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03/03/2017 1 Proteínas e Sistemas de expressão I Aula 3 - Profa Dra Ilana L. B. C. Camargo Ciências Físicas e Biomoleculares IFSC - USP Síntese de proteínas: Tradução e transcrição em procarioto e eucarioto; Objetivos da expressão de proteínas na produção industrial; A escolha do Sistema de expressão 1. Sistema de expressão 1: bactéria E. coli 1.1. Vetores comerciais 1.2. Problemas com expressão em E. coli 1.2.1. Gene exógeno 1.2.2. Ìntrons 1.2.3. Sequências de terminação 1.2.4. Viés de códons 1.3. Como escapar de códons raros 2- Problemas devido às limitações de E. coli como hospedeira para a síntese 2.1 – Produção de proteases 2.2 – Glicosilação 2.3 – Ligações dissulfeto 2.4 – Sistema de secreção 2.5 – Enovelamento incorreto 03/03/2017 2 Biotecnologia Clonagem gênica Produtos úteis são obtidos de culturas microbianas Passado: Limitação da lista de produtos aos compostos naturalmente sintetizados por microrganismos Muitos medicamentos importantes que não são produzidos por microrganismos, mas sim por organismos mais complexos, não podiam ser obtidos por essa maneira Mudança: Clonagem gênica Biotecnologia Clonagem gênica P C R – R e a ç ã o e m C a d e ia d a P o li m e r a s e Lodish et al.,Molecular Cell Biology, 5th ed Vetor de clonagem 03/03/2017 3 Digestão Biotecnologia Clonagem gênica E. coli DH5 Ligação transformação Produção de grandes quantidades de plasmídeos com o gene de interesse MiniPrep E. coli DH5a é a mais usada para clonagem de rotina. Genótipo: dlacZ DeltaM15 Delta(lacZYA-argF) U169 recA1 endA1 hsdR17(rK- mK+) supE44 thi-1 gyrA96 relA1 - blue/white screening - Mutação lacZDelta M15 permite a triagem para células blue/white; - Mutações em recA1 and endA1 aumenta a estabilidade do inserto e melhora a qualidade do plasmídeo preparado por minipreps. - Mutação recA1 reduz recombinação homóloga para um inserto mais estável. - Mutação em endA1 reduz a digestão por endonuclease de restrição de plasmídeos para um rendimento mais alto na extração plasmideal. - hsdR17(rK-mK+) reduz atividade da endonuclease de restrição EcoK. Biotecnologia 03/03/2017 4 + 1 2 3 1 – Vetor + gene ligados 2 – marcador de peso molecular 1kb Plus 3 – Vetor + gene após digestão Vetor de expressão E. coli BL21 Indução Purificação Biotecnologia Clonagem gênica Expression vector appropriate host strain pBAD vectors Top10, >LMG194 pET vectors BL21 (DE3) pGEX vectors BL21 pMal vectors BL21, TB1 pProEx vectors BL21, DH10B pQE vectors M15 or M15 [pREP4] pRSET vectors BL21 (DE3) pLysS pTrcHis vectors BL21 Biotecnologia Clonagem gênica 03/03/2017 5 Prática: produção de proteínas recombinantes não é tão fácil!! 1) Organismos específicos 2) Vetores especiais 3) Rendimento satisfatório Síntese de proteínas Tradução e transcrição em procarioto e eucarioto 03/03/2017 6 Síntese de proteínas Tradução em procarioto Procariotos 03/03/2017 7 Procariotos Transcrição DNA mRNA Procariotos 03/03/2017 8 Transcrição e tradução em bactérias 5´3´ 20 Aminoácidos Gly – Glicina Ala- Alanina Val – Valina Leu – Leucina Ile – Isoleucina Ser- Serina Thr – Treonina Cys – Cisteína Met – Metionina Glu – Ácido glutâmico Asp – Ácido aspártico Lys – Lisina Arg – Arginina Asn – Asparagina Gln – Glutamina Phe – Fenilalanina Tyr – Tirosina His – Histidina Trp – Triptofano Pro - Prolina 3 nucleotídeos = 1 códon = 1 aminoácido N-formilmetionina 03/03/2017 9 Tradução em Procariotos mRNA Proteínas 03/03/2017 10 Expressão em E. coli Amplamente direcionada para 3 diferentes locais: - Citoplasma; - Periplasma (ambiente mais oxidante); - Meio de cultura através da secreção Sistemas de transporte de proteínas em procariotos ou Peptídeo sinal 03/03/2017 11 Síntese de proteínas Tradução e transcrição em eucarioto Eucariotos Célula animal Célula vegetal 03/03/2017 12 Eucariotos 03/03/2017 13 V ia d e s e c re ç ã o ( S e c re tó ri a ) V ia s n ã o S e c re tó ria 03/03/2017 14 1) Clivagem proteolítica (RE, CG e vesículas) 2) Glicosilação (adição de cadeias de carboidratos) 3) Pontes de dissulfeto 4) Folding apropriado e organização multimérica (somente protéinas com folding apropriados passam para o CG e para a membrana) Modificações principais em proteínas que passam pelo Retículo Endoplasmático: Glicosilação Ligações dissulfeto (adição de cadeias de carboidratos) Reação ocorre na asparagina-alvo Promove: Folding correto estabilidade Auxilia estabilizar estrutura terciária e quaternária 03/03/2017 15 • Lúmen do retículo endoplasmático rugosoEucariotos • Espaço periplasmático somente em proteínas secretadas e nos domínios exoplasmáticos das proteínas de membrana Procariotos (bactérias) Ligações dissulfeto Protein disulfide isomerase (PDI) DsbA Modificações principais em proteínas que passam pelo Retículo Endoplasmático: Chaperonas que auxiliam no processo 03/03/2017 16 Proteínas Estrutura Primária (Sequência de aa) Estrutura Secundária (folding local – α hélice e β folha) Estrutura Terciária (conformação tridimensional do polipeptídeo) Estrutura Quaternária (complexo de mais de um polipeptídeo) Funções Regulação Estrutura Movimento catálise Transporte Sinalização Sequência Estrutura Função Objetivos da expressão de proteínas na produção industrial: - Fermentação segura e controlada - Fermentação barata - Alto Nível de Produção recombinante (escala de g/L e não de mg/L) - Fácil recuperação das proteínas expressadas - Não degradação da proteína expressada 03/03/2017 17 A escolha do Sistema de expressão Biotecnologia Industrial – vários sistemas de expressão: - Bactérias - Fungos leveduriformes (Leveduras) - Fungos filamentosos -Animais - Plantas A escolha do Sistema de expressão Microrganismos possuem crescimento extremamente rápido, superando qualquer organismo superior como plantas e animais. Quantidades imensas podem ser produzidas sob condições ambientais corretas em pequenos períodos de tempo e requerem um pequeno espaço físico Bactérias (Procariotos) Leveduras (Eucariotos) Fungos filamentosos (Eucariotos) Algas (Eucariotos) 03/03/2017 18 Sistema de expressão 1 Procarioto - Bactérias Preferencialmente utilizadas porque oferecem: 1. Requerimento de fontes de carbono baratas; 2. Acúmulo de biomassa rápido; 3. Amenabilidade para fermentação em alta densidade celular 4. Processo de escalonamento (Scale up) simples Sahdev et al., Mol Cell Biochem (2008) 307:249–264 A escolha do Sistema de expressão 03/03/2017 19 Sistema de expressão 1 Procarioto - Bactérias Escherichia coli – é o microrganismo mais utilizado para expressão de proteínas heterólogas - Geneticamente bem caracterizada; - Várias ferramentas já surgiram e foram melhoradas; E. coli DH5a é a mais usada para clonagem de rotina. Genótipo: dlacZ DeltaM15 Delta(lacZYA-argF) U169 recA1 endA1 hsdR17(rK- mK+) supE44 thi-1 gyrA96 relA1 - Mutação lacZDelta M15 permite a triagem para células blue/white; - Mutações em recA1 and endA1 aumenta a estabilidade do inserto e melhora a qualidade do plasmídeo preparado por minipreps. - Mutação recA1 reduz recombinação homóloga para um inserto mais estável. - Mutação em endA1 reduz a digestãopor endonuclease de restrição de plasmídeos para um rendimento mais alto na extração plasmideal. - hsdR17(rK-mK+) reduz atividade da endonuclease de restrição EcoK. Biotecnologia 03/03/2017 20 Expression vector appropriate host strain pBAD vectors Top10, >LMG194 pET vectors BL21 (DE3) pGEX vectors BL21 pMal vectors BL21, TB1 pProEx vectors BL21, DH10B pQE vectors M15 or M15 [pREP4] pRSET vectors BL21 (DE3) pLysS pTrcHis vectors BL21 Biotecnologia Clonagem gênica Escherichia coli – é o mais utilizado Clonagem Expressão Bem sucedida Proteína ativa Proteína inativa Não há expressão Sistema de expressão 1 Procarioto - Bactérias Desafios!! Transformação http://anatomias.mediasmile.net/biologia.htm Hospedeira para replicação Hospedeira para expressão Vetores de replicação Vetores de expressão 03/03/2017 21 Apesar de haver sistemas sofisticados de expressão em E. coli, existem muitas dificuldades associadas à produção de proteínas nesse hospedeiro 2 Grupos de Problemas 1- Aqueles devido à sequência do gene exógeno 2- Aqueles devido às limitações de E. coli como hospedeira para a síntese Os sinais de cada organismo 03/03/2017 22 A expressão do gene depende de este estar cercado por uma coleção de sinais que podem ser reconhecidos pela bactéria. 1) Promotor: marca onde a transcrição deve iniciar (reconhecida pela RNA polimerase) 2) Terminador: marca onde a transcrição deve parar 3) Sítio de ligação do ribossomo (RBS): sequência nucleotídica curta reconhecida pelo ribossomo no qual ele deve se ligar no mRNA Sistema de expressão 1 Procarioto - Bactérias Os genes de organismos superiores também são cercados por sinais de expressão, mas suas SEQUÊNCIAS não são as mesmas que as de E. coli. Por isso, um gene exógeno (não bacteriano) pode permanecer inativo em E. coli - a bactéria pode não reconhecer seus sinais!! Solução: Inserção do gene exógeno em um VETOR de modo a colocá-lo sob o controle de um conjunto de sinais de expressão de E. coli Se for possível: gene será transcrito e traduzido Sistema de expressão 1 Procarioto - Bactérias 03/03/2017 23 Vetores de expressão Veículos de clonagem que suprem a falta desses sinais e por isso são utilizados na produção de proteínas recombinantes Promotor Componente crítico do vetor de expressão A) Controla o primeiro estágio de expressão gênica, a ligação do RNA- polimerase ao DNA; B) Determina a frequência na qual o mRNA é sintetizado. C) Possibilidade de regulação do promotor (Indução e Repressão) Existem os PROMOTORES FRACOS E OS FORTES Sistema de expressão 1 Procarioto - Bactérias Por que regular a expressão de um gene? -Efeito tóxico da proteína recombinante: efeito danoso sobre a bactéria. Monitorar a sua síntese pode impedir a acumulação em níveis tóxicos; -Diminuição do nível de transcrição: um nível muito alto pode afetar a capacidade de replicação do plasmídeo recombinante, levando à sua eventual perda na cultura 03/03/2017 24 CAP (proteína ativadora de catabolismo) e lacI controlam o operon lac - CAP possibilita que a bactéria utilize fontes alternativas de carbono, como lactose, na ausência de glicose; - lacI – repressor que impede a expressão do operon lac na ausência de lactose. Regulação gênica é um processo complexo, que envolve o promotor apenas indiretamente. Contudo muitas sequências importantes para a indução ou a repressão estão em regiões adjacentes ao promotor. 03/03/2017 25 RNA polimerase Operon lac Promotor lac IPTG Por que usar vetores comerciais? http://www.resourcesgraphics.com/vector-graphic/vector-icon-vector-graphic/a-classic-expression-vector-material.html http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/PEIA-Misc/pcDNA3-3- TOPO-Mammalian-Vector.html 03/03/2017 26 Vetor de expressão comercial Vetores comerciais voltados para expressão de proteínas heterólogas usam o mesmo tipo de controle de expressão, sendo induzidos com a presença de IPTG que é análogo à Lactose, mas nunca é degradado no meio de cultura Novagen IPTG Remove a proteína lacI repressora do operador Vetor de expressão comercial 03/03/2017 27 1ª fase – Clonagem em Vetor e E. coli para clonagem Primers com sítio de restrição 2ª fase – Clonagem em Vetor de Expressão em E. coli para clonagem De acordo com o gene de resistência apresentado no plasmídeo 3ª fase – Transformação do Vetor de Expressão em E. coli para Expressão Miniprep Transformação E. coli BL21 (DE3) E. coli DH5α Controle de expressão 1 03/03/2017 28 3ª fase – Transformação do Vetor de Expressão em E. coli para Expressão Miniprep E. coli DH5α Transformação E. coli BL21 (DE3) pLysS Controle de expressão2 Em caso de toxicidade! Vetor de expressão e linhagens de E. coli Atenção com o vetor e com a linhagem da bactéria!! Neste caso: lacI no plasmídeo em cis Ou em trans 03/03/2017 29 Por que usar vetores comerciais? http://www.resourcesgraphics.com/vector-graphic/vector-icon-vector-graphic/a-classic-expression-vector-material.html http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/PEIA-Misc/pcDNA3-3- TOPO-Mammalian-Vector.html 1) Possibilidade de controle de expressão 2) Sistema de fusão - vantagens Novagen Cassetes: Promotor + operador +RBS+start codon+ HIS6 +gene+stop codon Sistema de fusão Vetor de expressão comercial Sistema de fusão Sítio múltiplo de clonagem 03/03/2017 30 Vetor de expressão comercial Sistema de fusão Peptídeo curto + Proteína Produto é uma proteína híbrida: peptídeo curto, codificado pela fase de leitura de E. coli, fusionado à porção aminoterminal da proteína exógena Vantagens: 1) Impedimento de pareamentos de base intracadeia causados por estruturas secundárias o que interfere na interação do ribossomo com seu sítio de ligação; 2) Presença de peptídeo bacteriano no início da proteína pode estabilizar a molécula e impedir degradação pela célula hospedeira; 3) O segmento bacteriano pode ser um peptídeo sinal e direcionar a proteína de E. coli para sua posição correta na célula; 4) O segmento bacteriano pode ajudar na purificação permitindo que a proteína de fusão seja recuperada por cromatografia de afinidade. 4ª fase: Expressão e purificação IPTG Antibiótico de acordo com o gene de resistência presente no vetor 03/03/2017 31 Vetor de expressão comercial Sistema de fusão Desvantagem Pode haver alterações na proteína recombinante decorrentes da presença deste segmento bacteriano remoção deste fragmento através de um tratamento da proteína de fusão com um composto químico, ou enzima, que cliva a cadeia polipeptídica na junção entre seus 2 componentes ou em um sítio próximo à ela. Peptídeo curto - - Proteína Não permite clivagem!! Permite clivagem!! Vetor de expressão comercial Sistema de fusão His- Tag Proteína de interesse His- Tag Proteína de interesse + TROMBINA 03/03/2017 32 Qual linhagem de E. coli usar? http://anatomias.mediasmile.net/incompetent.jpg Vetor de expressão e linhagens de E. coli BL21 Star™(DE3): F- ompT hsdSB (rB-mB-) gal dcm rne131 (DE3) BL21 Star™(DE3)pLysS: F- ompT hsdSB (rB-mB-) gal dcm rne131 (DE3) pLysS (CamR) - DE3 – contém lisogene DE3 que contém o gene da T7 RNA polimerase sob o controle do promotor lacUV5, o qual requer IPTG para induzir a expressão. -Mutação no rne gene (rne131) codifica uma enzima RNase E truncada que perdea habilidade em degradar RNAm, resultando em um aumento da estabilidade do RNAm. São úteis para expressão de proteínas recombinantes em altos níveis, com isso não são indicadas para expressar genes tóxicos. - E. coli B/r strains – não contém lon protease e são deficientes na protease da membrana celular OmpT redução da degradação de proteínas heterólogas -BL21 Star™(DE3)pLysS –contém o plasmídeo pLysS que produz lisozima T7 para reduzir o nível da expressão basal do gene de interesse. Contém o gene para resistência ao cloranfenicol e contém origem p15A que permite compatibilidade com os plasmídeos pUC- ou pBR322-derived. 03/03/2017 33 Vetores e linhagens comerciais são interessantes, pois permitem: - Regular a expressão do gene em estudo; - Permitem estabilidade dos RNAm; - Diminuição da degradação por não apresentar algumas proteases; - Alguns permitem que a purificação da proteína seja mais fácil e/ou eficiente; 5ª fase: Eletroforese em gel de poliacrilamida 03/03/2017 34 Purificação por afinidade da proteína His6-Ers em resina de íons níquel. Legenda: M-marcador, FS-fração solúvel, FI-fração insolúvel, NL-proteínas não ligadas, LAV-lavagem, 25-25 mM imidazol,50-50 mM imidazol, 100- 100 mM imidazol, 200- 200 mM imidazol, 300-300 mM immidazol. By Raissa Gutierrez Problemas com expressão em E. coli? http://1.bp.blogspot.com/_aguR8wNTXac/SfPbYf1ODII/AAAAAAAAAbk/UevCilGLZ4Q/s400/Microbiology+cartoon2.JPG 03/03/2017 35 Sistema de expressão: bactérias – E. coli 1- Problemas devido à sequência do gene exógeno 1.1 – Íntrons – bactérias não removem íntrons dos transcritos Alternativa: usar o DNA complementar (cDNA) preparado a partir do mRNA; 1.2 – Sequências que agem como sinais de terminação em E. coli. Alternativa: alterar através de mutação dirigida por oligonucleotídeos; 1.3 – Viés de códons do gene pode não ser o ideal para a tradução em E. coli e os tRNA podem ter dificuldades na tradução do gene. Isso pode reduzir a quantidade de proteína a ser sintetizada. 3 nucleotídeos = 1 códon = 1 aminoácido Sistema de expressão 1 Procarioto - Bactérias Códons raros em E. coli Há sempre uma tendência da célula a utilizar mais um códon do que outro para o mesmo aminoácido códons raros Os RNAs de transferência de cada célula reflete a tendência de códons do seu RNA mensageiro 03/03/2017 36 Sistema de expressão 1 Procarioto - Bactérias Códons raros ou menos utilizados em E. coli Sistema de expressão 1 Procarioto - Bactérias Códons raros em E. coli ❖ O requerimento de um ou mais tRNA durante a superexpressão de um gene alvo heterólogo em E. coli resulta em uma taxa de tradução mais baixa devido a diferenças no uso de códons. ❖ Se sistemas de vetores de expressão de altos níveis em E. coli são utilizados, a presença de pequeno número de códons raros no gene heterólogo não leva a redução significante na síntese da proteína alvo. No entanto, se há um grupo de códons raros em um gene a ser expressado, há lentidão, especialmente quando há sucessivos códons raros na região N- terminal. 03/03/2017 37 Códons raros em E. coli - como escapar dessa?? http://chapabranca.files.wordpress.com/2008/10/desespero.gif Sistema de expressão 1 Procarioto - Bactérias Códons raros em E. coli - como escapar dessa?? http://img.dailymail.co.uk/i/pix/2007/09_01/littleCartoon0609_468x305.jpg A) Em alguns casos, aumentar a concentração do aminoácido limitante no meio de cultura pode melhorar a expressão!! Não tem papel significante na mudança dos níveis de utilização de códons da maioria dos tRNA isoaceptores correspondentes àquele códon raro. 03/03/2017 38 Sistema de expressão 1 Procarioto - Bactérias Códons raros em E. coli - como escapar dessa?? B.1) Manipular o número de cópias do gene de tRNA respectivo através de plasmídeo. Ex.: pRIG, pRARE, pACYC, pSC101 http://2.bp.blogspot.com/_ymBY53jID_w/SiCR-aW-xII/AAAAAAAAJuo/YOyhmR7Aca4/s400/desesperada.jpg B) Estudos já mostraram melhoras no rendimento quando E. coli hospedeira é utilizada com expressão adicional de argU (AGG/AGA), glyT (GGA), ileX (AUA), leuW (CUA), proL (CCC) através do aumento da dose gênica dos respectivos tRNA. Sistema de expressão 1 Procarioto - Bactérias Códons raros em E. coli - como escapar dessa?? http://chapabranca.files.wordpress.com/2008/10/desespero.gif B.2) Células que já possuem cópias extra de tRNAs BL21-CodonPlus (DE3)-RIPL (Stratagene, USA) cópias extra de tRNAs (argU, ileY, leuW e proL), contorna os problemas de expressão de genes ricos em CG heterólogos. Rosetta™ possui tRNAs para os códons AUA, AGG, AGA, CUA, CCC, GGA. Rosetta 2™ possui tRNA para o códon CGG. 03/03/2017 39 Apesar destes avanços, a utilização ótima de códons raros para a superprodução de uma proteína eucariótica ativa cataliticamente em um nível industrial ainda permanece como um desafio. Sistema de expressão 1 Procarioto - Bactérias Códons raros em E. coli - como escapar dessa?? Glazer Microbial Biotechnology – Fundamentals of Applied Microbiology Sistema de expressão: bactérias – E. coli Quando obtém-se corpos de inclusão... Citoplasma não diferenciado Alta concentração de proteína Grandes chances de associação intermolecular Grandes chances de agregação Condições do citoplasma: pH, força iônica e potencial redox diferentes do ambiente normal de enovelamento destas proteínas nas suas conformações finais E. coli 03/03/2017 40 Sistema de expressão: bactérias – E. coli Quando obtém-se corpos de inclusão... Corpos de inclusão: agregados insolúveis de proteínas inativas - Facilmente purificados do homogenado de E. coli; - São obtidos em altos níveis de expressão; - Resistentes a proteases celulares o que confere menor degradação; - Retém o mínimo de impurezas e portanto necessitam de menos passos de purificação mais rapidez; - Há uma perda de proteína ao se recuperar, mas esta é compensada por um nível muito alto de expressão Sistema de expressão: bactérias – E. coli Quando obtém-se corpos de inclusão... Principal desafio: converter em produto corretamente enovelado, solúvel e eficiente; Desvantagens: -Recuperação reduzida; -Necessidade de otimização rigorosa de condições de refolding para cada tipo de proteína; -Possibilidade de que o procedimento de re-solubilização possa afetar a atividade da proteína reenovelada. Portanto, as vezes, a purificação de uma proteína solúvel é menos cara e mais rápida quando comparada a purificação e refolding de corpos de inclusão 03/03/2017 41 Sistema de expressão: bactérias – E. coli 2- Problemas devido às limitações de E. coli como hospedeira para a síntese 2.1 – Produção de proteases 2.2 – Glicosilação 2.3 – Ligações dissulfeto 2.4 – Sistema de secreção 2.5 – Enovelamento incorreto 2.1 - E. coli pode produzir proteases que podem degradar a proteína recombinante. • E. coli BL21 (Novagen, USA) é o organismo ideal para a rotina de expressão de proteína •Deficientes nas proteases lon e OmpT, da membrana externa, através de uma modificação genética que reduz a degradação de proteínas heterólogas expressadas. Sistema de expressão: bactérias – E. coli 03/03/2017 42 Sistema de expressão 1 Procarioto - Bactérias 2.2 – E. coli pode não processar a proteína recombinante corretamente. Algumas proteínas eucarióticas são glicosiladas e a glicosilação é extremamente incomum em bactérias; Glicosilação – existe uma certa glicosilação não enzimática em E. coli, mas o produto em geral resulta com algumas variações com relação à produzida nas célulaseucarióticas. Neste caso, em geral, não tem solução, é uma limitação da utilização de E. coli para sintetizar proteínas eucarióticas Sistema de expressão: bactérias – E. coli 2.3 - E. coli geralmente é incapaz de sintetizar as ligações dissulfeto presentes em muitas proteínas eucarióticas. Com isso, a proteína pode ficar insolúvel e formar corpos de inclusão e pode ser inativa. • Proteínas com formação de ligação dissulfeto estável somente ocorre no periplasma, catalisada pelas oxidoredutases tiol-dissulfeto conhecidas como proteínas Dsb (DsbA e DsbC) http://www.sciencemag.org/content/303/5657/534.full.pdf?sid=7f6370d4-2232-45a2-895c-788c9b24548f 03/03/2017 43 A família Origami possui mutações na tireodoxina redutase e na glutationa redutase que facilita a formação de pontes de dissulfeto no citoplasma e, consequentemente, permitem um arranjo (forma) da proteína apropriada, aumentando a solubilidade da mesma. inclui as deficiências de Ion e OmpT das linhagens BL21, melhorando a solubilidade das proteínas recombinantes Linhagens E. coli Origami-B são derivadas de uma mutante de lacZY da BL21 para controlar precisamente os níveis de expressão pelo ajuste fino da concentração do IPTG como no caso do mutante lacY OrigamiTM2 (Novagen) Sistema de expressão 1 Procarioto - Bactérias 2.4 - Falta um sistema eficiente de secreção em E. coli A maioria das linhagens de E. coli não tem uma via bem organizada de translocação pela membrana externa Algumas sequências sinais podem auxiliar esta secreção para o meio extra-celular através de uma via dependente de partícula de reconhecimento de sinal (SRP dependente). GTPase pode se ligar tanto à uma sequência sinal de certas proteínas a serem secretadas (sendo altamente hidrofóbica) ou à segmentos transmembrânicos de proteínas de membrana interna assim que elas emergem dos ribossomos complexo é direcionado à membrana 03/03/2017 44 Sistema de expressão 1 Procarioto - Bactérias 2.4 - Falta um sistema eficiente de secreção em E. coli • Sequência sinal da OmpA tem sido usado em alguns estudos para translocar alguns peptídeos recombinantes para o periplasma para provável secreção no meio de cultura; • Co-expressão de dois fatores de secreção (secY e secE) tem sido utilizado para aumentar a secreção de algumas proteínas. Sistema de expressão: bactérias – E. coli 2.5 - E. coli pode não enovelar a proteína corretamente Enovelamento correto – E. coli que sintetize grandes quantidades de proteínas chaperonas adaptadas para auxiliar no dobramento de novo da proteína, facilitando a obtenção conformacional própria do polipeptídeo expressado, e/ou localização celular sem se tornar parte da estrutura final Chaperonas evitam a formação de corpos de inclusão e agregação DnaK e GroEL (chaperonas de enovelamento) IbpA (chaperona de suporte – holding) ClpB (chaperona desagregadora) 03/03/2017 45 http://4.bp.blogspot.com/_wLLEpWhLkEw/SFG-d3gxm5I/AAAAAAAAAD4/MYMLo9cnftk/s320/d%25C3%25BAvida.jpg Sistema de expressão: bactérias – E. coli E se nada disso der certo... Modifique: - A Temperatura de expressão: diminua a temperatura (15-23C) interações hidrofóbicas determinando corpos de inclusão são temperatura-dependentes; heat shock proteases são menos ativas a menor temperatura; - A composição do meio: Referências bibliográficas Brown TA. Clonagem gênica e análise de DNA – Uma introdução. 4 ed., Porto Alegre, Ed Artmed, 2003. – Capítulo 13 Gad SC. Handbook of Pharmaceutical Biotechnology. New Jersey, Ed. Willey, 2007. – Capítulo 1.1 Sahdev S, Khattar SK, Saini KS. 2008. Production of active eukaryotic proteins through bacterial expression systems: a review of existing biotecnology strategies.Mol Cell Biochem. 307:249-264.
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