Aula Prática Micro básica

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AULA	PRÁTICA	
O Universo da Microbiologia 
Profa.	Dra.	Natália	Franco	Taketani	
UNIVERSO	MICROSCÓPICO	
Devido ao seu tamanho microscópico, os microrganismos são normalmente invisíveis 
a olho nu (a excepção ocorre quando, ao crescerem em populações com milhões de 
indivíduos, se tornam macroscopicamente observáveis, como acontece por exemplo 
com as colónias de bactérias ou de leveduras, com os micélios dos fungos filamentosos 
ou com algumas das suas estruturas de reprodução, como os cogumelos). Mas cada 
célula microbiana é, por definição, microscópica e, por esse motivo, a microbiologia é 
fundamentalmente uma ciência laboratorial. 
A maioria dos estudos laboratoriais ocorre em culturas puras, podendo assim estudar-
se várias características morfológicas ou bioquímicas da espécie em estudo. Mas na 
natureza, os microrganismos não se encontram isolados dos outros seres vivos; de 
facto, a maioria ocorre em comunidades diversas com outros microrganismos e com 
seres macroscópicos, quer plantas quer animais, em meio terrestre, em meio aquático 
e em meio aéreo. Como são microscópicas, as células microbianas encontram-se 
aderidas a superfícies vivas (células ou tecidos de seres macroscópicos), a superfícies 
orgânicas (por exemplo, matéria orgânica morta) ou a superfícies minerais. Assim, a 
sua observação em ambiente natural torna-se muito difícil, se não mesmo impossível 
na maioria dos casos. 
Porém para trabalharmos no laboratório com técnicas de microbiologia devemos ter o 
ambiente controlado para termos certeza que o que estamos manipulando seja o que 
realmente se pretende e que não ocorrerá contaminações por outros micro-organismos. 
 
MEIOS	DE	CULTIVO	
Os microrganismos estão presentes na natureza em comunidades mais ou menos 
complexas. No entanto, para o estudo de muitas características dos microrganismos é 
necessário o seu isolamento em culturas puras. A cultura e o isolamento de 
microrganismos são duas operações básicas em microbiologia. O crescimento de 
comunidades microbianas em meios de cultura no laboratório, permite a obtenção de 
culturas puras – culturas que contêm apenas um tipo de microrganismo – ou de culturas 
mistas – culturas que têm mais do que um tipo de microrganismo. 
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Os meios de cultura possibilitam a multiplicação de microrganismos em laboratório 
sob condições controladas, o que permite o seu isolamento e caracterização 
morfológica e bioquímica. As exigências metabólicas do mundo microbiano são muito 
diversificadas, pelo que os meios de cultura utilizados devem corresponder às 
exigências específicas do tipo de microrganismo que se quer cultivar. 
 
MÉTODOS	ASSÉTICOS	
Quando se pretende cultivar uma cultura de um único microrganismo é importante que 
não existam contaminações provenientes dos meios e materiais utilizados na 
manipulação dessa cultura e do meio ambiente, isto é, que se trabalhe em condições de 
assepsia. Todos os cuidados de assepsia devem observar dois princípios fundamentais: 
- Não permitir que microrganismos existentes no laboratório contaminem as amostras. 
- Não permitir que as culturas em estudo contaminem o laboratório. 
Todos os objectos que entrem em contacto com as culturas (incluindo os meios de 
cultura) devem ser esterilizados. A transferência de culturas de um meio para outro 
deve ser realizada junto a uma chama de um bico de Bunsen ou dentro de uma câmara 
de fluxo laminar. 
 
Bico	de	Bunsen	
O bico de Bunsen é usado para a quase totalidade de aquecimentos efetuados em 
laboratório, desde os de misturas ou soluções de alguns graus acima da temperatura 
ambiente, incluindo procedimentos assépticos em Microbiologia (Figura 1C). 
O gás combustível é geralmente, o gás de rua ou o G.L.P. (gás liquefeito de petróleo). 
O comburente, via de regra, é o ar atmosférico. Como se vê na Figura 1A, com ó anel 
de ar primário parcialmente fechado, distinguimos três zonas de chama: 
a) Zona Externa: Violeta pálida, quase invisível, onde os gases francamente expostos 
ao ar sofrem combustão completa, resultando CO2 e H2O. Esta zona é chamada de zona 
oxidante. 
b) Zona Intermediária: Luminosa, caracterizada por combustão incompleta, por 
deficiência do suprimento de O2. O carbono forma CO (monóxido de carbono) o qual 
decompõe-se pelo calor, resultando diminutas partículas de C (carbono) que, 
incandescentes dão luminosidade à chama. Esta zona é chamada de zona redutora. 
c) Zona Interna: Limitada por uma "casca" azulada, contendo os gases que ainda não 
sofreram combustão mistura carburante. Dependendo do ponto da chama, a 
temperatura varia; podendo atingir 1560 oC (Figura 1B). 
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Abrindo-se o registro de ar, dá-se entrada de suficiente quantidade de O2 (do ar) dando-
se na região intermediária combustão mais acentuada dos gases, formando, além do 
CO, uma maior quantidade de CO2 e H2O, tornando assim a chama quase invisível. 
 
Figura	1.	Funcionamento	do	Bico	de	Bunsen.	A	–	Componentes	e	tipos	de	chama	do	Bico	de	Bunsen;	B	–	Temperaturas	da	 chama	do	Bico	de	Bunsen;	C	 –	 Esquema	da	 área	de	trabalho	asséptico	dada	pelo	Bico	de	Bunsen.	
 
INOCULAÇÃO	
Inoculação é a contaminação proposital de um meio de cultura, ou seja, é a 
transferência de um determinado número de micro-organismos para um meio de 
cultura a fim de que estes se desenvolvam 
No processos biotecnológicos normalmente é usado um volume de inóculo de ~10%. 
 
COLORAÇÃO	DE	GRAM	
É chamado de coloração de Gram o método de coloração utilizado para diferenciar 
espécies bacterianas em dois grupos, bactérias gram-positivas e gram-negativas. Entre 
os fatores que irão diferenciar gram-positivos de gram-negativos, está a coloração 
das bactérias, a composição e propriedades químicas e físicas das paredes celulares 
(Figura 2). 
O método de coloração de Gram é considerado um dos mais importantes dentro dos 
laboratórios de análises clínicas e microbiologia. 
Nas bactérias Gram-negativas, o álcool remove os lipídios da membrana externa da 
parede celular, aumentando a sua permeabilidade; o complexo violeta de cristal-iodo 
pode assim ser extraído, descorando as bactérias. 
Nas bactérias Gram-positivas, o tratamento com álcool resulta na sua desidratação, 
com redução da permeabilidade da parede e consequente retenção do complexo violeta 
de cristal-iodo 
A B C
(Amarela)
(Azul)
Zona	interna
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Figura	2.	Diferença	entre	as	Bactérias	Gram	positivas	e	Gram	negativas	em	microscópio	ótico.	
	
Metodologia	da	Coloração	de	Gram	
Materiais 
- Lâminas 
- Culturas bacterianas em meio líquido e sólido 
- Swab 
- Papel de filtro 
- Óleo de cedro (óleo de imersão) 
- Microscópio 
- Bico de Bunsen 
 
Método 
- É necessário fazer um esfregaço na lâmina de vidro com o swab com a amostra 
desejada. 
- É importante fixar o esfregaço para que este não se perca durante as etapas de lavagem 
entre a utilização de um e outro corantes, para isso passar a lâmina com o esfregaço 
sobre a chama do Bico de Bunsen, até que este esteja completamente seco (Figura 3). 
 
 
Figura	3.	Fixação	do	esfregaço.	
- Cobrir o esfregaço com solução de Cristal Violeta por cerca de 1 minuto para que o 
Cristal Violeta penetra a parede de ambos os tipos de células (Gram + e Gram -) 
(Figura 4). 
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Figura	4.	Imerssão	em	Cristal	Violeta.	
- A seguir, lavar em água corrente com o pissete. A lavagem com água é importante 
após cada etapa para que uma substância utilizada não interfira na ação da próxima. 
Nesse caso, a lavagem serve para retirar o excesso de corante (Figura 5). 
 
 
Figura	5.	Processo	de	lavagem.	
- Cobrir o esfregaço com solução de Lugol fraco por cerca de 1 minuto. O Lugol é uma 
solução de Iodo e funciona como mordente nesta etapa da coloração, ou seja, ele fixa 
o corante Cristal Violeta na parede da célula, pois forma um complexo grande CV-I 
(Figura 6) 
 
Figura	6.	Complexaçãodo	Cristal	Violeta	com	Logol	
 
6	
- Novamente lavar com água, e então lavar com álcool absoluto até que não saia mais 
corante da lâmina (10 – 15 segundos). O álcool absoluto, ou solução de álcool-acetona, 
funciona como diferenciador da coloração: nas Gram +, o álcool desidrata a matriz 
glicoproteica (peptidoglicano), reduzindo os poros da parede e impedindo a saída do 
complexo CV-I, corando a célula de roxo; nas Gram -, o álcool dissolve a membrana 
externa, de caráter lipídico (lipoproteínas, fosfolipídeos, LPS), fazendo com que o 
complexo CV-I saia da parede, deixando a célula descorada e com os poros da matriz 
glicoproteica abertos da matriz glicoproteica abertos (Figura 7). 
 
 
Figura	7.	Desidratação	da	parede	celular	pelo	álcool.	
 
- Lavar com água corrente em abundância, para que não reste álcool sobre a lâmina. É 
importante prestar com bastante atenção nesta etapa, pois se restar algum álcool na 
lâmina a coloração não prosseguirá, já que o próximo corante não se fixará na lâmina 
(Figura 5). 
 
- Cobrir o esfregaço com fucsina por cerca de 30 segundos. A fucsina age de diferentes 
formas nas diferentes células: nas Gram +, os poros estão reduzidos, impedindo que a 
fucsina penetre na parede celular, não alterando a cor roxa; nas Gram -, os poros da 
camada de peptidoglicano estão abertos, permitindo que a fucsina penetre na célula, 
corando-as de vermelho (Figura 8). 
 
7	
 
Figura	8.	Coloração	com	a	Fucsina.	
 
- Lavar com água e secar suavemente com papel. Após secar suavemente a lâmina, 
observar ao microscópio na objetiva de imersão (100x), com óleo de cedro/mineral e 
identificar a célula corada. 
 
MICROSCÓPIO	
Em	primeiro	lugar	é	essencial	que	você	conheça	as	partes	ópticas	e	mecânicas	dos	microscópios	(Figura	4).	
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Figura	9.	As	partes	do	microscópio	óptico.	
Na observação de uma preparação, inicie sempre pela objetiva de menor aumento; para 
focalizar com aquelas de 20 ou 40 vezes, proceda da seguinte forma: 
• Escolha uma estrutura na preparação, mova a lâmina até que o objeto fique 
exatamente no centro do campo, em seguida mude para a objetiva de maior 
aumento, olhando por fora para evitar o choque com a lamínula. 
• Olhar pela ocular e abaixar o tubo ou elevar a platina com o macrométrico 
muito lentamente; assim que a imagem aparecer, mesmo confusa, parar e 
completar a focalização com o micrométrico. 
• O uso da objetiva de imersão é mais delicado, pois a distância focal entre a face 
da objetiva e a parte superior da lamínula, diminui quando a ampliação é 
aumentada. 
• Em primeiro lugar, assegure-se da existência de algo no campo, posicionando 
a objetiva de menor aumento. 
• Certifique-se que a iluminação e o objeto estão bem centrados, suspenda o tubo 
e coloque uma gota de óleo no centro da operação; o óleo deve ter o mesmo 
índice de refração da objetiva; 
• Abaixe o tubo até colocar a lente frontal em contato com a gota de óleo ainda 
convexa, até a mudança de forma da mesma; suspenda levemente o tubo, mas 
sem perda de contato com a gota, coloque os olhos nas oculares e abaixe o tubo 
muito lentamente; assim que a imagem aparecer, complete a focalização com 
o micrométrico. 
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