aula6_msd

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Lisozima 
 
Sítio ativo 
Estas interações ajudam a 
estabilizar ESǂ ?????? E 
comparativamente???? 
Estas interações modulam o pka dos resíduos catalíticos???? 
Replicação: 
Semi-conservativa 
Direcionada (5’ - 3’) 
Dependente de um iniciador 
Catalisada enzimaticamente 
Amplificação in vitro em cadeia de um segmento de DNA 
Todos os produtos 
possíveis servem de 
moldes 
Sistemas de Expressão 
 
Plasm´deos “aceitam” segmentos de DNA que codificam proteínas de 
interesse 
Conferem resístência à antibióticos à bactéria transformada 
Mantem-se estável e se replicam na bactéria transformada 
Sistemas de Expressão 
 
Bacte´rias são usadas para produção de próteínas recombinantes 
Sistemas de Expressão 
 
Proteínas recombinantes se acumulam no citoplasma da bactéria transformada 
Mutagênese sítio dirigida 
Amplificação in vitro em cadeia de um segmento de DNA 
Todos os produtos 
possíveis servem de 
moldes 
Evolução dirigida 
Erros?!? 
DNA polimerases cometem erros. Há diferentes taxas de fidelidade 
Substrato 
NPbglc 
Substrato 
Npbfuc 
 
Crescimento 
Indução IPTG 
Alíquota estoque 
Lise 
Centrifugação 
Coleta de 2 
alíquotas 
 
 
Transferência 
individual de 
colônias para 
placa 96 poços 
Varredura da biblioteca de mutantes randômicos de uma beta-glicosidase 
Seleção de mutantes de enzima com 
 especificidade modificada 
0
0.2
0.4
0.6
0.8
0 10 20 30 40 50 60 70
colônia
ra
z
ã
o
 g
lc
/f
u
c
Varredura: 4032 colônias 
(42 placas 96 poços) 
Média + 2,5 desvios 
padrões 
0 
5 
10 
15 
20 
25 
30 
R189G S378G Y345C S358F wt P348L S424F T35A N400D F460L R474H 
k c
at
/K
m
 fu
c 
/ k
ca
t/K
m
 g
lc
 
enzyme 
	Número do slide 1
	Número do slide 2
	Número do slide 3
	Número do slide 4
	Número do slide 5
	Número do slide 6
	Número do slide 7
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	Número do slide 9
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