Técnicas de Imunodiagnástico

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Técnicas de Imunodiagnástico 
Dentro dos métodos diretos para identificar os vírus tem os testes imunológicos. 
Hemaglutinação só é aplicável para vírus que tenha atividade hemaglutinante,o principal vírus,da raiva tem essa propriedade,mas não se usa esse método para ele,apesar de ele algutinar hemácia não usa teste derivado da hemaglutinação no diagnostico da raiva pois é um vírus perigoso para se manipular em laboratório,tem outros exemplos hemaglutinantes que se pode aplicar essa técnica de diagnostico laboratorial: Virus de gripe,encefalomielie de cavalo.Esse método consiste em misturar a amostra suspeita com agente hemaglutinante(o vírus hemaglutinante) com suspensão de hemácias,essa amostra suspeita é o material clinico colhido do caso real de doença do campo chegando no laboratório é processado,de modo que uma suspensão é preparada a partir dele,esta é misturada ao eritrócitos,não se fala aqui em misturar amostra suspeita de conter o agente hemaglutinante com o sangue,então não é sangue ,é suspensão de eritrócitos,a qual é preparada a partir do tecido sanguineo,pega o tecido sanguineo colhido com anticoagulante ,centrifuga,retira o plasma,retira (falou em inglês-puffer colt),separa três fases distintas,no fundo do frasco uma camada mais ou menos espessa que são as hemácias ,acima um sobrenadante de cor variável do amarelo claro até um quase transparente que é o plasma e na interface entre essa camada vermelha e esse sobrenadante translúcido tem uma camada delgada muito parecida com uma nuvem branco acinzentado representando o conjunto de leucócitos presente no sangue.Então se retira esse sobrenadante e aspira com a pipeta esse camada branco acinzentada representando o conjunto de leucócitos fica com uma suspensão muito densa de hemácias,fazendo alguns processos de lavagem(colocar solução isotônica tamponada para resuspender essa camada vermelha esegue segue para nova centrifugação para aferventar essas hemácias,estamos fazendo uma lavagem,estamos retirando excesso de plasma de cor vermelho entre aquelas hemacias e aumenta a probabilidade de retirar algum leucócito que tenha ficado perdido,repetindo esse processi de lavagem algumas vezes,obtem uma papa de hemácias,a qual se considerar que tem uma concentração de 100% de hemácias,Max de pureza que podemos conseguir de hemácias do sangue,prepara uma diluição dessa etapa de hemácia que pode se definir padrões de concentração,de suspensão de hemácias que vá alojar no teste de hemaglutinação )com esse material.Então se mistura essas duas substancias no mesmo frasco ,pode ser um tubo de ensaio ou o orifício de uma plaquina de microtitulação,como a do teste de ELISA,vai ter uma mistura homogênea desses dois materiais,se tem aqui um material,um agente hemaglutinante ,ele vai se ligar a superfície dos eritrócitos,como esse material hemaglutinante é um vírus “divalente” (tem no min a capacidade de se ligar ao mesmo tempo a duas hemácias,se tenho quantidade sufienciente desse agente hemaglutinante eles vão em conjunto proprocionar a ligação entre varias superfícies de hemácia,elas vão ficar desse modo aglutinadas,consegue-se fazer a leitura após um período de incubação,mais ou menos uma hora,essa incubação é deixar essa mistura em repouso numa superfície estável ,sem tremor,essas hemácias como acontece com qualquer elemento do sangue que deixo fora do corpo em suspensão vão decantar no fundo do frasco,se as hemácias estão aglutinadas elas vão ter um padrão diferente de decantação daquilo que a gente observa quando as hemácias são livres,quando não estão algutinadas,quando estão algutinadas umas unidas as outras peloas agentes hemaglutinantes,pelos vírus elas vão decantar ocupando uma área grande do fundo do frasco onde a reação está acontecendo,quando estão livres não aglutinadas vão decantar num único ponto do fundo do frasco,aquele que seja o mais baixo,por isso o fundo do frasco ou da placa de microtitulação aonde faço a reação não pode ser plano tem que ser fundo em U ou em V,esse é o ponto mais baixo,as livres se concentram ali,se estão aglutinadas as que estão nessa região vão continuar nessa região porque não estão livres para tocar esse ponto mais baixo. Vê imagem macroscopicamente bem distintas umas das outras. Isso se chama de botão que é a ausência de aglutinação e isso se chama aglutinação.Não sei a identidade desse agente hemaglutinante,sei que aglutina hemácia da espécie X que usei para preparar essa suspensão,é claro que há vírus com a capacidade de aglutinar diferentes tipos de hemácias ,os vírus com atividade hemaglutinante não aglutinam todas as mesmas espécies de hemácias,há vírus que aglutina hemácia de galinha,há vírus que aglutina hemácia humana,porco.Então de acordo qual seja a minha suspeita de agente hemaglutinante vou eleger qual é a espécie doadora detectada para detectar o agente hemaglutinante.Mas os vírus hemaglutinantes não aglutinam só um tipo de hemácia ,só um tipo de espécie de hemácia,isso quer dizer então que hemácia de galinha pode ser aglutinada por mais de um vírus hemaglutinante ,então por um tipo de hemácia não posso saber qual é a identidade do vírus,se tiver suspeita escolho qual tipo de hemácia que se encaixa na suspeita mas preciso saber se aquela hemácia que combina com aquela suspeita foi realmente aglutinada não quer dizer que o agente hemaglutinante seja aquele vírus,pois há outros que mesmo não sendo a suspeita podem aglutinar aquela hemácia,então isso não dá segurança cientifica para fazer identificação do vírus. A vantagem deste teste é que se esta baseando seu diagnostico na tentativa de identificar o agente hemaglutinante antes de fazer o teste que permita a identificação tem que ter o teste que permita a detecção dele, como uma etapa do processo se escolheu esse método,se lhe convem,precisa faze-lo.Fazer teste derivado deste,ou secundário deste que identifique a natureza desse agente hemaglutinante.
Posso quantificar o teste hemaglutinante : quantos agentes,quantas unidades do agente hemaglutinante tem aqui,a unidade ali é unidade hemaglutinante e não de quantidade de vírus,não dá pra saber quantos vírus tem.
Unidade hemaglutinante: Menor quantidade desse material capaz de aglutinar totalmente essa quantidade de hemácia que colocou ali.Para quantificar alguma coisa no laboratório a alternativa é fazer diluições seriadas do que a gente quer quantificar,nesse caso o agente hemaglutinante que suspeito ter nessa amostra,então pega a amostra e dilui seriadamente,pega uma diluição em tampão,salina,diluo esse material,normalmente a diluição é de 1 para 2,onde em 2 partes do volume final da diluição uma delas o material que quero diluir,como faz essa diluição? Pego um volume do material que quero diluir e misturo com um volume igual de diluente,se for uma salina,pega uma pasta de suspensão preparada com amostra química e ai mistura com uma parte igual do diluente ,se colocou 100 microlitros do material mistura com 100 microlitros do diluente.Se tem 1 ml do material ,coloco 1 ml do diluente,mexe tudo e tem a diluição 1 para 2 preparada.Se a partir dessa diluição 1 para 2 preparo outra diluição 1 para 2,agora terá uma diluição 1 para 4 porque essa diluição tem uma parte do material e uma parte do diluente vai diluir 2 vezes mais,quantas partes que eu tenho nessa diluição do material que quero diluir? 1 para 4. Tinha metade na primeira diluição e se a partir dessa faço outra diluição de base 2 vira ¼ dessa diluição nova que é o material que quero diluir , ¾ de diluente,depois é 1/8,no slide 2 ele já começou no 1/8,pode ter sido via diluição clássica seguindo a ordem dita antes,em todas essas diluições ele colocou um volume de diluente e um volume da diluição precedente.Feitas essas diluições seriadas posso concluir que nessa placa centrifugada,cada linha tenho um material diferente,o mesmo material diluído varias vezes,em cada um desses orifícios coloca-se agora um volume igual de uma suspensão de hemácias padronizadas que preparou de acordo com a literatura,vou usar por exemplo hemácias de galinhaa 10%,depois de preparar essa suspensão de hemácia a 10% vou colocar um volume igual em todos os orifícios sem fazer diluição nenhuma ,a diluição eu fiz com o material,depois de todas as diluições coloco o mesmo volume da suspensão de hemácias a 10% e ai incuba,dessa incubação faz-se a leitura,de acordo com a chavinha tem ausência de algutinaçao em alguns orifícios e a partir de um orifício não tem mais botão,tem aglutinação completa.Em todas as diluições,algumas são menores,na diluição menor tem mais material que na diluição maior ,quanto maior a diluição menos amostra tenho. Então olha se qual a maior diluição em que tem aglutinação total das hemácias ,nesse caso desse material na linha 1 a maior diluição com aglutinação total,a diluição de 1/1024,mas coloca-se só o denominador para dizer a diluição.Nesse outro material que foi diluído material da linha de baixo tem a maior diluição com aglutinação total das hemácias na diluição 1/64, na 128 pode ter resíduo de aglutinação,mas é intermediário(hemaglutinaçao parcial).Na linha 3 a maior diluição aglutinação total é na 1/8,a 16 é parcial.Para cada um dos 3 tem diluição diferente definindo o que é unidade hemaglutinante. Comparando,na amostra 1 tenho mais material aglutinante,mais agente hemaglutinante do que no 2 que tem mais que no 3.A aglutinação acontece independente da viabilidade do vírus,ele pode ta inviável mas o que preciso é ter suas estruturas de superfície integras porque são elas que vao intermediar a aglutinação das hemácias.A aglutinação é análoga a adsorção do vírus na célula hospedeira,é um processo parecido.Limitação:sensibilidade baixa ,restrição a algumas proteínas virais que tenham o vírus com atividade hemaglutinante.
Como se identifica o agente hemaglutinante uma vez que ele foi detectado no teste anterior?
Faço outra prova,a inibição da hemaglutinação e nesse caso procedo com diluição de um soro padrão do laboratório,usa-se o agente hemaglutinante que encontrei e vou misturar com o soro padrão que tenho no laboratório,então se suspeito do agente hemaglutinante da espécie X ,só posso fazer o teste da inibição da hemaglutinação se eu tiver no laboratório um soro padrão anti X,de vírus X,então misturo esse agente que sei que está presente aqui com o soro e incubo,a qual é em 37°,o objetivo dessa incubação é permitir a interação do antígeno e anticorpo caso exista identidade entre eles ,depois dessa incubação adiciono a essa mistura as hemácias,a mesma suspensão de hemácias que usei no teste de hemaglutinaçao,ai faço uma segunda incubação só para deposição das hemácias.No final dessa incubação vou observar como as hemácias decantaram,nesse caso já sei que tenho material o agente hemaglutinante , o que espero é que aconteça a aglutinação das hemácias e portanto observação desse tipo de resultado para fazer esse tipo de leitura.Porém se o anticorpo padrão reconhecer o antígeno do agente hemaglutinante esse anticorpo vai impedir que as estruturas de superfície do vírus aglutine as hemácias ,dessa maneira as hemácias permanecerão livres e ai o resultado positivo vai ser justamente a presença do botão ou seja a ausência da hemaglutinação por isso o teste chama inibição da hemaglutinaçao.
Então de onde sai a conclusão que o agente hemaglutinante é o vírus X ? Pelo fato de ter usado anticorpo padrão do laboratório que eu sabia que era especifico para aquele vírus.Se não encontrar inibição da hemaglutinaçao não quer dizer que não seja um vírus e sim que não é a espécie que imaginava.Uma das características que valida esse método para esse diagnostico especifico é o fato de ter um anticorpo que reconhece de maneira eficaz todos os sorotipos que eventualmente existam desse vírus então tem a capacidade de dar falso negativo.Essa é é só uma imagem colorida do que é a visão macroscópica de ausencia de hemaglutinação do processo de aglutinacao . Outra possibilidade de se detectar vírus diferente desse método que discutimos baseado numa detecacao de uma propriedade biologica do vírus ,podemos ver outra parte do vírus antígenos virais na técnica imunoflorescência que é bem conhecida fundamento básico dessa técnica a utilização de um conjugado formado por um anticorpo específico contra o vírus que quer identificar associado a um fluorocromo como exemplo a fluoresceina .esse conjugado a gente coloca sobre a amostra, faz uma lavagem ,aquele conjugado que não tenha reconhecido seu antígeno na amostra será removido e depois submeter um fluoróforo ou fluorocromo a um estímulo da sua fluorescência comprimento de onda que não é tão específico a leitura da imunofluorescência é sempre no escuro e vamos observar a indução de fluorescência ou não , a cor da fluorescência depende do fluoróforo usado aqui é fluoresceína essa fluorescência esverdeada. temos a imunofluorescência indireta e direta a diferença de um metodo para o outro é a especificidade conjugado. na imunoflorescência direta,o conjugado tem a especificidade do antígeno Viral que quero encontrar enquanto que na indireta a especificidade do conjugado é um anticorpo que eu uso antes de adicionar o conjugado na imunofluorescência indireta recebo amostra química é preciso ter no laboratório um anticorpo padrão contra aquele vírus X que estamos suspeitando então coloco esse anticorpo padrão (anticorpo primário) faço uma lavagem e depois coloco o meu conjugado que tem especificidade para o anticorpo que vou adicionar ao teste faço outra lavagem e depois submeto ao microscópio de imunofluorescência ,se houver fluorescência detectada é porque o conjugado fico retido sobre amostra ou seja tem um anticorpo primário que ficou retido antes sobre amostra. Então o conjugado vai indicar a presença do antígeno indiretamente porque ele próprio não está reconhecendo o antígeno viral. Mas primeiro o anticorpo que reconheceu o antígeno viral. a limitação de imunofluorescência é a necessidade de um microscópio que emita luz na faixa ultravioleta porque é isso que esse fluoróforo ,existe a possibilidade de reações inespecíficas Mas isso é fácil de resolver ou discriminar.tem outros exemplos de imunofluorescência com o uso de diferentes fluoróforos microscopia confocal que é um tipo de microscopia de fluorescência que utiliza um laser que define exatamente que nível em que plano da amostra vai excitar o fluoróforo. Consigo com bastante refinamento fazer uma técnica de colocar lização de antígenos diferentes detectados por conjugados diferentes contendo fluoróforos diferentes , consigo ver uma fluorescencia verde que está no mesmo plano que uma fluorescência vermelha a fluorescência verde o fluorofo é a fluoresceína microscopia confocal vejo duas florescências no mesmo plano no mesmo lugar posso dizer que esses dois antígenos estão juntos um microscópio confocal definir em que plano da amostra estou observando que vou excitar fluoróforo. imunoperoxidase é uma outra reação imunológica Aonde posso reconhecer em tudo é parecido com a imunofluorescência a única coisa que muda é a natureza do conjugado na imunoperoxidase esse conjugado não tem fluoróforo mas contém uma enzima que é uma peroxidase enzima de ação parecida um exemplo é peroxidase desse rabanete ou uma fosfatase alcalina obtida de mucosa intestinal essas enzimas ligada ao anticorpo constitui o conjugado utilizado na imunoperoxidas e vamos revelar a reação colocando o substrato da enzima que faz parte do conjugado esse substrato vai sofrer ação da enzima e tem uma química associada aí que faz com que essa ação do substrato resulte na formação de um subproduto colorido o substrato é modificado pela enzima que faz parte do do conjugado e esse substrato modificado leva à formação de um complexo colorido que se precipita sobre amostra e isso vai nos indicar a presença do antígeno Viral procurado nessa amostra aqui no slide 6 outro exemplo como na imunofluorescência para explicar a técnica de peroxidase que podemos supor imunoperoxidase direta ou indireta que é do mesmo princípio do entendimento da imunofluorescência. a diferença entreusar a imunofluorescência e a peroxidase é porque alguns tecidos tem fluorescência ai pode atrapalhar Aí usa técnica da imunoperoxidase Mas pode também ser causa da Comodidade do laboratório.
No slide 7: Imagem imunoperoxidase positiva está feito sobre uma cultura de células infectada por um vírus as células foram coradas estou vendo que o vírus está presente pela reação de imunoperoxidase que resultou na formação desses depósitos castanhos mais ou menos difuso por toda essa cultura de células a olho nu não se consegue ver isso é uma quantidade de depósito colorido muito pequena mas só dá para ver no microscópio importância de se ter corado a célula antes é grande porque se eu não coro a célula antes e so faço imunoperoxidase Como vou saber que esse antígeno viral está mesmo sendo detectado no contexto das células que eu infectei ou do material Clínico que eu trouxe metal material localizar nele o antígeno viral pela técnica de imunoperoxidase. pergunta da Rafa Ele respondeu que o anticorpo primário é sempre o que está embaixo no slide 6 é como na imunofluorescência eu quero detectar um vírus X mas a possibilidade de usar o mesmo conjugado para fazer vários diagnósticos diferentes de vários vírus diferentes então posso ter um anticorpo primário anti vírus X é um anticorpo primário antivírus Y e assim sucessivamente e usar dependendo da suspeita o mesmo conjugado desde que é claro todos esses anticorpos anti-vírus X, anti-vírus Y e assim sucessivamente produzidos na mesma espécie animal isso é importante para que esses diferentes anticorpos que eu posso usar como primários tenham a mesma antigenicidade para serem reconhecidos pelo mesmo conjugado. o método de ELISA também pode ser usado para isso, tem que ser espectrofotômetro o método de Elisa é um método colorimétrico no qual a formação do substrato colorido acontece em solução com a fase líquida dentro de cada poçinho onde a reação está se passando preciso determinar para cada placa de reação de Elisa Qual é o ponto a partir do qual considerar que a intensidade de cor significa um Resultado positivo e qual o ponto abaixo o qual o resultado deve ser considerado negativo isso porque apesar de ter especificidade na ação da enzima sobre o substrato para resultar na cor nessa solução em cada orifício preciso ter apuracia muito grande na leitura da intensidade da cor e o olho humano não pode fazer isso é uma leitura baseada em absorbancia de luz através dessa coluna de líquido, é um espectrofotômetro diferente daquele que a gente vê no laboratório , é uma micro técnica que posso testar vários materiais ao mesmo tempo o espectrofotômetro Faz uma leitura para que essa placa seja movimentada de modo que o feixe de luz passa sucessivamente por cada um dos pocinhos mas o surgimento da cor na reação de Elisa é percebida a olho nu a gradação da intensidade a distinção entre essas diferentes gradações de intensidade não tem como fazer a olho nu por isso eu tenho que usar um instrumento de leitura para identificar qual intensidade que estamos lendo se foi compatível positividade ou não. ainda falando em antígenos virais, em detecção deles tem outra técnica que é a imunocromatografia tem uma reação antígeno anticorpo que vai acontecer na membrana o suporte sólido aonde tem que ter mobilizado previamente um dos reagentes ou antígeno ou anticorpo ,testes como esses testes de Diagnóstico rápido que se faz no consultório de clínica são baseados imunocromatografia uma cromatografia é uma técnica na qual a gente vai fazer migrar num suporte um determinado soluto pelo fluxo de um solvente .
Nesse caso do slide 11 a gente tem um solvente água uma solução aquosa tamponada e vai fazer essa solução aquosa difundir por uma membrana semelhante a um papel( quando a gente pega um papel de filtro e coloca na água, a água vai difundindo para aquele papel vai molhando aquele papel progressivamente essa água que vai difundindo pelo papel pode carrear moléculas que estejam solubilizados na água e quando se fala em imunocromatografia está dizendo que a gente vai ter ou antígeno ou o anticorpo sendo carreado nessa água. o teste rápido deve ser muito semelhante a esse aqui é vendido como um kit q tem uma estrutura plástica parecida com a da foto dentro da qual tenho uma estrutura semelhante a um papel E aí em alguns pontos desse papel como na foto tem padronizado pelo fabricante do teste ou antígeno ou anticorpo necessário para fazer o diagnóstico, também faz parte do Kit esse frasco de solução para preparação da amostra e um tubo para fazer a preparação, amostra é sangue total do animal e sobre esse sangue coloca determinado número de gotas dessa solução de preparação da amostra essa solução faz Lise dos elementos figurados que fazem parte do sangue de modo a facilitar a solubilização de diferentes moléculas proteicos aí incluídas antígenos virais e anticorpos, uma vez o material tratado dessa maneira, ele é colocado num ponto específico desse suporte que tem uma janela de modo que colocamos o material tratado o sangue do animal tratado em contato com um recipiente, com um compartimento e depois aciono o teste apertando esse botão quando faz isso esse líquido entra em contato com esse papel e a água presente nessa amostra tratado difunde por esse papel que carreia antígeno e anticorpo presente no soro desse animal, quando esse reagente que está sendo transportado pelo soluto que difunde pelo suporte encontra região onde a gente tem aquele reagente previamente mobilizado que pode reconhecer ou antígeno ou anticorpo, tem a formação da reação o complexo antígeno anticorpo, o fabricante usou uma técnica que não revelam qual é , de formação de um complexo colorido quando esse complexo é formado nessa região específica,mas que pode ser semelhante a uma técnica de imunoperoxidase ou ELISA acontecendo na superfície do papel e ai vou ter uma chave para interpretação desse resultado.Nesse exemplo aqui esse teste faz o diagnostico de FIV(infecção por vírus de imunodeficiência felina),diagnostico de infecção por FELV(Virus de leucemia felina) e ainda de dilofilaria.O FIV é baseado na detecção de anticorpo contra FIV , o FELV é baseado na detecção de antígeno de FELV e a dilofilaria é baseado numa detecção de antígeno de dilofilaria no sangue do animal.Então no caso para detecção de anticorpo anti FIV tem o antígeno de FIV,no caso da detecção de antígeno de FELV tem o anticorpo anti FELV e sempre tem que ter um controle positivo,vai que não aparece em nenhum ponto dos três,como vou saber se o animal está negativo ou se tive algum problema no tratamento da amostra ou no acionamento do dispositivo,preciso ter uma coisa que dê uma cor que a amostra passou por aqui,isso é o controle positivo.Nem todo animal que tem anticorpo tem FELV,ai dá negativo,pois é memoria imunológica o anticorpo que ele tiver.Os teste para gravidez é baseado na imunocromatografia,a urina vai se difundir e o hormônio vai ser reconhecido como antígeno,é o hormônio característico da gravidez;
Ainda falando de Detecção de antígenos virais,tem : Immunoblots que são técnicas de reconhecimento de antígeno em amostra que podem ser Dot (pontos)/slot blots (fendas),pega a amostra prepara uma suspensão com a amostra,coloca ela sobre uma membrana e depois desse material ... coloca um anticorpo.Outro tipo importante de Immunoblot é o Western blots (WB),a diferença desse para os outros é que coloco a suspensão de amostra diretamente sob a membrana,quero uma suspensão de amostras,eletroforese de proteínas em gel de ... ,então eu separo as proteínas presentes na amostra e depois faz a revelação com o anticorpo e com o conjugado e ai faz uma revelação parecida com o principio da imunoperoxidase. Slide 13:a amostra está aqui colocada sob esses pontos sob esse suporte essa membrana,depois coloca um anticorpo primário contra o vírus que quero detectar e finalmente continua com o secundário que faz parte do conjugado ligado a peroxidase,então ao invés de fazer a imunoperoxidase diretamente sob a amostraquímica,bruta,faz-se uma suspensão dela com a finalidade dependendo do vírus,da suspeita,posso ter mais chances de detectar esse antígeno viral se eu processar a amostra do que se eu pegar a amostra desse tecido e submeter a técnica e vou estar fazendo agora não uma imunoperoxidase porque não está fazendo colocando o anticorpo diretamente sobre a amostra isso se chama dot blot ou se fizer uma Western blots (WB) clássico,faz a eletroforese das proteínas presentes na amostra,transfiro essas proteínas do gel para uma membrana e sob esta faço exatamente as mesmas etapas do dot blots que aparece aqui (slide 14),então se tem uma das bandinhas correspondente a antígeno viral somente ela vai ficar colorida quando revelar a reação.Qualquer suporte da eletroforese tem que ser inerte para permitir que essas moléculas do material possam migrar. Na eletroforese pega a amostra,faz tratamento de modo a separar as proteínas presentes nessa amostra e submeto o conjunto de proteínas a uma diferença de potencial no campo elétrico,então em cada conjunto de linhas que aparece em vertical (tem amostras diferentes,aqui tem proteína de uma amostra,aqui tem de outra,e aqui de outra ),então pega essa sopa de proteínas,estão todas misturadas no laudo do gel,depois que faz a eletroforese ,as proteínas vão migrar de acordo com a quantidade de carga elétrica que elas tem e ai cada proteína vai ter a sua quantidade de cargas e elas vão se separar em virtude da facilidade que elas tem para se deslocar através desse gel de um material inerte que não vai interagir com essas proteínas ,mas vai impedir fisicamente que as proteínas migrem a mesma distancia,ao mesmo tempo,proteínas muito grandes vão migrar pouco ,proteínas menores vao migrar mais porque conseguem passar melhor pelas tramas desse suporte,então isso é a eletroforese,não vejo nada,não vejo qual é a proteína viral ,qual é a proteína do animal que esta migrando aqui ,mas ai faz a transferência dessas proteínas agora separadas nas bandinhas,separadas por peso molecular para superfície da membrana e ai depois faz aquela mesma reação parecida com o slot ou dot bloot,e ai na banda onde tiver o antígeno viral vai ter o conjugado retido ,então agora ... somente aquela banda aonde tem o antígeno viral.isso é um método máximo de otimização da identificação do antígeno viral mesmo que ele esteja muito misturado com antígenos do próprio animal porque pela eletroforese consigo separar .
Slide 16: Exemplo de aplicação do Western blots (WB) num tipo especifico de diagnostico de pesquisa ,está usando o Western blots (WB) para verificar a velocidade que um individuo humano responde aos diferentes antígenos do HIV . Como esse teste foi feito? Cada uma dessas tirinhas é uma membrana aonde estão colocadas proteínas de HIV as maiores e as menores que foram separadas eletroforeticamente, em todas essas fitinhas ,exceto a numero 1 tem essas proteínas separadas eletroforeticamente e a partir dessas fitinhas de 3 até 10 coloca se sobre cada uma delas soro de uma mesma pessoa , Soro positivo para HIV ,só que essas amostras são colhidas no dia 0,dia 2 ,3,4,5 de acordo com essas visitas de acompanhamento medico que o paciente fez,lembrando que ele era soropositivo ou estava suspeito de ser o que se observa é que no dia 0,o soro desse individuo não estava reconhecendo nenhuma das proteínas virais imunizadas presentes nessa membrana,mas no segundo dia já começou a ver detecção dessa bandinha que corresponde a ... a partir do momento que os dias avançam vai tendo anticorpos,progressivamente anticorpos reconhecendo outras proteínas virais ,isso indica que o sistema imune da pessoa não responde ao mesmo tempo com a mesma eficácia para esses diferentes componentes virais ,tem um componente essa proteína P24 que no caso do HIV é uma proteína de capsídeo ,é uma proteína interna da partícula viral,é a primeira contra a qual se consegue detectar anticorpo numa pessoa infectada .Esse tipo de experimento é importante porque foi a partir disso que se estabeleceu que fazer o diagnostico sorológico de triagem de testagem inicial contra HIV é mais eficiente usar a proteína P24 que o HIV inteiro . Por um lado poderia usar a p24 e não a gp120, gp120 (proteína mais exposta,proteína envelope do HIV,mas anticorpo contra gp120 só começa a ser detectado a patir do nono dia ,então isso aumentaria o espaço de tempo que eu detectaria que o individuo como negativo,mas falsamente negativo,ele era positivo e estava assim infectado,dependendo da escolha do antígeno posso detectar isso mais precoce ou mais tardiamente . E essas duas fitinhas o que elas são são controles um controle negativo e um controle positivo . no controle negativo não tenho as proteínas virais coloca-se o soro do paciente para certificar que este não vai reconhecer nada por nenhuma proteína nenhuma molécula presente nessa membrana só vai reconhecer antígenos de HIV nesse teste. então coloco a fitinha que não tem proteína de HIV Já fiz a transferência de proteína separada( imunofloreticamente?) coloquei o soro do paciente depois coloquei todas os reagentes de Revelação e vejo que não ficou nada do soro do paciente grudado aqui, então qualquer Resultado positivo que vejo no teste é devido à presença anticorpo anti HIV no soro desse indivíduo e essa outra fitinha é o controle positivo aqui tem as proteínas do HIV separadas imunofluorescente não coloquei aqui o soro do paciente coloquei o soro padrão contra todas as proteínas do HIV Isso é para mostrar que quando quis ter proteínas de HIV tenho todas elas para validar esse resultado se o soro do paciente não mostra bandas como essas quando não há nenhuma proteína não é porque tenho algum problema com a proteína do HIV presente na membrana Mas por que o soro do paciente Não tenho anticorpo nenhum. aqui ó tenho o soro padrão do laboratório contra HIV como todo e ele e ele está indicando nessa fitinha realmente estão as proteínas do HIV por isso é o controle positivo. no dia 3 dia 5 é alguma proteína pode ver que não tem muita especificidade foi reconhecida como alguma proteína que fazia parte do material que conte HIV tinha algum contaminante que não era HIV e que era reconhecida por anticorpo presente no soro do paciente, produzir esse HIV numa cultura de células e quando fiz a lavagem do HIV preparando para fazer algum contaminante alguma coisa na célula que eventualmente foi reconhecido por reação cruzada por algum anticorpo presente no soro do paciente pode ser um anticorpo que varia muito no corpo desse indivíduo um anticorpo natural que é um anticorpo que a gente tem circulando naturalmente no organismo por causa dos diferentes tipos imunogênicos que o sistema imune recebe do ambiente Isso vai ser bastante variável dependendo do momento de cada indivíduo e eventualmente esses anticorpos reagem exatamente com alguns antígenos ,não é o caso aqui, Mas é uma coisa que reconhecida por algum anticorpo desse indivíduo. no último slide tenho Elisa indireto para detectar anticorpo, tem imobilizado o antígeno, se tem anticorpo no material do soro do animal esse anticorpo está retido, o conjugado detecta o anticorpo da espécie lógico feito pela detecção do anticorpo do indivíduo.