Aulas práticas Odonto 2018

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CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E BIOTECNOLOGIA
Roteiro de Aulas Práticas
Curso: 6MOD065 ODONTOLOGIA
Disciplina: Bioquímica
Profa. Dra. Josemeyre Bonifácio da Silva
 
 
 
 
LONDRINA
2018
AULA 1. SALIVA: DEMONSTRAÇÃO DA CAPACIDADE TAMPONANTE E DOSAGEM DO TAMPÃO FOSFATO
Capacidade Tamponante da Saliva
Fundamento teórico: A saliva é um fluido viscoso e contém cerca de 99% de água e 1% de sólidos orgânicos e inorgânicos. Embora o NaCl seja o componente inorgânico mais abundante da saliva, é o bicarbonato (HCO-3) que possui propriedade tamponante. Outro tampão inorgânico é o fosfato. O principal sólido orgânico da saliva é a uréia, porém outras biomoléculas é que funcionam como tampões: mucina, amilase, lisozima, imunoglobulinas (IgA, IgG e IgM), lípase e urease. Na saliva, do total das substâncias inorgânicas, os ânions constituem aproximadamente 150 mg%. Destes, aproximadamente a metade são cloretos e em seguida, estão os fosfatos (em redor de 40 mg%). Na saliva, os fosfatos constituem o tampão fosfato:
H2PO-4 // HPO4-2, cujo pK de 6,86 é bem próximo do pH da saliva (6,9 – 7,0)
Mecanismo de ação: Sob condições de excesso de H+ ou OH-, o tampão fosfato age da seguinte maneira:
Excesso de acidez: H+ + HPO2-4 H2PO-4
Excesso de alcalinidade: OH- + H2PO-4 HPO2-4 + H2O
Técnica:
a) Pool da saliva: 
Coletar, aproximadamente, 6 mL de saliva da equipe em um becker de 100 mL de capacidade; 
Transferir 0,5 mL de saliva para o tubo 3 da tabela 1 (dosagem do tampão fosfato);
Diluir o restante da saliva em um volume total de 50 mL;
Colocar a barra magnética e homogeneizar;
Acrescentar gotas do indicador alaranjado de metila e continuar a homogeneização.
b) Titulação:
Proceder a titulação adicionando 0,2 mL de ácido lático e anotar o pH na tabela 1.
Completar a tabela 1, repetindo a adição de alíquotas de ácido lático e medindo o pH até atingir o ponto de viragem, isto é, até a cor mudar de alaranjada para vermelho.
Tabela 1 - Titulação
	Ácido lático
	pH
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
 
Dados adicionais: 
Efeito do ácido lático na água 
pH da água destilada: ____________
pH da água destilada adicionada de 0,2 mL de ácido lático: _________
Grafar os valores obtidos em papel milimetrado.
Atenção: Usar escala única para fazer os 02 gráficos.
Dosagem do tampão fosfato
Fundamento teórico: O uso do ácido do TCA (ácido tricloroacético) é para precipitar as proteínas presentes na amostra de saliva, pois as mesmas interferem na reação posterior. As proteínas desnaturadas são precipitadas por centrifugação para obter o sobrenadante límpido. O método de dosagem de fosfato foi desenvolvido por Fiske e Subbarow, no qual o fosfato é transformado em ácido fosfomolíbdico e posteriormente é reduzido pelo aminonaftolsulfônico em um produto de cor azul. A intensidade da coloração azul é proporcional à concentração de fosfato.
Para fazer a dosagem do tampão fosfato da saliva, proceder as pipetagens conforme a tabela 2 – Dosagem.
Tabela 2 – Dosagem
	Tubo
	
	1
	Branco
	Água destilada
	- 0,5mL
	2
	Padrão
	[20mg%]
	- 0,5mL
	3
	Saliva
	
	- 0,5mL
Adicionar em cada tubo 4,5mL de TCA 5%.
Agitar vigorosamente e na presença de precipitado (tubo 3), descansar o tubo por 10 minutos.
Em seguida, centrifugar durante 5 minutos.
Após centrifugação, transferir o sobrenadante para outro tubo.
Em todos os tubos, adicionar 0,5mL de molibdato de amônio.
Adicionar 2 gotas do agente redutor de fósforo.
Acrescentar 5,0 mL de água destilada.
Medir a absorvância no comprimento de onda () de 660nm. Usar o tubo 1 (Branco) para zerar o aparelho.
Calcular a concentração de tampão fosfato na saliva fazendo a comparação de absorvância e concentração com o tubo padrão. 
AULA 2: DENTE – COMPOSIÇÃO QUÍMICA
Fundamento teórico: As partes constituintes do dente são: esmalte, dentina (marfim), polpa e cemento. O esmalte constitui uma camada externa de 2mm constituída da porção mineral de hidroxiapatita [Ca5(PO4)3(OH)] que corresponde a 96% e os 4% restantes de proteínas e água. A dentina é a massa principal do dente, dá forma geral ao mesmo. É duro como osso, porém permeável devido aos microtúbulos. É uma extensão fisiológica da polpa. Aproximadamente 35% da dentina é material orgânico composto de colágeno mais substância orgânica fundamental de mucopolissacarídeos (proteoglicanos e glicosaminoglicanos). Os demais 65% são inorgânicos – hidroxiapatita. A polpa é um tecido vivo formado por uma porção celular e porção extracelular (estroma). O estroma é formado principalmente por colágeno. 
Técnica:
Utilizar um dente, praticamente são, recém-extraído. Remover dele todo tecido aderente, assim como qualquer depósito de tártaro. Lavá-lo bem com água corrente e depois com água destilada, enxugá-lo e realizar as provas abaixo:
Provas Químicas: 
Carbonatos
Colocar o dente em um frasco de Erlenmeyer contendo 10mL de solução de ácido clorídrico 4%. Notar, após alguns minutos, a formação e o desprendimento de bolhas gasosas. O ácido decompõe os carbonatos, especialmente CaCO3 liberando o CO2.
Deixar o dente em contato com o ácido clorídrico 4% durante 48 horas, quando a parte mineral terá sido dissolvida, permanecendo como resíduo a matriz protéica mole do dente.
Separar por decantação o líquido sobrenadante (líquido ácido), que contém os componentes minerais do dente, em um tubo de ensaio.
Lavar o arcabouço (estroma) dentário residual no Erlenmeyer, duas vezes com 10mL de solução 0,1M de carbonato de sódio e uma vez com 10mL de água destilada. Desprezar os três líquidos de lavagem.
Realizar no líquido ácido e no arcabouço (estroma) dentário as provas a seguir:
Testes com o líquido ácido: 
Cálcio
Transferir 1mL do extrato ácido para um tubo de ensaio (Tubo Amostra) e 1mL de água destilada em outro tubo (Tubo Branco). Adicionar aos tubos 05 gotas de solução diluída de Verde de Bromo-Cresol. Adicionar aos tubos 05 gotas de solução de oxalato de amônio a 4%. Acrescentar em seguida no tubo teste, solução de acetato de sódio a 20%, até o líquido adquirir coloração azulada (verde-azulada). O pH será aproximadamente 5,0. Notar a formação de precipitado branco, cristalino, de oxalato de cálcio. No tubo branco, utilizar o mesmo volume de acetato de sódio a 20% e nada deverá ocorrer.
Fosfato
Transferir 1mL do extrato ácido para um tubo de ensaio (tubo teste) e 1mL de água destilada para outro tubo de ensaio (tubo branco). Adicionar nos dois tubos 1,5mL do Reativo Molíbdico e aquecer brandamente por três minutos, sem ebulição.
Resfriar os tubos e notar a formação de precipitado amarelo de fosfo-molibdato de amônio no tubo teste. No tubo branco deve ser negativo.
Poderá ser efetuado um teste de reconfirmação: No tubo teste e branco acrescentar gotas de agente redutor. Deverá aparecer coloração azulada ou verde forte. O tubo branco deverá ser negativo.
Ferro
Transferir 2mL do extrato ácido para um tubo de ensaio (tubo teste) e 2ml de água destilada para outro tubo de ensaio (tubo branco). Adicionar aos tubos 05 gotas de solução de tiocionato de potássio a 10%. Observar o eventual aparecimento de coloração vermelho-sangüíneo.
A reação positiva se deve principalmente à presença de restos de sangue na câmara pulpar do dente.
Testes com o arcabouço (estroma) dentário (dente descalcificado)
 
Prova do Colágeno
Usar a porção do arcabouço dentário que deve estar em tubo de ensaio contendo 5mL de água destilada. Deixar o tubo mergulhado em Banho-Maria durante 40 a 50 minutos. Ainda quente, transferir duas alíquotas de 1mL para os testes de Biureto e Xantoprotéica. Transferir o tubo para um banho frio. Observar a formação de uma
massa gelatinosa, que é característico da presença de colágeno. O dente contém colágeno, uma escleroproteína que é extraída pela água quente, que é gelatinizado pelo resfriamento.
Biureto
A presença de colágeno no arcabouço dentário faz a Reação de Biureto ficar positivo.
O íon cobre de uma solução alcalina de CuSO4 se complexa com os grupos aminos das ligações peptídicas desenvolvendo coloração violeta. Na prova do colágeno, uma alíquota quente de 1mL foi transferida para um tubo de ensaio (tubo teste). Pipetar em outro tubo de ensaio 1mL de água destilada (tubo branco). Nos tubos, adicionar 1mL do Reativo do Biureto. O desenvolvimento de cor violeta indica presença de proteína na amostra.
Xantoprotéica
Na prova do colágeno, uma segunda alíquota quente de 1mL foi transferida para um tubo de ensaio (tubo teste). Pipetar em outro tubo de ensaio, 1mL de água destilada (tubo branco). Adicionar aos tubos 10 gotas de HNO3 concentrado e ferver. Acrescentar 4mL de NaOH 20%. O aparecimento de cor amarelo-alaranjado pela adição de soda, indica reação positiva para aminoácidos que contém grupamento fenil (tirosina e triptofano)
AULA 3: INIBIÇÃO DA GLICÓLISE PELO FLUORETO
Fundamento teórico: A cavidade bucal em condições apropriadas de temperatura, aeração, pH, restos de alimentos e outros, possibilita a proliferação de microrganismos. A ação do metabolismo fermentativo microbiano principalmente sobre os carboidratos conduz a formação de ácidos orgânicos e assim a instalação da cárie. O flúor é o componente anticárie mais conhecido cientificamente. É inibidor da via glicolítica pois age sobre a enzima enolase que catalisa a seguinte reação:
Glicose
2-fosfoglicerato
enolase H2O
fosfoenolpiruvato
ácidos orgânicos: ácido fórmico, acético, lático e propiônico
A enzima é inibida intensivamente pelo fluoreto, especialmente se houver fosfato, sendo a espécie inibidora o íon fosfofluoridato (FPO4-3) que forma um complexo com o magnésio. Na água tratada o flúor é adicionado sob a forma de fluorsilicato de sódio na concentração de 0,7mg/L durante o verão e 1,2mg/L durante o inverno. Nos cremes dentais é adicionado na forma de SMFP – Monofluorfosfato de Sódio ou então como Fluoreto de Sódio. Na parte experimental, para simular as condições da cavidade oral será usado meio nutriente contendo glicose e sais minerais.
Técnica:
Suspensão celular: Dissolver 1g de fermento em 10mL de água em um tubo grande. Agitar por 2 minutos para homogeneização. Preparar 02 tubos (A e B) como descrito abaixo:
	
	Tubo A
	Tubo B
	Meio Nutriente
	4,5mL
	4,5mL
	Fluoreto
	1,5mL
	-
	H2O
	-
	1,5mL
	Suspensão Celular
	1mL
	1mL
Levar ambos tubos ao Banho Maria (37oC) durante 20minutos. 
Centrifugar por 4 minutos a 4.000rpm e em seguida ler o pH para comprovar a formação de ácidos orgânicos.
Separar o sobrenadante usando um tubo de ensaio limpo e seco. 
Fazer a leitura de pH. Anotar os valores.
Quantificação da glicose residual:
O doseamento do consumo de glicose será realizado pelo método do DNS. A cor desenvolvida é proporcional à concentração de açúcar presente no meio e é estável por várias horas. Para o doseamento as amostras devem ser diluídas 1:50 (pipetar um mL do sobrenadante e transferir para um balão volumétrico de 50mL de capacidade. Completar o volume com água destilada). Em seguida, retirar 1mL para as determinações.
Técnica:
Preparar os seguintes tubos:
	Tubo
	H2O destilada
	Padrão
	Amostra A
	Amostra B
	Branco
	1,0mL
	 -
	 -
	 -
	Glicose[0,5mg/mL]
	 -
	 1mL
	 -
	 -
	Tubo A (c/F)
	 -
	 -
	 1mL
	 -
	Tubo B (s/F)
	 -
	 -
	 -
	 1mL
Pipetar nos tubos 1 mL de DNS
Ferver por 05 minutos
Colocar 5 mL de água destilada e homogeneizar
Ler em 540nm. Zerar o aparelho com o tubo branco
Anotar absorvância
Calcular a concentração de glicose nos tubos de amostras e calcular o consumo de glicose na amostra ausente de flúor
Calcular a percentagem inibida comparando com a amostra fluoretada
AULA 4: INFLUÊNCIA DOS FLUORETOS NA SOLUBILIDADE 
DO ESMALTE DENTÁRIO EM ÁCIDOS
Fundamento Teórico: Os fluoretos, aplicados topicamente ou ingeridos na água, reduzem a incidência da cárie dental. O efeito é devido, pelo menos em parte, à diminuída solubilidade do esmalte dentário em ácidos.
Atualmente, admitem-se dois mecanismos de atuação do flúor:
O flúor se adsorve firmemente no esmalte, permanecendo na forma de flúor apatita – Ca5(PO4)3.F – mais resistente e menos solúvel em ácidos do que a hidroxiapatita – Ca5(PO4)3.OH.
Uma concentração elevada de íons fluoreto na saliva, junto à superfície do esmalte, ocorre inibição da enzima enolase e, assim, bloqueia a via glicolítica, evitando a formação de ácido lático, diminuindo ainda a proliferação de microrganismos no meio bucal. Na verdade, a contagem de Lactobacillus acidophilus se mostra bem menor nas crianças que se submetem ao tratamento profilático com águas fluoretadas. 
Contudo, embora o flúor iniba a cárie dental, também pode exercer um papel tóxico, determinando o quadro da fluorose dental, em que os dentes se apresentam, inicialmente, com manchas brancas, em seguida escurecem, contendo pigmento rico em manganês. Dentes com fluorose dental são muito frágeis, fraturando-se facilmente, e tem ainda o inconveniente de ser antiestético.Entretanto, o flúor das águas na proporção de 1,0 ppm (1,0mg/L), é completamente atóxico e a fluorose não aparece. Desta forma, é possível aumentar muito a resistência dos dentes à cárie e manter a estética facial.
Parte Experimental:
Fluoretação: Colocar, em cada um de dois tubos de centrífuga identificados, 100mg de pó de esmalte (ou de dentina ou de fosfato tricálcico). Em um tubo acrescentar 5mL de solução de fluoreto de sódio e no outro tubo 5mL de solução de cloreto de sódio. Arrolhar com rolha de borracha. Agitar os tubos fortemente e da mesma forma (mesmo aluno deve agitar) durante 15 minutos.
Centrifugação e Lavagem: Retirar as rolhas e centrifugar os tubos. Desprezar os sobrenadantes por decantação. Deixar os tubos invertidos sobre papel de filtro durante 02 minutos. Lavar as paredes de cada tubo e a respectiva rolha com 5mL de água destilada. Quebrar o precipitado, com auxílio de Pipeta Pasteur. Arrolhar, agitar 01 minuto, centrifugar, decantar e drenar durante 02 minutos, como anteriormente.
Desmineralização: Adicionar em cada tubo, 10 mL da solução tampão acetato pH:3,5; arrolhar e agitar fortemente, e da mesma forma (mesmo aluno deve agitar) durante 10minutos. Tirar as rolhas, centrifugar e transferir 0,5mL do sobrenadante para tubos correspondentes, limpos e secos.
Evidenciação do fosfato desenvolvido: Adicionar em cada tubo 0,5mL de molibdato de amônio. Adicionar 0,2mL de redutor de fosfato. Adicionar 4mL de água destilada. Aguardar 5 minutos. Observar intensidade de coloração e concluir. 
AULA 5: EXTRAÇÃO E DOSAGEM DO ÁCIDO ASCÓRBICO DO SUCO DE FRUTA
Fundamento teórico: O ácido ascórbico (vitamina C) atua como coenzima em reações enzimáticas. Na biossíntese do colágeno, a vitamina C age como coenzima da prolilhidroxilase e lisilhidroxilase que catalisa a hidroxilação respectivamente da prolina e lisina. Na deficiência da vitamina C durante a síntese, o colágeno diminui grandemente a força de tensão e a doença é o escorbuto. Na dosagem de vitamina C no suco de frutas, a vitamina é extraída com ácido metafosfórico (HPO3). O ácido metafosfórico precipita as proteínas e impede a oxidação espontânea da vitamina C. O método de dosagem é baseado no poder redutor da vitamina. O corante 2,6-dicloroindolfenol (DFIF) é um indicador de óxido-redução que na forma oxidada em meio ácido, tem a cor rósea e na forma reduzida é incolor.
Técnica:
Em um Becker
pipetar 1 mL do suco de fruta e adicionar 9mL de ácido metafosfórico. Agitar e filtrar em papel de filtro, recolhendo o filtrado, o qual contém a vitamina extraída que será utilizado para o teste de dosagem do item 2.
2. Dosagem da Vitamina C Através de Titulação.
Técnica:
Preparar no erlenmeyer conforme o esquema abaixo e titular com 2,6-DFIF até o aparecimento da cor avermelhada, anotando o valor gasto na titulação para o cálculo da quantidade de Vitamina C presente no suco:
	
	1 (padrão)
	2 (suco)
	Padrão de ác. ascórbico
	5 mL
	-
	Suco
	-
	5 mL
	H2SO4 (1N)
	0,5 mL
	0,5 mL
	2,6-DFIF (mL)
	
	
Padrão de ácido ascórbico: 10 mg%
2,6-DFIF : Diclorofenolindofenol
Calcular a concentração de vitamina C no suco.