Técnicas de estudo em Patologia

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TÉCNICAS DE ESTUDO 
EM PATOLOGIA
Augusto Schneider
Carlos Castilho de Barros
Faculdade de Nutrição
Universidade Federal de Pelotas
TÉCNICAS
• Citologia
• Histologia
• Imunohistoquímica
• Citometria
• Biologia molecular
EXAMES CITOLÓGICOS
Analiza células individualizadas/livres
Origem:
Liquídos orgânicos
Urina, liquor, liquido ascítico
Punções aspirativas
Pulmão, mama, linfonodos, sangue
Secreções
Escarro, abcessos
Lavados cavitários
Lavado brônquico
Raspados
Cervicovaginal
EXAMES CITOLÓGICOS
Células devem ser fixadas e coradas
Fixador mais comum é o álcool 95%
Corante hematoxilina eosina
Detecção de células neoplásicas, parasitas e bactérias
Origem das amostras:
Punções aspirativas ou raspados
EXAMES CITOLÓGICOS
Exemplo:
Exame Papanicolau
Células do canal endocervical
Detecção de cancer do colo do útero
Detecta células anormais que podem desenvolver cancer
EXAMES CITOLÓGICOS
Células normais
Alteração = aumento/duplicação do núcleo
Pessoa treinada – interpretação dos resultados
EXAMES CITOLÓGICOS
Esfregaço de células sanguíneas
Contagem de 200 células e classificação morfológica
EXAMES CITOLÓGICOS
Anemia
BIÓPSIAS
Podem ser para diagnóstico ou tratamento
- Ablativa ou excicional
Remoção de toda a lesão para tratamento
- Incisional
Retira parte da lesão para diagnóstico
Importante:
Amostragem deve ser representativa de toda lesão/tecido
Não só superficial
Pode ser com auxílio de ultrassom para atingir ponto desejado
BIÓPSIAS
Biópsia em caso de suspeita de câncer pulmonar
guiada por tomografia computatorizada
BIÓPSIAS
Amostras acondicionadas em um fixador
Formaldeído a 4%
Previne autólise e mantem estrutura celular
Volume de 6 a 10 vezes maior que a amostra
Amostras devem ser acompanhadas de informações do 
paciente e de outras observações clínicas
Evitar diagnóstico errôneo
BIÓPSIAS
No laboratório as amostras são parafinizadas, cortadas e amostras 
significativas do tecido coletado são coradas e analizadas
Tecidos corados com corantes simples podem ser analizados em 
microscópio de luz
ANÁLISE HISTOLÓGICA
Infiltração de gordura hepática
Hematoxilina/eosina
ANÁLISE HISTOLÓGICA
Mycobacterium tuberculosis
Hematoxilina/eosina + Ziehl Neelsen
IMUNO-HISTOQUÍMICA
Método que associa anticorpos com reagentes 
específicos para localizar estruturas em células
O produto é analizado em microscópio em corte 
histológico
Anticorpos ligados a marcadores fluorescentes
Resultado qualitativo – Presença/ausência de 
determinado marcador
IMUNO-HISTOQUÍMICA
Imunofluorescência direta e indireta
Maior especificidade
Produzido em rato
Produzido em coelho
BIÓPSIAS
Tecidos corados com anticorpos fluorescentes podem 
ser analizados em microscópio de fluorescência
IMUNO-HISTOQUÍMICA
Aplicações
Muito importante em certo tipo de neoplasias
Classificação precisa depende da identificação de proteínas 
específicas expressas pelo tipo celular
Podem ajudar na identificação da sede primária do tumor
Identificação de micrometástases em linfonodos sentinelas
IMUNO-HISTOQUÍMICA
Aplicações
Diagnóstico de neoplasias
IMUNO-HISTOQUÍMICA
Aplicações
Diagnóstico de metástase em linfonodos
Anticorpo anticitoqueratina
IMUNO-HISTOQUÍMICA
Aplicações
Diagnóstico de neoplasias
Proteína Ki67 – comum em neoplasias de mama
Muito presente nas células que estão se dividindo
< 10% - normal
10 – 20% - intermediário
> 20% - alto
IMUNO-HISTOQUÍMICA
Proliferação alta
Proliferação baixa
Neoplasia de mama
IMUNO-HISTOQUÍMICA
Aplicações
Diagnóstico de neoplasias
Presença de receptores para Estrogenio e Progesterona
Recomendação: Uso de tratamentos que reduzem os níveis hormonais e 
reduzem taxa de crescimento da neoplasia
IMUNO-HISTOQUÍMICA
Neoplasia de mama positiva para ER
CITOMETRIA
Determinação quantitativa de componentes celulares
Ligação de substância específica a um componente 
celular e posterior reconhecimento seletivo
●Citometria estática (citofotometria)
●Citometria de fluxo
CITOMETRIA
Citometria de fluxo
Células em suspensão tratadas com um fluorocromo
Células passam por um canal e intensidade de cada fluorocromo é 
mensurada
Identificação de constituintes normais: Neutrófilos, macrófagos, etc
Identicação de células cancerosas de variados tipos
Marcadores na superfície de linfócitos para diagnóstico de leucemia
CITOMETRIA
Citometria de fluxo
Princípio da técnicaHIV
Declinio	
  CD4
TÉCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR
Técnicas de manipulação de DNA e RNA 
Estão cada vez mais comuns e com menor custo
Muitas vezes associadas a diagnósticos mais precisos e precoces
TÉCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR
Hibridação molecular
Característica da estrutura do DNA – bases são complementares
TÉCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR
Hibridação molecular
Sondas de DNA
São como os anticorpos porém para sequências específicas de DNA
Sondas são acopladas a compostos fluorescentes ou radioativos
Qualquer tipo de amostra pode ser submetido a esta técnica
TÉCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR
Alterações cromossômicas são comuns em diversas neoplasias
Translocações
Genes mudam de posição ou de cromossomo
Amplificações
Genes ou regiões gênicas são duplicadas
Deleções
Genes são deletados e não são mais detectados
ALTERAÇÕES NÍVEL CROMOSSÔMICO
Deleção
Duplicação
Inversão
ALTERAÇÕES NÍVEL CROMOSSÔMICO
Translocação
TÉCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR
FISH – hibridização fluorescente in situ
“Coloração de cromossomos”
TÉCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR
Sonda para sequência do cromossomo 3 - Leucemia
TÉCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR
Deleção do gene PTEN em cancer de prostata
REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE
Reação em cadeia da polimerase:
Funciona como uma replicação in vitro
São adicionados todos os ingredientes para 
o funcionamento da DNA polimerase
1.Água
2.MgCl2
3.Tampão
4.dNTPs (A, T, C, G)
5.Taq DNA Polimerase
6.Primers
7.DNA
Termociclador: controle da temperatura
REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE
REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE
REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE
REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE
Presença de DNA de vírus, bactéria
Diagnóstico HIV – sensibilidade e especificidade > 99%
Genotipagem para mutação no p53:
AUTOPSIA OU NECROPSIA
Exame post-mortem de órgãos para se determinar a 
causa da morte e conhecer as lesões existentes
De interesse cientifico para correlacionar a causa da 
morte com achados clínicos e melhorar o diagnóstico 
em vida
Ainda há uma discordância entre os diagnósticos 
clínicos e de autópsia