas de enovelamento)
IbpA (chaperona de suporte – holding)
ClpB (chaperona desagregadora)
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http://4.bp.blogspot.com/_wLLEpWhLkEw/SFG-d3gxm5I/AAAAAAAAAD4/MYMLo9cnftk/s320/d%25C3%25BAvida.jpg
Sistema de expressão: bactérias – E. coli
E se nada disso der certo... 
Modifique:
- A Temperatura de expressão: diminua a temperatura (15-23C)
interações hidrofóbicas determinando corpos de inclusão são 
temperatura-dependentes;
heat shock proteases são menos ativas a menor temperatura;
- A composição do meio:
Referências bibliográficas
Brown TA. Clonagem gênica e análise de DNA – Uma introdução. 4
ed., Porto Alegre, Ed Artmed, 2003. – Capítulo 13
Gad SC. Handbook of Pharmaceutical Biotechnology. New Jersey, Ed.
Willey, 2007. – Capítulo 1.1
Sahdev S, Khattar SK, Saini KS. 2008. Production of active eukaryotic
proteins through bacterial expression systems: a review of existing
biotecnology strategies.Mol Cell Biochem. 307:249-264.

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