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Biologia MolecularBiologia MolecularBiologia MolecularBiologia Molecular ResumoResumoResumoResumo –––– 1ª prova1ª prova1ª prova1ª prova Composição e Estrutura dos Ácidos NucléicosComposição e Estrutura dos Ácidos NucléicosComposição e Estrutura dos Ácidos NucléicosComposição e Estrutura dos Ácidos Nucléicos - Tanto o Ácido Desoxirribonucléico (DNA) quanto o Ácido Ribonucléico (RNA) são moléculas poliméricas, cuja unidade fundamental é o nucleotídeo. - O nucleotídeo é formado por uma pentose, uma base nitrogenada e um fosfato inorgânico. - A pentose pode ser a ribose ou a 2-desoxirribose, de forma que apenas a presença ou ausência da hidroxila do carbono 2’ diferencia DNA e RNA. - As bases nitrogenadas podem ser purinas, que contêm dois anéis, ou pirimidinas, que tem apenas um anel. Entre si, elas têm pequenas diferenças estruturais que lhes conferem propriedades, afinidades e reações diferentes. - São purinas a adenina (A) e a guanina (G), enquanto citosina (C), timina (T) e uracila (U) são pirimidinas. - Devido ao número de ligações de hidrogênio, as bases nitrogenadas pareiam-se como A-T (duas ligações de hidrogênio) e C-G (três ligações de hidrogênio), no caso de DNA, e também A-U (também duas ligações) no caso de RNA. - Para a formação da fita de ácido nucléico, primeiramente ocorre a ligação da base nitrogenada ao carbono 1’ da pentose, formando um nucleosídeo. - Depois, um fosfato inorgânico se liga ao carbono 5’ do resíduo de pentose já ligado ao resíduo de base nitrogenada, originando um nucleotídeo. - Os nucleotídeos podem ter a forma monofosfato, bifosfato ou trifosfato, dependendo do fosfato inorgânico que o forma. Apenas o nucleotídeo monofosfato compõe o ácido nucléico, mas é necessário que o trifosfato seja ligado e depois clivado para fornecer a energia para a incorporação do nucleotídeo à molécula. - Para formar uma cadeia de ácido nucléico, o fosfato 5’ de um nucleotídeo se liga ao carbono 3’ de outro nucleotídeo, formando a ligação nucleotídica. Adicionando-se nucleotídeos, forma-se a fita de DNA ou RNA. - Dessa forma, observa-se que o sentido de crescimento (síntese) do ácido nucléico é sempre 5’ → 3’. - A molécula de DNA é formada por duas fitas de nucleotídeos antiparalelas e complementares, isto é, enquanto uma fita tem sentido 5’ → 3’, a outra tem sentido 3’ → 5’. Ainda, as bases nitrogenadas complementares de cada fita ligam-se por ligações de hidrogênio, mantendo-as unidas. Modelo de WatsonModelo de WatsonModelo de WatsonModelo de Watson----CrickCrickCrickCrick - As sequências de nucleotídeos antiparalelas e complementares, que formam uma molécula de DNA, é chamada estrutura primária. - A conformação em α-hélice (torção para a direita de ambas as fitas), mantida pelas ligações de hidrogênio, é a estrutura secundária. - O dobramento espacial, auxiliado por proteínas histonas e não-histonas, é a estrutura terciária. Cromossomos e OrganizaçCromossomos e OrganizaçCromossomos e OrganizaçCromossomos e Organizaçãããão do Genomao do Genomao do Genomao do Genoma - O dobramento espacial, com proteínas associadas ao DNA, origina a cromatina. - Para a divisão, quando a cromatina precisa estar muito condensada, originam-se os cromossomos, sendo que cada um deles contém 1 molécula de DNA mais as proteínas. - A estrutura primária do RNA é semelhante ao do DNA, porém com apenas uma fita de nucleotídeos. As outras são um pouco diferentes: . Secundária: loop ou hairpin . Terciária: dobramento espacial (sem histonas, bases da mesma cadeia ligam-se entre si para aumentar a estabilidade) . Quaternária: rRNA (subunidades que formam o ribossomo) Replicação do DNAReplicação do DNAReplicação do DNAReplicação do DNA - Caracteriza-se como um processo semiconservativo, isto é, uma das fitas se mantém na nova molécula, uma vez que serve de molde para a nova sequência. - A nova fita sintetizada será complementar à fita molde e igual à outra, chamada codificadora. - Toda a molécula é duplicada, diferente do processo de transcrição que envolve apenas poucas sequências. - Inicia-se na origem de replicação, um sequência de nucleotídeos onde se ligam proteínas de iniciação. - Nas proteínas de iniciação liga-se a DNA helicase, enzima responsável por abrir a dupla-hélice e separar as fitas do DNA, catalisando uma bolha de desnaturação temporária que permite o acesso às fitas separadamente. - O ponto que divide a região desnaturada e a não-desnaturada do DNA, onde se encontra a helicase, é chamado forquilha de replicação. - Nessa bolha de replicação, a enzima DNA primase se liga ao DNA e catalisa a síntese de uma pequena sequência de ribonucleotídeos, o primer de RNA. - A partir da sequência primer, a enzima DNA polimerase III adiciona os nucleotídeos complementares à fita molde, lendo a fita molde no sentido 3’ → 5’ e catalisando as ligações nucleotídicas no sentido 5’ → 3’ (antiparalelismo). - Uma das fitas será lida no mesmo sentido em que a helicase se desloca, precisando de apenas um primer logo no início da replicação. - A outra fita, no entanto, sendo antiparalela, será lida no sentido contrário à abertura da dupla-hélice, de maneira que a síntese será iniciada próxima à helicase, em direção à origem da desnaturação, e depois reiniciada tão logo a helicase avance. Isso gera várias sequências descontínuas de DNA recém- sintetizado, e torna necessários vários primers para a replicação dessa fita. - Uma vez que os primers do filamento descontínuo tenham sido alongados pela DNA polimerase III, eles são removidos pela exonuclease e substituídos por sequências de DNA funcionais pela DNA polimerase I (também no sentido 5’ → 3’). - No término desse intervalo deixado pela retirada do primer, a polimerase não consegue ligar a extremidade 3’ na próxima 5’ já existente, o que é feito então pela DNA ligase. Mecanismo Molecular de Mutações do DNAMecanismo Molecular de Mutações do DNAMecanismo Molecular de Mutações do DNAMecanismo Molecular de Mutações do DNA - Mutações são alterações herdáveis na sequência de nucleotídeos, isto é, na estrutura primária do DNA. - Podem ocorrer em qualquer tipo de DNA, qual seja o organismo ou o tipo celular de origem. - Podem ser espontâneas, causadas por fatores naturais e orgânicos, ou induzidas, causadas por fatores externos. - Não só as mutações em genes são importantes, visto que as sequências não codificantes, como regiões promotoras, operadoras e outras, também afetam a expressão do gene. - Mutações espontâneas podem ser, por exemplo, causadas por erros de replicação. Quando radicais livres (produtos metabólicos) reagem com bases nitrogenadas, originam-se formas tautoméricas de purinas ou pirimidinas. - Da mesma forma, radicais livres podem ocasionar lesões espontâneas do tipo despurinação, originando sítio abásico. Isso pode resultar a deleção do nucleotídeo ou a adição de outra base, com consequente mutação. - Ainda, há a lesão espontânea causada por oxidação e a ligação de algum composto à base nitrogenada (alquilação), que alteram as propriedades do nucleotídeo. - Isso causa a formação de ligações de hidrogênio erradas entre o nucleotídeo modificado e aquele adicionado na nova fita durante a replicação. - O mismatch pode ter como consequência a substituição do par de nucleotídeos original por outro, caso o pareamento errado seja corrigido antes da replicação. Se não, o erro pode ser percebido depois da replicação e corrigido sem substituição. - A intercalação de compostos aromáticos na fita dupla gera estruturas que a DNA polimerase não reconhece, resultando na deleção de nucleotídeos ou distorção da dupla-hélice e quebra da simples-fita. - Radiações não ionizantescomo a luz ultravioleta (UV) modificam elétrons e podem gerar novas ligações químicas. O principal efeito desse fenômeno é a formação de dímeros de pirimidinas adjacentes, isto é, a ligação entre pirimidinas (citosina ou timina) de uma mesma fita. - Já radiações ionizantes podem causar quebra de fita, deleção de nucleotídeos e ligação cruzada. Reparo do DNAReparo do DNAReparo do DNAReparo do DNA - Para o reparo, é necessário que haja a fita dupla, uma vez que é feito a partir de uma fita molde. - As correções são feitas com eficiência antes da replicação, mas podem ocorrer em qualquer fase do ciclo celular. Há proteínas que identificam o erro e estimulam mediadores para pausar o ciclo o máximo possível e permitir o reparo antes da próxima fase. - O reparo pode ser feito pela degradação do segmento errado e seguinte re-síntese, como no reparo do mau-pareamento de bases (mismatch), no reparo por excisão de bases (BER) ou de nucleotídeos (NER). - Também há o reparo direto, que desfaz dímeros de pirimidinas, e o reparo por recombinação, em caso de quebra da dupla-fita. - O mismatch repair se inicia com o reconhecimento do pareamento errado durante a replicação e de qual fita contém o erro, uma vez que o filamento-filho é que deve ser corrigido para que se mantenha a sequência original. - Um complexo protéico então se liga à região identificada e faz a excisão do segmento que contém o erro. Há a ação da helicase para abrir tal segmento da dupla-fita e permitir sua retirada. - As enzimas DNA polimerase e ligase fazem a re-síntese e re-ligação dos nucleotídeos adequados, com base na fita original. - Os reparos por excisão de bases e de nucleotídeos seguem os mesmos passos genéricos, porém são utilizados em situações variadas. - O BER é feito para a correção de pequenos erros, como oxidação, existência de sítio abásico, alquilação, metilação e outros. - Ocorre a clivagem da ligação entre a base alterada e a pentose, deixando um sítio apurínico ou apirimidínico. Uma endonuclease então retira esse fragmento, e as enzimas de síntese adicionam os nucleotídeos corretos. - O NER é um mecanismo aplicado para a correção de grandes distorções da dupla-hélice, como dímeros de pirimidina e quebras em fitas- simples. - Nesse caso é feita a remoção do bloco de nucleotídeos que contém a lesão, deixando um espaço posteriormente re-sintetizado. - O reparo direto ocorre, por exemplo, para reversão de dímeros de pirimidinas, mas não ocorre em animais. A enzima fotorreativadora DNA fotoliase absorve luz azul e transfere energia para a clivagem do anel formado na dimerização. Não há remoção do segmento, apenas é desfeita a ligação entre as pirimidinas. - O reparo por recombinação pode ocorrer em função da quebra da dupla- fita, pela ligação das extremidades não homólogas. A DNA ligase faz a junção das extremidades, removendo alguns nucleotídeos errados se necessário, Pode ocorrer perda de informação devido a este processo. - O reparo por recombinação homóloga é mais eficiente, e ocorre quando há erro na replicação de um segmento do DNA. Quando alguns nucleotídeos são alterados, a polimerase não os reconhece e salta um espaço na replicação, deixando a fita sintetizada incompleta. - O segmento ausente é reconhecido e identificado no cromossomo homólogo, no qual está íntegro. Ele é então removido da fita parental íntegra e adicionado na fita recém-sintetizada incompleta, fechando o espaço e reparando o erro. Na fita parental do qual foi retirado, ele é re-sintetizado com base na sua fita complementar, visto que se encontra ainda na replicação. Transcrição e Processamento do RNATranscrição e Processamento do RNATranscrição e Processamento do RNATranscrição e Processamento do RNA - Em organismos procariotos, o produto da transcrição já é uma molécula funcional (mRNA) e pode ser diretamente traduzida para a síntese de uma proteína, até antes mesmo da transcrição ser finalizada, visto que ambos os processos ocorrem no citoplasma. - Já em eucariotos, a transcrição origina uma molécula chamada transcrito primário, a qual precisa passar por um processamento ainda no núcleo antes de ser utilizada como mRNA para a tradução no citoplasma. - A estrutura dos RNAs produzidos é própria às suas funções. - O mRNA é sempre linear para facilitar a leitura pelo ribossomo, enquanto o rRNA é organizado para formar as subunidades ribossomais. O tRNA, por sua vez, forma pontes de hidrogênio entre pequenas sequências complementares em si mesmo, originando alças nos pontos em que não há complementaridade para expor os sítios necessários à tradução. - Os processos de transcrição e replicação são semelhantes apenas devido à adição de nucleotídeos que ocorre em ambos. - No entanto, diferenciam-se quando aos nucleotídeos adicionados: na transcrição, para a formação do mRNA, são utilizados ribonucleotídeos. - A RNA polimerase, diferente da DNA polimerase, não necessita de primer. Assim, não há a ação da enzima primase. - Ao contrário da replicação, em que a fita sintetizada permanece ligada à sua fita molde, na transcrição o RNA produzido não pode manter essa ligação. - A replicação é um processo mais preciso, visto que conta com vários sistemas de reparo. Já a replicação é sujeita a mais erros não corrigidos. - A transcrição em procariotos conta com apenas uma enzima de síntese (RNA polimerase I), composta pelo cerne - duas cadeias α, uma cadeia β e uma β’ – e o fator σ – que reconhece a região promotora. - Já em eucariotos, a transcrição envolve RNA polimerase I (para síntese de rRNA), RNA polimerase II (para a síntese do transcrito primário e de snRNA), RNA polimerase III (síntese do tRNA e também do rRNA), e ainda RNA polimerase de mitocôndria e cloroplasto. - Na iniciação da transcrição em procariotos, há o reconhecimento do molde de DNA pela RNA polimerase I e a ligação à sequência promotora. Nessa sequência encontram-se a região -10, conhecida como TATA box, e a região -35, cuja especificidade é controlada por fatores sigma presentes nas enzimas RNA pol I. - O alongamento consiste na adição de ribonucleotídeos complementares ao DNA molde pela RNA pol, podendo haver pausas ou mudança de velocidade na transcrição em função da disponibilidade de recursos. - O término de tal processo em procariotos pode ser independente ou dependente de fator protéico. . Independente: ocorre a ligação por pontes de hidrogênio de sequências complementares invertidas na molécula recém-sintetizada, gerando um grampo/alça de terminação ou hairpin. Associada a uma sequência final de ligações fracas (cauda poli-A), o hairpin causa desligamento do RNA com o DNA molde. . Dependente: um sítio rut é transcrito, ao qual se liga a proteína Rho. Ela se desloca ao longo do RNA e termina a transcrição ao alcançar o hairpin também formado. - Já para a transcrição em eucariotos, há a necessidade de vários fatores de iniciação para permitir a ligação da RNA pol II, como o complexo TFIID. Ele conta com a proteína TFIID e com a TBP (TATA binding protein), que reconhece sequências reguladoras à montante como a TATA box. - Para o alongamento, forma-se a bolha de transcrição onde a RNA pol está, permitindo a adição de nucleotídeos. Enzimas DNA topoisomerases podem ser requisitadas para evitar a superhelicoidização dos segmentos adjacentes à bolha de transcrição e facilitar a abertura pela helicase. - O término se dá com a transcrição do sinal poli-A, um marcador para clivagem por uma enzima endonuclease, terminando a transcrição. - O produto da transcrição em eucariotos é chamado transcrito primário ou hnRNA, e não é diretamente funcional por ser composto tanto de íntrons como éxons. Por isso, passa por um processamento ainda no núcleo.- A primeira porção sintetizada do hnRNA recebe a adição do CAP-5’, para protegê-lo de endonucleases e para reconhecimento pela maquinaria de tradução. - Após a síntese do sinal de poli-A e seguinte clivagem, há a adição da cauda poli-A, com os mesmo objetivos do CAP-5’. - Por último, ocorre o splicing, processo pelo qual são retirados os íntrons e reunidos os éxons. . Sinais de splicing sinalizam splice junctions (GU identifica o início de um íntron, ou sítio de processamento 5’, e AG sinaliza o término de um íntron, ou sítio de processamento 3’). . O spliceossomo inativo, formado de snRNP, reconhece as splice junctions e aproxima as extremidades dos éxons adjacentes, e tornando-se ativo. . Forma-se uma alça com o íntron entre tais éxons, a qual será clivada e liberada, e posteriormente degradada. . Unidas as extremidades dos éxons, origina-se o mRNA funcional. - Podem ocorrer erros de splicing, geralmente relacionados a mutações que alterem o processo de transcrição/processamento, por exemplo ao pular um éxon, considerando-o um íntron (como na β-talassemia). - Também pode ocorrer splicing alternativo, que alterna a utilização de sequências como íntrons ou éxons de acordo com a necessidade celular (como na produção de α-tropomiosinas diferentes em diversos tipos musculares). - Para a produção do tRNA, ocorre também um processamento, com algumas etapas: . Retirada de porções das extremidades 5’ e 3’. . Retirada de uma porção interna, religando as extremidades deixadas e expondo anticódons. . Adição de bases na extremidade 3’. . Modificação de algumas bases em sua estrutura para originar o tRNA maduro. - Igualmente, o rRNA também passa por processamento para originar as subunidades ribossomais. O gene para rRNAs contém as unidades 18S, 5.8S e 28S, como também as regiões espaçadoras ETS (externa) e ITS1 e ITS2 (internas). . Ocorre a metilação das regiões funcionais no transcrito pré- rRNA, permitindo a clivagem dos espaçadores e a reunião das sequências funcionais. Regulação da Expressão Gênica em ProcariotosRegulação da Expressão Gênica em ProcariotosRegulação da Expressão Gênica em ProcariotosRegulação da Expressão Gênica em Procariotos - Genes expressos constantemente em todas as células do organismo são chamados constitutivos, enquanto aqueles cuja expressão varia segundo as necessidades da célula são genes de expressão regulada ou induzida. - Em organismos procariotos, a regulação da expressão gênica é transcricional, isto é, afeta diretamente a produção da proteína. - Ela pode ser feita por proteínas regulatórias, que se ligam ao sítio operador do gene e promovem regulação positiva ou negativa. . Regulação positiva: a proteína é necessária para que ocorra a transcrição, sendo chamada ativador (sem ela, não ocorre síntese protéica). . Regulação negativa: a presença da proteína inibe a transcrição do gene, sendo chamada repressor (só ocorre síntese em sua ausência). - Em procariotos, a unidade de expressão gênica é chamada operon e inclui: . Regiões promotora e operadora; . Regiões codificadoras; . Terminador. - O operon da lactose em bactérias é chamado operon Lac, e conta com as regiões codificadoras Lac Z, Lac Y e Lac A, que codificam, respectivamente, as enzimas β-galactosidase, permease e transacetilase. - Quando a bactéria tem necessidade de metabolizar a lactose, a presença desse mesmo composto irá atuar como indutor. - A lactose modifica a estrutura do repressor do operon Lac, impedindo sua ligação com o operador e permitindo a transcrição das enzimas necessárias à metabolização da lactose. - Algumas mutações no operon Lac podem afetar a transcrição das enzimas. - Quando há mutação no operador (mutação Oc), não há ligação do repressor com o operador, havendo transcrição mesmo sem o indutor (lactose). O controle negativo é prejudicado, havendo síntese desnecessária de enzimas. - Com a mutação do tipo I-, no repressor, não há síntese dessa molécula, o que acarreta também na síntese mesmo sem o indutor, de maneira desnecessária. - Já a mutação Is, também no repressor, essa molécula é sintetizada com sua forma modificada, conseguindo se ligar ao operador, mas não ao indutor. Isso também retira sua funcionalidade, impedindo a transcrição mesmo com a presença do indutor. Mesmo quando a síntese é necessária, ela não é feita. - Ainda, a alta concentração de glicose pode impedir a síntese de enzimas para a lactose, caracterizando repressão catabólica. - A glicose inativa a enzima adenilato ciclase, impedindo a produção de cAMP, o qual iria se ligar à CAP (proteína ativadora do catabolismo) e acelerar a transcrição do operon Lac. . Sem glicose, haveria cAMP e uma consequente elevada taxa de transcrição do operon Lac. . Com glicose, não há cAMP, dependendo apenas da presença de lactose para a trascrição do operon Lac. - O operon do triptofano (operon Trp) se constitui, além do promotor e operador, de uma sequência líder que contém atenuador e cinco genes para enzimas da cadeia de síntese do triptofano (E, D, C, B e A). - Na ausência do triptofano, o repressor não se liga ao operador e há transcrição e consequente síntese de triptofano. - Analogamente, na presença de triptofano, ele se liga ao repressor e o ativa, impedindo a transcrição. - Há também a regulação por atenuação, na qual quatro regiões da sequência líder, transcritas e concomitantemente traduzidas, têm possibilidades de formação de alças com propriedades diferentes. . A região 1 possui dois códons para triptofano. . Uma alça entre as regiões 3 e 4 tem a conformação semelhante a um hairpin, então gera terminação. . Uma alça entre as regiões 2 e 3, portanto, é anti-terminação, por impedir a formação da alça entre 3 e 4. - Quando há baixa concentração de triptofano, a tradução é pausada na região 1 devido à falta de recursos para a síntese. Isso possibilita a formação de alça entre as regiões 2 e 3, permitindo a tradução do operon Trp e consequente síntese de tal composto necessário. - Quando há alta concentração de triptofano, não há pausa na região 1, chegando rapidamente à região 2 e propiciando a formação de alça entre 3 e 4. Esse hairpin desliga a RNA polimerase da molécula e impede a síntese desnecessária do triptofano. Regulação da Expressão Gênica em Regulação da Expressão Gênica em Regulação da Expressão Gênica em Regulação da Expressão Gênica em EuEuEuEucariotoscariotoscariotoscariotos - Os níveis de regulação em eucariotos são transcricional, traducional e pós-traducional. - Existem alguns elementos controladores da transcrição (ou fatores de transcrição – TFs), que podem ser ativadores, repressores, coativadores (integram sinais de ativadores) e fatores de transcrição basais (ligam RNA polimerase à TBP). - Um mecanismo de regulação transcricional é a remodelagem da cromatina. A acetilação ou desacetilação de nucleossomos pode descondensá- la ou condensá-la, respectivamente, impedindo ou promovendo a reação de reguladores devido à modificação de afinidade bioquímica. - O imprinting genômico também se caracteriza como regulação transcricional, uma vez que, a partir da metilação da região promotora de alguns genes, eles são silenciados e inativados. Assim, são expressos apenas na outra cópia não-imprintada do cromossomo. - Dentre os mecanismos de regulação traducional, destaca-se o splicing alternativo. Ele permite a expressão de proteínas ligeiramente diferentes a partir de um mesmo gene, uma vez que utiliza diferentes éxons em função da necessidade da célula em que o gene se encontra. - Também ocorre a edição do mRNA, pela qual modifica-se ou adiciona- se um códon em tipos celulares diferentes, também de acordocom as necessidades do tecido. As proteínas expressas assim variam. - É possível também a produção de microRNAs, que possuem pequenas sequências complementares a outros genes. Eles então se ligam a genes que não devem ser transcritos no momento, silenciando-os. - Há ainda os RNAs de interferência (RNAi), que se ligam a mRNAs e produzem sítios de clivagem, fazendo com que sejam quebrados e não traduzidos. - Os mecanismos de regulação pós-traducional incluem a proteólise, fosforilação, dimerização, acetilação, entre outros, uma vez que a adição ou retirada de grupos pode ser necessária à ativação de uma proteína ou pode inativá-la.
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