Extração de DNA de Escherichia Coli

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FUNDAÇÃO ESCOLA TÉCNICA LIBERATO SALZANO VIEIRA DA CUNHA
CURSO TÉCNICO DE QUÍMICA
FERNANDA BARBOZA TORRES 
RELATÓRIO EXTRAÇÃO DE DNA DE ESCHERICHIA COLI
Professora Jaqueline Brummelhaus
Novo Hamburgo
2017
INTRODUÇÃO
	O ácido desoxirribonucleico (DNA), é um complexo de moléculas que contém toda informação genética necessária para os seres vivos, além de ser a unidade primária da hereditariedade. Durante a reprodução, uma parte do DNA do organismo é passada para seus descendentes. O DNA é formado por duas fitas de bases nitrogenadas ligadas por pontes de hidrogênio, e essas bases são ligadas às suas correspondentes, como na figura 1 (MARCEL, 2014).
Figura 1 – Molécula de DNA
 Fonte: Infoescola, 2017
A extração de DNA tem grande importância, pois seu estudo permite identificar causas de doenças genéticas, distinguir e analisar vírus e bactérias, determinar a paternidade de indivíduos e até mesmo criar organismos geneticamente modificados gerando produtos benéficos, tais como insulina, antibióticos e hormônios (KASVI, 2016).
O avanço da biotecnologia tem revolucionado o estudo dos organismos, utilizando técnicas de DNA recombinante. Algumas aplicações da biotecnologia na medicina são a produção de insulina, medicamentos e vacinas, a manipulação de animais, a pesquisa com células-tronco para fins terapêuticos, entre outros (DUARTE, 2017).
A Escherichia coli (figura 2) é uma bactéria gram-negativa, habitante bastante comum do intestino grosso dos vertebrados, incluindo humanos e, provavelmente, o micro-organismo mais conhecido na área. Sua presença é benéfica, pois ajuda na produção de certas vitaminas e participa da digestão que não seriam digeridos sem sua presença. Contudo, a linhagem chamada de E. coli O157:H7 causa diarreia sanguinolenta quando cresce no intestino (TORTORA, FUNKE e CASE, 2012). 
Figura 2 – Escherichia coli
 Fonte: BBC, 2011.
O objetivo da prática laboratorial foi isolar as moléculas de DNA da bactéria Escherichia coli a partir da técnica de extração de DNA (fenol-clorofórmio) e analisar seus resultados quantitativos e qualitativos em gel de agarose.
METODOLOGIA 
Em um eppendorf de 1,5 mL contendo cultura de Escherichia coli - previamente crescidas em meio LB (Luria Bertani) a 37°C overnight - ressuspendeu-se as colônias, com o auxílio de micropipetas, em 500 μL de solução salina-EDTA (NaCl 0,15 M, EDTA 0,1 M), para inibir a ação de desoxirribonucleases (DNases). 
Adicionou-se 80 μL de SDS 10% (surfactante aniônico), utilizado para lise das células, com ação de desnaturação de proteínas e inibição enzimática. 
O tubo foi fechado e levemente agitado. Em seguida, incubou-se a 60°C por 5 minutos e adicionou-se 1 volume de fenol-clorofórmio, utilizado para desproteinizar à preparação. O tubo foi levemente agitado por 5 minutos e, em seguida, centrifugou-se por 2 minutos a 12000 rpm. 
Após centrifugado, decantou-se a parte aquosa (fase superior) para um tubo limpo, tomando-se os devidos cuidados para não pipetar o precipitado da interface. Adicionou-se NaCl 5M à concentração final de 0,1M.
Adicionou-se 2 volumes de etanol absoluto e parte da mistura tornou-se esbranquiçada, indicando a precipitação dos ácidos nucléicos. Fechou-se o tubo e interviu-se várias vezes para que o etanol estivesse bem misturado. 
Conforme ocorreu a precipitação, parte do DNA enovelou-se e foi para o fundo do tubo. Centrifugou-se a solução por 5 minutos a 12000 rpm para acelerar o processo. Finalizada a centrifugação, desprezou-se o máximo de sobrenadante possível e colocou-se o tubo aberto na estufa a aproximadamente 50°C para secar o DNA. 
O DNA foi ressuspendido para eletroforese - método utilizado para organizar os fragmentos de DNA em função do comprimento - em 20 μL de tampão TE (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8). Misturou-se 10 μL de solução de DNA com 1 μL (tampão de amostra com GelRed). Em seguida analisou-se o gel de agarose no transiluminador de luz UV.
RESULTADOS, DISCUSSÃO E CONCLUSÃO
Figura 3 – Resultados obtidos pela extração de DNA de E. coli
 Fonte: o autor, 2017.
Os resultados foram satisfatórios, pois conseguiu-se extrair o DNA de Escherichia coli e analisar através da eletroforese, por todos os grupos. Conforme a figura 3, o grupo que conseguiu extrair maior quantidade de DNA da E. coli foi o grupo 1, e o que extraiu menor quantidade foi o grupo 3. Houve aparecimento de RNA ribossômico nas amostras dos quatro grupos. 
A diferença de resultados dos quatro grupos pode ter sido influenciada pela maior dificuldade de alguns alunos e pela diferente organização na prática.
O RNA ribossômico pode ter aparecido devido a um erro de transferência da solução aquosa (fase superior), após adição do fenol-clorofórmio, agitação e posterior centrifugação, ao pipetar uma certa quantidade de proteínas junto à solução contendo ácidos nucleicos para o tubo limpo. 
Essa prática foi muito interessante para visualizar melhor o que é estudado em aula, além de trazer uma nova experiência de trabalhar em um laboratório diferente em uma área bastante nova para nós. A atividade teve bom aproveitamento em todos os aspectos. 
REFERÊNCIAS
ALEIXO, Márcio Santos. DNA. Infoescola, 2017. Disponível em: <https://www.infoescola.com/biologia/dna/>. Acesso em: 10 out. 2017. 
DUARTE, Michelle. Biotecnologia. Toda Matéria, 2017. Disponível em: <https://www.todamateria.com.br/biotecnologia/>. Acesso em: 10 out. 2017. 
 
KASVI. Como é realizada a Extração de DNA? KASVI, 2016. Disponível em: <www.kasvi.com.br/a-extracao-de-dna/>. Acesso em: 10 out. 2017. 
MARCEL, Guellity. O que é DNA? Eu quero biologia, 2014. Disponível em: <http://www.euquerobiologia.com.br/2014/04/o-que-e-dna.html>. Acesso em: 10 out. 2017.
MUNDASAD, Smitha. E. coli: Are the bacteria friend or foe? BBC, 2011. Disponível em: <http://www.bbc.com/news/health-13639241>. Acesso em: 10 out. 2017.
TORTORA, FUNKE e CASE. Microbiologia. 10ª ed. – Porto Alegre: Artmed, 2012.