Protocolo de Prova Prática III (Ação Enzimática Influência da concentração de substrato) Bioquimica I

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Protocolo de Prova Prática III – Bioquímica I 
 
Objetivos: Estabelecer a influência da concentração de sacarose 
sobre o velocidade inicial da reação enzimática promovida pela 
enzima Invertase e, a partir disso, calcular os parâmetros cinéticos 
KM e VM. 
Metodologia geral: Será feito um experimento fixando parâmetros 
como temperatura, pH, concentração da enzima e tempo e feito um 
gradiente de concentração de substrato em 5 tubos, cada um 
contando com seu respectivo Branco de reação. Após o tempo 
fixado de reação será adicionado DNS nos tubos, o qual para a 
ação da invertase por ser alcalino. Após a reação desse último 
composto será feita a leitura da absorvância de cada tubo e 
calculado a concentração do produto formado e concentração do 
substrato. A partir disso, será feito um gráfico de uma reta e a partir 
dos parâmetros estabelecidos por ele, será calculado KM e VM. 
Passo a passo 
Preparando a mesa 
 Colocar sobre a bancada uma estante com 10 tubos. Cinco 
desses tubos serão reatores de reação, sendo um para cada 
concentração de substrato, e os outro cinco servirão para 
preparação dos brancos de cada uma das reações. ( ) 
 Colocar uma pipeta P1000 (pipeta azul), a qual servirá para 
a adição do substrato e do tampo, e uma pipeta P200, a 
qual servirá para adição da enzima. Colocar também as 
caixas de ponteiras correspondentes a cada uma delas. ( ) 
 Marcar os tubos com uma caneta específico nomeando de 1 
a 5 (1, 2, 3, 4 e 5). Fazer também a marcação 
correspondente aos brancos, marcando de B1 a B5 (B1, B2, 
B3, B4 E B5). Não esqueça de identificar a dupla/trio. ( ) 
 Colocar em um canto da mesa uma pipeta de 20 ml e um 
becker de água destilada cheio. Pode ser feito 
posteriormente, enquanto ocorre o aquecimento para a 
reação do DNS. ( ) 
 Caso possível, deixe os vidros de reagente próximos de 
você. Será utilizado nessa prática os seguintes reagentes: 
Sacarose ([ ] = 0,02M; 0,03M; 0,05M; 0,1M; e 0,2M), 
tampão e Invertase (enzima que converte sacarose em 
glicose + frutose). Também será utilizado DNS para a 
dosagem, mas provavelmente ele estará já setado em 1 ml 
na bancada. 
Preparação das reações (Tubos 1 a 5) 
 Adicione no tubo 1 0,5 ml (500 na pipeta) de sacarose com 
concentração igual a 0,02 M. ( ) 
 Adicione no tubo 2 0,5 ml (500 na pipeta) de sacarose com 
concentração igual a 0,03 M. ( ) 
 Adicione no tubo 3 0,5 ml (500 na pipeta) de sacarose com 
concentração igual a 0,05 M. ( ) 
 Adicione no tubo 4 0,5 ml (500 na pipeta) de sacarose com 
concentração igual a 0,1 M. ( ) 
 Adicione no tubo 5 0,5 ml (500 na pipeta) de sacarose com 
concentração igual a 0,2 M. ( ) 
OBS: LEMBRE-SE DE TROCAR AS PONTEIRAS AO MUDAR AS 
CONCENTRAÇÕES DA SACAROSE! ISSO PODE AFETAR NO 
RESULTADO. TAMBÉM TOME CUIDADO COM AS BOLHAS! 
Por Atiles Reis 
 
 
 Adicione em cada tubo 0,3 ml (300 na pipeta P1000) de 
solução tampão ( ) 
 Pegue o cronometro e esteja preparado para acioná-lo a 
qualquer instante 
 Sete a pipeta P200 para 200, quantidade equivalente a 0,2 
ml de solução. 
 Acione o cronometro e nesse imediato momento adicione ao 
tubo 1 0,2 ml de enzima. ( ) 
 Sem trocar a ponteira, quando o cronometro marcar 20 
segs, adicione ao tubo 2 0,2 ml de enzima. ( ) 
 Sem trocar a ponteira, quando o cronometro marcar 40 
segs, adicione ao tubo 3 0,2 ml de enzima. ( ) 
 Sem trocar a ponteira, quando o cronometro marcar 1 min, 
adicione ao tubo 4 0,2 ml de enzima. ( ) 
 Sem trocar a ponteira, quando o cronometro marcar 1 min e 
20 segs, adicione ao tubo 5 0,2 ml de enzima. ( ) 
 Aguarde 4 minutos e 30 segundos e vá para a bancada do 
DNS ( ) 
 Quando o cronometro marcar 5 min, adicione 1 ml de DNS 
no tubo 1 e vortexize ele rapidamente ( ) 
 Quando o cronometro marcar 5 min e 20 segs, adicione 1 
ml de DNS no tubo 2 e vortexize ele rapidamente( ) 
 Quando o cronometro marcar 5 min e 40 segs, adicione 1 
ml de DNS no tubo 3 e vortexize ele rapidamente ( ) 
 Quando o cronometro marcar 6 min, adicione 1 ml de DNS 
no tubo 4 e vortexize ele rapidamente( ) 
 Quando o cronometro marcar 6 min e 20 segs, adicione 1 
ml de DNS no tubo 5 e vortexize ele rapidamente ( ) 
Esse gradiente de tempo garante que você tenha exatos 5 
minutos de reação a cada tubo, fixando o tempo o qual já se sabe 
de aulas anteriores, que a invertase ainda está em velocidade 
inicial. A adição do DNS, por ser um composto alcalino, paraliza a 
reação. 
 Antes de aquecer as amostras, prepare os brancos. 
Preparação dos Brancos (Tubos B1 a B5) 
O procedimento é praticamente o mesmo da preparação das 
reações, só que nesses tubos você não quer que a invertase 
funcione então, a adição dela será depois da adição do DNS. 
Dessa forma: 
 Adicione no tubo B1 0,5 ml (500 na pipeta) de sacarose com 
concentração igual a 0,02 M. ( ) 
 Adicione no tubo B2 0,5 ml (500 na pipeta) de sacarose com 
concentração igual a 0,03 M. ( ) 
 Adicione no tubo B3 0,5 ml (500 na pipeta) de sacarose com 
concentração igual a 0,05 M. ( ) 
 Adicione no tubo B4 0,5 ml (500 na pipeta) de sacarose com 
concentração igual a 0,1 M. ( ) 
 Adicione no tubo B5 0,5 ml (500 na pipeta) de sacarose com 
concentração igual a 0,2 M. ( ) 
 Adicione em cada tubo 0,3 ml (300 na pipeta P1000) de 
solução tampão ( ) 
Caso prefira, ou até por motivos de economia de ponteiras, a 
adição da sacarose e do tampão dos brancos podem ser feita 
simultaneamente com a adição nos tubos de reação. Seja 
cuidadoso para não confundir os tubos. 
 Adicione 1ml de DNS em cada um dos tubos ( ) 
 
 
 Sem se preocupar com o tempo, adicione 0,2 ml de enzima 
em cada um dos tubos. Por o DNS já estar em solução, não 
haverá reação. ( ) 
Reação do DNS 
 Após a adição do DNS em todos os tubos, tal como todos os 
reagentes, coloque os 10 tubos para ferver a 100°C por 
exatamente 5 minutos. ( ) 
 Retire os tubos do bequer no qual eles estão sendo 
aquecidos e deixe esfriar. ( ) 
 Pegue a pipeta de 20 ml e o bequer com a água destilada e, 
quando os tubos estiverem frios, adicione 13 ml em cada um 
dos tubos. ( ) 
 Faça a homogeneização dos tubos. Não será possível 
vortexizar então, cuidadosamente, homogenize com as 
mãos. Tenha cuidado com o dedo que você está utilizando 
no processo pois não pode haver contaminação. ( ) 
Leitura das absorvâncias 
ESPECTOFOTÔMETRO UTILIZADO [ ] 
 Verifique se o espectofotômetro está regulado para a leitura 
a 540 nm. Caso não, ajuste para tal valor ( ) 
 Adicione o Branco 1 e tare o espectofotômetro ( ) 
 Leia a absorvância do Tubo 1 ( ) 
 Lave bem a cubeta e repita a operação com os restantes 
dos tubos. B2 ( ) 2 ( ) B3 ( ) 3 ( ) B4 ( ) 4 ( ) B5 ( ) 
5 ( ) 
 
 Anote as absorvâncias na tabela a seguir: 
 
TUBO ABS A 540 nm 
1 
2 
3 
4 
5 
 
Cálculo da velocidade de reação 
 O primeiro parâmetro a ser definido é a velocidade de 
reação, a qual é uma razão entre o produto formado pelo 
tempo de ação da enzima – que, nesse experimento, foi 
fixado em 5 minutos –. Dessa forma, para fazermos essa 
conta é preciso fazer o cálculo da quantidade de produto 
formado, que é feito da seguinte forma: 
Produto formado = Absorvância 
 
 A unidade do cálculo do produto é Micromolar (µmol) 
 Para fazer esse cálculo, utilize o K da curva padrão 
estabelecida na aula de Influência do tempo e da [E]. 
 
Valor de K obtido na curva-padrão realizada por Atiles Reis e 
Tainah Mattos em 02/06/2017: 0,0786 
 
 K 
 
 
 Anote os resultados a seguir 
 
Produto formado (Abs/K)Tubo 1: 
 
Tubo 2: 
 
Tubo 3: 
 
Tubo 4: 
 
Tubo 5: 
 
 Agora é possível calcularmos a velocidade de reação. Ela é 
dada pela seguinte fórmula: 
 
Velocidade de reação = Produto formado 
 
 
 A unidade do cálculo do produto é Micromolar por 
minuto (µmol/min) 
 
 Anote os resultados a seguir: 
 
Velocidade de reação 
 
Tubo 1: 
 
 
Tubo 2: 
 
 
Tubo 3: 
 
Tubo 4: 
 
 
Tubo 5: 
 
 Agora que você já obteve a velocidade de reação, é 
necessário calcularmos a concentração de substrato em 
cada tudo. A conta a ser realizada é a mesma dos métodos 
de diluição, ou seja, concentração inicial (Ci) multiplicada 
pelo volume inicial (Vi) igualada a concentração final (CF) 
multiplicada pelo volume final (VF). Resumidamente 
 
Ci . Vi = CF. VF 
 
 A concentração a ser calculada é a da sacarose, dessa 
forma, caso as concentrações molares sejam as mesmas 
descritas aqui, os resultados seriam os seguintes: 
 
Tubo 1: 0,02 . 0,5 = X . 1 
X = 0,01 mol/ml 
 
Tubo 2: 0,03 . 0,5 = X . 1 
X = 0,015 mol/ml 
 
Tubo 3: 0,05 . 0,5 = X . 1 
X = 0,025 mol/ml 
 
Tubo 4: 0,1 . 0,5 = X . 1 
X = 0,05 mol/ml 
 
Tubo 5: 0,2 . 0,5 = X . 1 
X = 0,1 mol/ml 
 
Tempo 
 
 
 Depois do calculo desses dois parâmetros, ainda é 
necessário mais um passo antes da confecção do gráfico: a 
inversão dos valores, ou seja, 1/V e 1/[S]. Isso é necessário 
estamos realizando o plot de Lineweaver-Burk, que 
representa a equação de Michaelis e Menten de forma 
linearizada. Dessa forma, com a inversão dos valores 
conseguimos obter uma reta e fazer uma análise mais 
apurada dos valores. Anote os valores a seguir 
 
 
Tubo 1 
1/V = 1/[s] = (100 M) 
 
Tubo 2 
1/V = 1/[s] = (66,67 M) 
 
Tubo 3 
1/V = 1/[s] = (40 M) 
 
Tubo 4 
1/V = 1/[s] = (20 M) 
 
Tubo 5 
1/V = 1/[s] = (10 M) 
 
Plotagem do gráfico 
 
 Crie duas colunas no computador: uma 
para a velocidade e outra para a 
concentração do substrato. Marque a 
primeira coluna como 1/[S] e a segunda 
como 1/V e adicione os respectivos 
valores a elas. 
 
 Selecione as duas colunas e clique em inserir. Depois clique 
em Gráfico. Quando a janela de seleção abrir, selecione a 
opção Dispersão (XY) e prossiga dando OK até o final. O 
gráfico gerado será parecido com esse: 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Clique em um dos 
pontos com o botão 
direito do mouse e 
selecione a opção 
adicionar linha de 
tendência. Abrirá um 
Box como esse. 
Selecione as duas 
caixas de equação de 
gráfico e sete a 
retrospectiva para 30 
unidades. Caso esse 
número ainda não seja o 
suficiente para que você consiga ver o momento que a reta 
corta o eixo X, ajuste para mais unidade. Geralmente 30 é 
um número suficientemente bom. 
 
 
Caso sejam os valores 
demonstrados acima 
 
 
 O gráfico gerado será igual a esse: 
 Anote a equação da reta. Ela será necessária para fazer os 
próximos cálculos. Nesse gráfico exemplo ela está 
representada por “Y= 0,0264x + 0,2025”. Preste atenção 
também em seu R2. Ele deve estar o mais próximo de 1 
possível. Dessa forma, caso a reta esteja com um R² < que 
0,99XX, tente tirar algum ponto para verificar se há 
mudanças. Obtendo ou não mudanças no final, não esqueça 
de discutir isso na prova. 
 
Calculando KM e Vm 
 
 Uma equação de uma reta pode ser representada pela 
seguinte fórmula genérica: Y = ax + b. Na equação “Y= 
0,0264x + 0,2025” o a é igual a 0,0264 e o b é igual a 
0,2025. Defina o a e o b de sua reta 
 A velocidade máxima (Vm) é representada por 1/B. Dessa 
forma é fácil calcular esse parâmetro. 
 
Vmax = 1 
 
 Anote aqui o valor de VM: µmol/min 
 Agora que você já possui o valor de VM, é possível calcular o 
valor de Km. A fórmula para o cálculo desse parâmetro é 
representada por: 
 
KM= a . VM 
 
 Anote aqui o valor de KM obtido: M 
 Agora discuta os dados obtidos. Lembre-se que Vmax é a 
velocidade inicial da enzima a qual é definida por um tempo 
X limitado (no caso da invertase, cerca de 12 minutos). 
Temos nesse momento um comportamento linear da reta 
pois não há reação inversa (conversão do produto em 
substrato) ainda. Km representa a equação da reta e pode 
ser definida como a afinidade de uma enzima por um 
substrato X. Quanto menor esse valor, melhor. 
 
Observações 
 A enzima invertase tem como temperatura ideal 55°C, por 
isso, o experimento deverá ser realizado sem nenhuma 
refrigeração. Pelo menos até o momento de adição do DNS. 
Lembre-se de discutir isso na prova. 
B