A 12 Aula teórica desenho de primers

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DESENHO DE primers 
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GAGATAGAGAGATGGTTTGC
INTRODUÇÃO 
-DEFINIÇÕES 
-CONSIDERAÇÕES NO DESENHO DE primers 
PARÂMETROS 
Primers ESPECÍFICOS 
 Primers DEGENERADOS 
PRIMER 3 
PRIMROSE 
NETPRIMER 
PRIMERSLIST 
- É UM MÉTODO DE AMPLIFICAÇÃO (DE CRIAÇÃO DE MÚLTIPLAS CÓPIAS) DE DNA SEM O USO DE UM ORGANISMO VIVO, POR EXEMPLO, BACTÉRIAS OU LEVEDURAS. 
DNA MOLDE 
Taq DNA POLIMERASE 
Mg2+ 
dNTPS 
primers (forward & reverse) 
PCR (REAÇÃO EM CADEIA DA DNA POLIMERASE) 
(Polymerase Chain Reaction) 
PCR
1993: NOBEL DE QUÍMICA 
Kary Banks Mullis (Bioquímico) 
Kary Mullis 
 1983: Invenção da Reacção em cadeia da polimerase (em inglês Polymerase Chain Reaction - PCR)
Em 1989, a Hoffman La Roche & Perkin-Elmer Corporation patenteou este processo.
PCR 
- Desnaturação
- Anelamento
- Extensão
- Concentração dos reagentes
	Tris-HCl pH 8,8 (20 mM)
	KCl (10-50 mM)
	MgCl2 (1 a 4 mM) – Menos Mg – mais especificidade
	Glicerol (menos que 5%)
	dNTPs (200 a 10 mM – Menos dNTP - mais especificidade)
	Taq (1 unidade)
- Condições dos ciclos
	Etapa de denaturação inicial (1-3 min a 95°C)
	Etapa de denaturação (30 seg a 2 min a 95°C)
	Etapa de anelamento (30 seg a 1 min 50 a 65 °C)
	Etapa de extensão (30 seg a 1min e 30 seg a 70-75°C)
PCR – Otimização da reação
APLICAÇÕES DA PCR 
- Sequenciamento de genes ;
- Diagnóstico de doenças hereditárias;
- Identificação de fingerprint genético (usado em testes de paterninade e na medicina forense),
- Detecção de diagnóstico de doenças infecciosas 
 Criação de organismos transgênicos.
- qPCR 
- PYROSEQUENCING 
O QUE É UM primer? 
UMA SEQUÊNCIA DE DNA QUE SERVE COMO PONTO DE INÍCIO PARA REPLICAÇÃO
 
DNA POLIMERASE SÓ PODE ADICIONAR dNTP A UMA FITA DE DNA PRÉ-EXISTENTE 
COMPRIMENTO DO amplicon 
TEMPERATURA DE MELTING (TM) 
TEMPERATURA DE ANELAMENTO DOS primers (TA) 
VALORES DE ΔG (ENERGIA LIVRE)
 
ESTABILIDADE DA REGIÃO 3’ 
% GC
 
PROBLEMAS NA ESTRUTURA DOS primers 
	estruturas secundárias 
	auto-complementaridade 
	complementaridade com outros primers 
COMPRIMENTO DOS primers
 
TIPOS DE primers 
CONSIDERAÇÕES NO DESENHO DE primers 
COMPRIMENTO DO amplicon 
•RECOMENDAÇÃO  
NÃO EXCEDER 2000 pb 
•CÁLCULO DO COMPRIMENTO DO amplicon 
 COMPRIMENTO DO PRODUTO = 
	(POSIÇÃO DO primer ANTISENSO - POSIÇÃO primer SENSO) + 1 (ÚLTIMA 	BASE) (PRIMEIRA BASE) 
Temperatura de Melting (TM)
- É a temperatura na qual metade das fitas de DNA está na forma de fitas simples e a outra metade na forma de dupla hélice.
- Tm é dependente da composição do DNA, de modo que aumento do conteúdo de G+C no DNA gera um incremento na Tm ocasionado pelo maior número de ligações de H.
Temperatura de Anelamento
– É a temperatura na qual os primers se pareiam ao DNA molde. Ela pode ser calculada a partir da Tm . 
T anneal = Tm_primer – 5°C
Temperatura de melting (Tm) na faixa de 50 °C a 65 °C.
TM → % GC + COMPRIMENTO primer 
DIFERENÇA ENTRE TM DOS primers → NÃO PASSAR DE 5°C 
CÁLCULO BÁSICO: TM = 4(G + C) + 2(A + T) °C 
CÁLCULOS DEPENDENTES DA [ ] DE SAL E DA TERMODINÂMICA 
AMPLIFICAÇÃO PREFERENCIAL 
REDUÇÃO NO RENDIMENTO 
FALHA NA PCR 
TEMPERATURA DE MELTING 
GERALMENTE, EM TORNO DE 5°C ABAIXO DA MENOR TM DO PAR DE primer É UTILIZADA. 
TA OPT = 0.3 X (TM primer) + 0.7 X (TM PRODUTO) - 25 
•TM primer: TEMPERATURA DE MELTING DO primer + MOLDE MENOS ESTÁVEL. 
•TM PRODUTO: É A TEMPERATURA DE MELTING DO PRODUTO DE PCR 
↑ TA: POUCO PRODUTO OU AUSÊNCIA DE ANELAMENTO 
↓ TA: ANELAMENTO INESPECÍFICO 
NA PRÁTICA: ACONSELHA-SE FAZER TESTE COM PCR GRADIENTE. 
TEMPERATURA DE ANELAMENTO DOS primers 
A estringência determina a especificidade no produto de DNA a ser amplificado.
- T anneal é o fator mais significante que afeta a estringência no anelamento do primer.
-T anneal :
	Muito baixa = menor estringência = primer pareia em qualquer lugar.
	muito alta = maior estringência = primer pode não parear.
Estringência no Anelamento do Primer
ΔG DETERMINA A ESPONTANEIDADE DA REAÇÃO 
		 ΔG = ΔH - T ΔS
CÁLCULO TERMODINÂMICO ATRAVÉS DO “VIZINHO MAIS PRÓXIMO” 
	O modelo Nearest-Neighbor (vizinho mais próximo) descreve a 	contribuição da entalpia e da entropia de cada par de bases	vizinhas existentes em uma região de pareamento.
 ΔG TOTAL: INDICA A ENERGIA DIRETAMENTE ENVOLVIDA NA LIGAÇÃO ENTRE “PRIMER” E MOLÉCULA DE DNA 
ESTABILIDADE 3’ 
EXTREMIDADE 5’ 
ESTRUTURAS SECUNDÁRIAS 
VALORES DE ΔG (ENERGIA LIVRE DE GIBBS) 
MÁXIMA ESTABILIDADE 3’ 
DNA POLIMERASE REQUER LIGAÇÃO DE primers NO FINAL 3’ PARA INICIAR A EXTENSÃO 
LIGAÇÕES NÃO ESPECÍFICAS NA EXTREMIDADE 3’ PREJUDICARÃO A PCR 
ΔG DEVE SER MAIS PRÓXIMO DO POSITIVO 
LIGAÇÕES NÃO ESPECÍFICAS NA 5’ NÃO NECESSARIAMENTE PREJUDICAM A PCR 
 40-60% GC → > ESTABILIDADE 
 LIGAÇÃO GC → > ESTABILIDADE 
(MAIOR TEMPERATURA DE MELTING) 
 + DE 3 REPETIÇÕES DE G OU C DEVEM SER EVITADAS NAS 5 BASES DA EXTREMIDADE 3’ DO primer → > PROBABILIDADE DE FORMAÇÃO DE dímeros OU mispriming EM REGIÕES RICAS EM GC 
CONTEÚDO GC 
..Pode-se utilizar primers com estas estruturas se estas forem formadas a uma temperatura em torno de 30°C menor que a Tm
ESTRUTURAIS SECUNDÁRIAS: PROBLEMAS 
SELF-DIMER (ΔG IDEAL ≈ -6 KCAL/MOL) 
HETERODIMER (CROSS-DIMER)
(ΔG IDEAL ≈ -6 KCAL/MOL) 
HAIRPIN (ΔG IDEAL ≈ -2 KCAL/MOL) 
ΔG quanto mais próximo do positivo melhor → ligações fracas. 
 Evitar formação de estruturas secundárias formadas nas extremidades 3’ → favorece acoplamento da taq polimerase 
 18-30 BASES 
MINIMIZAR PROBABILIDADE DE ANELAMENTOS INESPECÍFICOS 
(16 pb = 416 = 4.294.967.296) 
COMPARAR SEQUÊNCIA COM BANCO DE DADOS  ANELAMENTOS INESPECÍFICOS 
Primers LONGOS : > PROBABLIDADE DE HIBRIDIZAÇÕES INDESEJADAS 
 (cross-dimer, dimer, hairpin) 
COMPRIMENTO DO primer 
TIPOS DE primers 
 Específicos & degenerados 
(5’ GAGATAGAGAGATGGTTTGC 3’) (5’ TICVCKRTGRTGIHGCYTSCRTCCA 3’) 
CÓDIGO DE BASES DEGENERADAS 
ESPECÍFICOS 
- NCBI (BLAST) 
- BioEdit 
- PerlPrimer
 NETPRIMER 
 Primer 3 plus
DEGENERADOS 
- PRIMROSE 
- GREENE SCPrimer 
- Hyden (Linhart & Shamir, 2005) 
- CODEHOP (Rose et al., 1998, 2003; Rose, 2005) 
- DePiCt (Wei et al., 2003) 
- Primaclade (Gadberry et al., 2005) 
Requerimentos para o desenho de primers
- Sequências de DNA e ou cDNAs do gene de Interesse;
- Ferramentas para o desenho de primers
- OligoAnalyzer 3.1 (Web server)
- OligoTech 
Análise de primers: