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MICROBIOLOGIA Introdução * Microbiologia: estudo de bactérias, algas, fungos, vírus e protozoários. “Teoria da Geração Espontânea” = acreditava-se que organismos surgiam de material sem vida (material estragado, poeira) “Teoria Germinal das Doenças” = afirma que os microrganismos podem invadir outros organismos e causar doenças. Postulados de Koch: * 1. O agente causador específico de uma doença deve ser encontrado em todos os casos da doença * 2. O organismo causador da doença deve ser isolado em cultura pura * 3. A inoculação de uma amostra da cultura em um animal saudável e suscetível deve fazer com que esse animal desenvolva a mesma doença * 4. O organismo causador da doença deve ser recuperado a partir do animal inoculado. _______________________________________________________________ Fundamentos da Microbiologia: características das células eucariótica e procariótica: Célula eucariótica: DNA encontra-se num núcleo circundado por um envoltório nuclear. “Núcleo verdadeiro”. membrana celular com estrutura em mosaico fluído com esteróides, ja a membrana plasmática é constituida de varias organelas envolvidas por membranas. Contem reticulo plasmático, complexo de golgi, lisossomos, peroxissomos, ribossomos e citoesqueleto. suas enzimas respiratórias são as mitocondrias. a parede celular é constituida de celulose, quitina ou ambos e sua divisão celular é por mitose e/ou meiose. Célula procariótica: DNA em região não circundada por membrana (nucleóide). “Núcleo primitivo”. A membrana plasmática é constituida de uma estrutura em mosaico fluido sem esteroides. a membrana interna soh tem em organismos fotossinteticos. não apresenta nenhuma das Estruturas que estão presentes nos eucariotos e a respirão celular é por meio da membrana celular. a parede celular é constituida de peptidioglicano, para protejer o microorganismo do ambiente. e a divisão celular é binaria. os protozoarios apresentam um ribossomo menor (70s) é necessário saber as diferenças entre os dois por isso é a base para a ação de agentes antimicrobianos. Diferenças entre os procariontes: - morfologia: tamanho, forma e características tintoriais (Gram - ou +) - características metabólicas, antigenicas e geneticas. - formas: coco, cocobacilo, vibrião, bacilo, espirilo e espiroqueta. - arranjo: diplo-; estrepto-; tétrade-; sarcina-; estafilo-. Célula bacteriana: membrana celular, as vezes envolta por uma parede celular e as vezes envolta por uma camada adicional externa. o citolasma interno possui ribossomos, região nuclear e em alguns casos granulos e vesiculas. sua extruna externa é em capsula, flagelo ou pili. Parede celular: encontrada em quase todas as bacterias. fica fora da membrana plasmatica. função: manter a forma da celula e impedir o rompmento da celula quando liquidos fluem para o seu interior por osmose. componentes: peptideoglicano e ácido teicoico (nas gram +). Membrana externa: presente nas gram -. membrana em bicamada ligada ao peptideoglicano por uma camada de lipoproteinas. Lipopolissacarideo: identifica bacterias gram -. espaço periplasmatico: entre a parede cellar e a membrana plasmatica. area mto ativa do metabolismo celular (possui enzimas digestivas e proteinas de transpote q destroem patogenos de bacterias). Bacteria gram +: camada espessa de peptideo glicano, possui acido teicoico, mas nao possui membrana externa e espaço periplasmatico. os lipedios estão em escasses. sua forma é sempre rigida. resultado da digestão enzimatica: protoplasto. muito sensivel a corantes e antibioticos. Bactéria gram -: camada fina de peptideoglicano. nao possui acido teicoico. apresenta lipopolissacarideo, membrana externa e espaço periplasmatico. forma rigida ou flexivel. resultado da digestão enzimatica: esferoplasto. moderadamente sensivel a corantes e antibioticos. Bactéria álcool-ácido resistentes: possui poucos peptideosglicanos. acido teicoico, membrana externa e espaço periplasmatico estao todos ausentes. possui ácido micolico, ceras eglicolipidios. forma rigida ou flexivel. dificil de digerir. pouco sensivel a corantes e antibioticos. membrana celular: viva, dinamica e em constante mudança. modelo de mosaico fluido: os fosfolipideos estão no estado fluido e as proteinas estão dispersas entres as moleculas de lipideos. estrutura interna: citoplasma, ribossomos, nucleoide, inclusoes (granulos, vesiculas e vacuolos), endosporos. estrutura externa: flagelos (movimento), filamentos axiais (faz girar como saca-rolha), pili (podem ser de conjugação-serve para transferir material genetico- ou de ligação-usado pra prender bacterias as superficies) e glicocálice (podem ser as capsulas ou camadas limosas). __________________________________________________________________ Metabolismo e crescimento bacteriano: O crescimento bacteriano requer uma fonte de carbono e nitrogenio, uma de energia e água/ions. Fonte de energia e materia prima, para construção de proteinas, estruturas, membranas e maqinaria bioquimica. elas obtem e sintetizam aminoacidos, carboidratos e lipideos. O crescimento bacterinao é o aumento no NUMERO DE CELULAS e nao no tamanho. metabolismo: soma de todos os processos quimicos que ocorrem em um organismo. anabolismo: reações que NECESSITAM DE ENERGIA para sintetizar moléculas complexas a partir de moleculas simples. necessário para o crescimento, reprodução e reparo de estruturas celulares. catabolismo: reações que LIBERAM ENERGIA através da quebra de mol´culas complexas em moléculas simples. fornece energia para processos vitais como o movimento, transporte e sintese de moléculas. bacterias podem ser: anaeróbios obrigatórios, aeróbios obrigatórios ou anaeróbios facultativos. Metabolismo Anaeróbio: -Glicose: não necessita de O2 podendo ocorrer na sua presença ou não. -Fermentação: ocorre na ausencia de O2. Metabolismo Aeróbico: -Ciclo de krebs -Transporte de elétrons e fosforilação oxidativa. Metabolismo de lipídios e proteínas: a maioria dos organismos obtem energia da glicose, mas para toda substancia organica há um microorganismo que pode metaboliza-la (enzimas): - lipidios -> ácidos graxos -> CICLO DE KREBS. - proteínas -> aminoácidos -> GLICOSE, FERMENTAÇÃO ou CICLO DE KREBS. Divisão celular: maioria sofre divisão binaria. as celulas filhas se tornam independentes quando um septo cresce entre elas separando-as. A sintese de dna é continua e capaz de replicar o unico cromossomo bacteriano imediatamente antes da celula se dividir, sendo que a replicação do cromo se completa antes da divisão celular. em algumas especies a separação incopleta das celulas produz cadeias lineares, trétades, sarcinas e cachos de uva. Fase de LAG: os organismo nao crescem em numeros mas sao metabolicamente ativos: crescem de tamanho, sintetizam enzimas, incorporam moleculas do meio e produzem ATP. Fase de LOG: crescimento populacional ocorre em velocidade exponencial ou logaritima. Nessa fase os organismos se dividem em intervalos regulares, geneticamente determinado, chamado TEMPO DE GERAÇÃO. a população dobra em cada tempo de geração. Esse crescimento é por tempo limitado, pois a medida q os nutrientes sao consumidos, os residuos metabolicos se acumulam e o espaço se torna pequeno, reduzindo a taxa de crescimento. Fase estacionária: Divisão celular decresce ao ponto em que novas celulas sao produzidas na mesma velocidade com que as células antigas morrem, devido a nutrientes limitados, residuos toxicos, suprimento de o2 inadequado e alteração no pH. Fase de declínio (morte): numero de celulas vivas decresce em velocidade logaritima a medida que as condições do meio se tornam menos favoraveis. muitas celulas vao assumir forma incomum e algumas especies formam esporos. Crescimento de colônias: em meio sólido, à partir de uma celula bacteriana que se divide, forma-se uma colonia. UFC (unidade formadora de colonia) -> cada bacteria da origem à uma colonia e a contagem é representada por UFC/ml. Métodos De Medição: -diluição de seriee contagem-padrão em placas. -contagem microscopica direta (camara de petroff). -método no numero mais provavel (NMP). -filtração. -turbidez. ____________________________________________________________________ Esterilização: morte ou remoção de todos os MO's em um material. Desinfecção: Redução do numero de MO's patogenicos em materiais, de modo que estes nao representem ameaça de doença. agentes antimicrobianos químicos: influenciado pelo tempo de exposição, temperatura, pH e concentração da substancia (alta concentração: BACTERICIDA. baixa concentração: BACTERIOSTÁTICAS). - Álcool 70%: exceção, pois o alcool 70 é mais potente até que o 99%, isso pq um pouco de água deve estar presente para ocorrer a reação de desnaturação de proteinas e também porque uma mistura de 70% de alcool/água penetra mais profundamente nos materias do que um alcool puro. Caracteristicas de um desinfetante: ter ação rápida, atuar sobre todos os tipos de MO's, penetrar no material sem danificar, facil de preparar e estável ao calor/luz, baixo custo e não deve possuir odor desagradavel. agentes antimicrobianos físicos: - calor seco (forno de pasteur, flambagem): oxidação de moléculas - calor úmido (autoclave): desnaturação proteica. Tem maior poder de penetração. - pasteurização. Esterilização por: - Radiação (UV, microondas) - Ondas sônicas e ultra-sônicas (Sonicação - rompe célula por onda sonora -, e cavitação - forma cavidades nas bacterias desintegrando e desnaturam proteinas) - Filtração (membranas filtrantes) Temperatura Fria: retarda o crescimento dos mo's pela redução das reações controladas por enzimas, mas nao mata os mo's. o congelamento, secagem e liofilização, são utilizados para preservar tanto os alimentos quanto os microorganismos. _________________________________________________________________ MICROSCOPIA: torna coisas muito pequenas vísiveis ao olho humano. COLORAÇÃO: - Simples: um único corante. - Diferencial: dois ou mais corantes e diferencia microorganismos ou partes deles. Mais utilizados: - Corantes Catiônicos (+) ou basicos: azul de metileno, cristal violeta, safarina e verde de malaquita. - Corantes aniônicos (-) ou ácidos: eosina e ácido pícrico. Coloração Gram: 1- cora-se as celulas com cristal violeta 2- acrescenta-se lugol (mordente - iodo auxilia na retenção do corante às células gram+) 3- lava-se a lamina com alcool-cetona (as células que nao reterem o cristal violeta serão descoradas pelo álcool-cetona) 4- acrescenta-se fucsina (vão corar as que foram descoradas pelo álcool-cetona: gram-) Grupos de Gram: - Gram +: parede celular que retem o cristal violeta. - Gram -: parede celular que não retem o cristal violeta. - Gram não-reativos: não se coram. - Gram lábeis (variáveis): se coram de maneira desigual. __________________________________________________________________ Genetica Microbiana: toda informação necessaria à vida está armazenada no material genetico de um organismo: DNA ou RNA. Um cromossomo é uma molecula de DNA em forma de fita dupla (circular para procariontes e linear para eucariontes). A célula procarionte possui um unico cormossomo circular moldado num nucleoide (superenovelamento) que se replica e cada celula-filha recebe um dos cromossomos transmitindo a informção genetica da célula-mãe para a cél-filha. função das informações no DNA: replicar o DNA para divisão celular e proporcionar informações para sintese de proteinas (ocorre em ambar por pareamento de bases). elementos genticos extracromossomicos: - plasmidios: pequenas moleculas de dna contendo informações geneticas. - bacteriófagos: vírus que infecta bacterias. Inúmeras bacterias são promiscuas com sue DNA (promovem trocas de dna que permitem o intercambio de genes entre as celulas produzindo novas cepas bacterianas). essa troca de dna pode ser vantajosa ao receptor especialmente se o DNA alterado codificar "resistencia à antibióticos". (VANTAJOSA???) Esse dNa pode ficar no cromossomo doreceptor, em forma extracromossomica ou ser transferiado à filha. Mutações: - Genótipo: composição genetica de um organismo. - Fenótipo: expressção física do genótipo. - Mutação: alteração permanente na sequencia de nucleotideos de um DNA. - Mutações pontuais: mudança de um unico nucleotideo. - Mutações por deslocamento, inserção ou deleção de um ou mais nucleotideos. variações fenotipicas nao podem envolver: alterações na morfologia da colonia, nos nutriente requeridos e na sensibilidade a temperatura. Mecanismo de transferencia genetica: - conjugação: atraves de um pilus sexual/plasmidio de uma bacteria doadora para uma receptora. - transformação: aquisição de novos marcadores geneticos por incorporação de dna estranho. - Transdução: transferencia de informação genetica de uma bacteria para outra atraves de bacteriofago. Engenharia genetica: Pela engenharia genetica é possivel isolar e expressar genes de proteinas uteis, como: insulina, interfron, hormonio de crescimento e interleucinas, em bacterias, leveduras e ate insetos. EX: - Transgenicos - Utilização na medicina, industria e agricultura __________________________________________________________________ Agentes Antimicrobainos: - Quimioterapia: tratamento de moléstias com substancias quimicas. EX: Quimioterapicos (sintetizados em laboratorios) Antibióticos (produzidos por seres vivos - bacteria ou fungo) considerações para o estudo de antimicrobianos: patogenicidade, hospedeiro e agente antimicrobiano (ou seria microbiano?) Toxicidade seletiva: baseia-se na exploração das diferenças na estrutura e metabolismo dos mo's e da celula hospedira. a essencia da quimioterapia antimicrobiana é matar ou inibir o microorganismo sem afetar o hospediro. Ocorre com maior probabilidade em organismos procariotas devido o maior grau de diferença com a celula hospedeira. * vírus são mais dificeis de serem atingidos pelos agentes microbianos, devido seu parasitismo intracelular obrigatorio. agente antimicrobiano ideal: -quanto as propriedades antimicrobianas: toxicidade seletiva, amplo espectro de ação e atividade antibacteriana e antifungica. - quanto as propriedades farmacologicas: atóxico para o hospedeiro; meia-vida longa no plasma (1 dose diaria); boa distribuição tecidual; baixa ligação às proteinas plasmaticas; formulações para dosagem oral e parenteral; ausencia de interferecia com outras drogas. Classificação: -pela ação bactericida ou bacteriostática -pelo sitio de ação -pela estrutura quimica Sitios de ação: sintese da parede celulas; sintese de proterinas; sintese de acidos nucleicos; funçao da membrana celular. 1: antibacterianos que atuam na parede: Beta-lactâmicos - se ligam a proteinas da parece bacteriana bloqueando a etapa final da sintese da camada de peptideoglicano, matando a bacteria. (ex: penicilina) 2: antibacterianos que atuam na membrana citoplasmatica: polimixinas - atuam como detergentes cationicos, provocando desorganização na membrana, com a saida de componentes celulares e a morte bacteriana. 3: antibacterianos que atuam na sintese de proteinas: ligam-se a subunidades dos ribossomos, inibindo a sintese proteica (ex: aminoglicosídeos). 4: antibacterianos que atuam na sintese do DNA: metronidazol - é degradado e seus produtos intercalam-se na molecula de dna quabrando-a e impedindo sua sintese; derivados quinolonicos e rifampicinas - interferem nas etapas da sintese de dna. Resistencia como resultado de mutação cromossomica: organismos mutagenicos podem adiquirir tolerancia a drogas (quimioterapicos ou antibioticos) Resistencia adiquirida atraves de genes em plasmidios: plasmidios podem conferir vantagens seletivas à bacteria, exemplo: resistencia a antibiotico. resistencia adiquirida por transposons (genes saltadores): responsaveis pela disseminação de genes que conferem resistencia bacteriana aos antibioticos e quimioterapicos. MECANISMOS DE RESISTÊNCIA: * Alteração no sítio-alvo: de maneira a apresentar uma baixaafinidade pelo antibacteriano e permitir o funcionamento normal do metabolismo da bactéria. * Alteração no acesso ao sítio-alvo. -Permeabilidade celular: aumentado a impermeabilidade da parede celular -Mecanismo de Efluxo (bomba de efluxo): eliminação da droga do interior da célula * Produção de enzimas que modificam ou inativam a droga: -Beta-lactamases -Enzimas modificadoras dos aminoglicosídios -Acetil transferases do Cloranfenicol TESTES DE SUSCETIBILIDADE (antibiograma) * Após o isolamento do patógeno é possível investigar a interação entre os agentes antimicrobianos e as bactérias isoladas. * Os testes de suscetibilidade enquadram-se em duas categorias principais: -Testes de difusão (difisão de disco) -Testes de diluição (MIC) Teste de difusão: * Princípio: observar a resistência ou sensibilidade que uma determinada cepa bacteriana possui frente a antimicrobianos, através de zonas de inibição “in vitro”. INTERFERENTES: A execução técnica deste exame está sujeita a várias interferências, por isso deve ser rigorosamente controlada. Entre as causas mais freqüentes de erros podemos citar: * A análise de mais de uma cepa concomitantemente * Inóculo muito denso * Espessura do ágar fora dos padrões ( não deve ser <4> 6 mm) * Discos de antibióticos muito próximos * Discos contendo antibióticos hidrolisados * Concentração inadequada de íons Ca e Mg no meio MH. Teste de diluição: (Teste de MIC = concentração mínima inibitória) * Fornece uma estimativa quantitativa da suscetibilidade ao antibiótico. * Este teste determina as menores concentrações que inibem o crescimento visível in vitro. * Em placas de microdiluição, tubos ou placas, diluições seriadas do antibiótico-teste são preparadas em caldo (ou em meio ágar) e inoculadas com uma suspensão previamente padronizada com o microrganismo a ser testado. * Após 24 h, a MIC é registrada como a maior diluição em que não há crescimento macroscópico. * Os testes MIC são mais onerosos em tempo e material, e não são comumente solicitados de rotina. * São úteis no controle de infecções difíceis como endocardite bacteriana ou para aqueles que não respondem adequadamente a uma terapia aparentemente adequada. * Teste E: é um método alternativo, no qual uma tira de papel filtro é impregnada com um gradiente de antibióticos, e é depositada em uma placa com ágar semeada com o isolado teste. A concentração da tira que inibe o crescimento é o MIC. * Uma das vantagens do MIC é que este pode ser ampliado para determinar a CONCENTRAÇÃO BACTERICIDA MÍNIMA (MBC) = menor concentração de antibiótico para destruir o microrganismo. Para tal, os testes diluídos (MIC) são subcultivados em meio fresco, livre de antibióticos e incubados por mais 24 h. * O agente antibacteriano será considerado BACTERICIDA se o MBC for igual ou não superior a 4 vezes o MIC. SISTEMAS AUTOMATIZADOS: * O princípio de diluição do MIC é a base de alguns sistemas de testes de suscetibilidade automatizados, que utilizam uma medida da viabilidade bacteriana (turbidez, impedância elétrica, etc) na presença de antibacterianos como sistema indicador. * Esses sistemas podem produzir resultados mais rapidamente (5 horas) que os testes convencionais (24 h). AGENTES ANTIFÚNGICOS: * As drogas antifúngicas são relativamente limitadas devido à semelhança da célula fúngica e da célula humana (ambos eucariotos). Essas drogas podem ser tóxicas ao hospedeiro. As drogas antifúngicas podem ser divididas em duas categorias: * -as que alteram a membrana celular * -as que atuam intracelularmente (interrompendo processos celulares vitais como a síntese de RNA, DNA e Proteínas) Classes de antifúngicos Célula: Humana= colesterol; Fúngica= ergosterol * Polienos anfotericina B, nistatina (atuam diretamente sobre o ergosterol da membrana) * Azóis (14-lanosterol dimetilase biossíntese do ergosterol) * Análogos da Pirimidina flucitosina (5FC) (inibe a síntese de proteína e replicação do DNA) * Caspofungina inibe a síntese do polissacarídio -glucano da parede celular TESTES DE SENSIBILIDADE ÀS DROGAS ANTIFÚNGICAS: * Os protocolos M27-A2 e M38 da NCCLS (Comittee for Clinical Laboratory Standards) são os métodos de referência, e padronizam instrumentos de trabalho, inóculo, meios de cultivo, tempo e temperatura de incubação. * O método de escolha é a da Microdiluição para determinação do MIC ou CIM (concentração mínima inibitória). * Métodos comerciais como o E-test também são utilizados. É um sistema que também determina a CIM, está bem adaptado a várias drogas antifúngicas e apresenta uma boa correlação com os métodos de referência.
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