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Aula 09/09/16 - Bioterismo Existe algumas situações onde é aceitável, onde é permitido que se use animal em experimentação Esse slide de baixo trás uma síntese do que a gente vê na nossa disciplina. O nosso objetivo ao fazer o controle é garantir que o medicamento ou cosmético produzido seja inócuo e eficaz. Então os testes que vamos ver ao longo desse semestre são para garantir isso, que o produto acabado seja eficaz e não cause nenhum dano ao usuário. Tanto para garantir eficácia quanto pra garantir segurança a gente faz uso muitas vezes de ensaios biológicos. Então a gente usa sistemas biológicos ou ensaios biológicos pra comparar a nossa amostra com um padrão conhecido e verificar entao o teor da substância através da medida das respostas biológicas que a gente tá avaliando. E dependendo do ensiao a gente também vê o desenvolvimento de efeitos colaterais, efeitos tóxicos. Então os ensaios biológicos obviamente estão relacionados a organismos vivos. A gente estuda a ação da substância sobre o organismo vivo. E nos ensaios biológicos a gente utiliza os chamados reativos biológicos. Pq a gente usa animal para realizar ensaio biológicos? Pq apesar de existir diferenças entre homem e animais, os processos como: absorção, distribuição, biotransformação e eliminação de substância é muito semelhante. Então isso quando se trata de um fármaco é bastante relevante. E na maioria das vezes uma resposta em animal é preferível a uma resposta que se observa por exemplo em uma cultura de células ou em programas. Isso principalmente quando a gente está avaliando potencial carcinogênico. Muitas vezes a gente tem que o nosso programa indica que a substância pode ter um efeito carcinogênico, na própria cultura de células pode demonstrar um indicativo que isso possa ocorrer mas a gente só vai verificar isso nos ensaios toxicológicos, nos ensaios em animais. Então a gente precisa avaliar a resposta de um organismo como um todo e não só de uma única célula isolada. O que a gente precisa pra ter um ensaio confiável e reprodutível? A gente precisa de um reagente padronizado. Então eu utilizar um animal são, um animal que foi criado em condição ideal, ele vai responder de uma forma. Se eu utilizar que está doente ou que está mantido em uma condição de por exemplo uma sala sem ar condicionado, esse animal vai estar muito estressado e vai me dar uma resposta diferente. Pra que eu tenha reprodutibilidade dos meus ensaios eu tenho que ter reativos biológicos padronizados. Por isso que é extremamente importante que se sigam todas as práticas de bioterismo para os ensaio de controle de qualiade para que eu tenha um reativo biológico padronizado e para que eu possa comparar resposta de um ensaio com outro. Então no Brasil os pesquisadores só começaram a ter normas que regulamentasse o uso de animais em pesquisa em 1991. E essas normas e todas as normas que regulamentam o uso de animais não só no Brasil mas no mundo todo, foram criadas com base em aspectos éticos que foram estabelecidos por 2 pesquisadores Britânicos (Russell e Burch). O cumprimento desses R's é cobrado em agências regulatórias no mundo inteiro. Idependente do teste, cabe sempre ao experimentador escolher a espécie adequada pra resposta que vai ser avaliada. Se eu to avaliando por exemplo se o meu medicamento contém contaminantes que podem causar febre, eu preciso escolher um coelho. Por que o coelho, se eu injetar o meu medicamento nele e o medicamento estiver contaminado com pirogênico o coleho vai ter febre assim como o humano vai ter. se eu escolher a espéciei errada, se eu escolher um camundongo para fazer esse ensaio, eu não vou ver febre, muito pelo contrário pq o camundongo responde de maneira contrária, ele tem uma diminuição da temperatura corporal. Então isso é só um exemplo de como a escolha da espécie adequada é importante. Mas independente da espéce, o animal tem que ter boa saúde. Bom, isso eu já falei no começo da aula mas é importante reforçar pq é fundamental pro controle de qualidade : deve ser seguidas as regras de bioterismo que garantam a qualidade do reativo biológico, que garantam a qualidade dos animais, tanta na criação quanto na experimentação. Isso pq animais em condições adversas vão ter resultados que não são reprotutiveis. Então condições adversas vão influenciar negativamente os resultados obtidos. Resultados diferentes podem ser obtidos de animais expostos ao mesmo estímulo se esses animais estiverem em condições diferentes: animal saúdavel vs animal doente. Então como eu já falei, as espécies mais utilizadas são: camundongo (Ms musculus), rato (Rattus norvegicus) e coelho (Oryctolagus). Os mais utilizados são os ratos e os camundongos por questão de custo. São animais menores, precisam de menos espaço. Eles proporcionalmente comem menos. Eles tem um ciclo de vida curto, então um camundongo vive no máximo por 3 anos. Se eu tiver utilizando cachorro por exemplo, pode viver em média 15 anos. E ratos e camundongos além de serem baratos, é fácil criar os animais, é facil manter e eles tem um genoma facilmente acessível. Eu tenho falado muito de animal saúdavel. O que vai ser um animal saúdavel para os nossos ensaios de controle de qualidade? Vendo de uma forma macróscopicamente Microscocópicamente a gente tem animais de diferentes classificações sanitárias dependendo do nosso teste a gente tem que garantir que eles tenham uma microbiota conhecida. Então existem 3 classificações para animais de laboratório, que são: De maneira geral, os ensaios de controle de qualidade se utiliza animais ou convencionais ou animais SPF. Pra ensaio de antineoplásicos se utiliza gnotobióticos. Esses animais são extremamente caros pelas condições em que são mantidos. Pra que se atinja esse grau microbiológico tem que ser td muito rigoso, então tem que ter pessoal treinado, tem que ter o minomo possível de pessoas trabalhando no biotério. tem que usar caixas que são caras. Então geralmente eles são utilizados em situações mais específicas. Além da classificação sanitária eu tenho uma classificação genética dos animais. Então eu posso fazer esquemas específicos de acasalamento pra obter padrões genéticos de interesse. se eu fizer acasalamento entre irmãos eu vou ter acasalamento co-sanguíneo chamado "INBRED". Se eu fizer acasalamentos ao acaso, eu vou ter o cahama aberto ou "OUTBRED". Quando eu acasalo irmãos por 20 gerações eu vou obter animais que são chamados isogênicos. São animais que vão ter exatamente a mesma informação genética. Se eu tiver um animal INBRED ou isogênico eu tenho um animal de mais qualidade pq eu tenho um controle da uniformidade genética. Enquanto que um acasalamento OUTBRED vai me dar uma quantidade maior de animais pq esses animais que são acasalados ao acaso tem mais filhotes e eles engavidam mais vezes mas a variabilidade genética desses animais é muito grande então o controle desses animais é muito mais difícil. Em quais casos de usa um animal ou outro? Isso vai depender do que eu estou avaliando. Se eu to avaliando imunoterápicos, antineoplásicos, é mais interessante que eu tenha uniformidade genética. Se eu to fazendo um ensaio de controle de qualidade comum, se eu to fazendo ensaio toxicologico por exemplo, é interessante que eu tenha uma certa variabilidade genética que vai estar mais associada ao que eu observo na população em geral, então nesses casos eu posso utilizar animais obtidos atraves do sistema OUTBRED. Tanto pra se obter animais isogênicos quanto os OUTBRED eu posso utilizar diferentes esquemas de acasalamento. Eu posso utilizar o esquema monogâmico ( 1 macho e 1 fêmea) ou poligâmico ( 1 macho e 2 ou mais fêmeas). Normalmente se usa no máximo 4. Não adianta pegar qualquer animal pra fazer o acasalamento, eu preciso respeitar alguns critério. A idade dos pais é importante pq eles tem uma idade reprodutiva ideal (normalmente de 3 a 9 meses).O aspecto, pq obviamente eu vou querer um animal com aspecto saudavel. O número deparições, pq quando a fêmea atinge um número x parições a gente retira ela do programa de acasalamento ( +/- 8). Obviamente de o animal tiver doente eu vou eliminar ele do programa de acasalamento. Mortalidade, as vezes as ninhadas tem mortalidade elevada (o camundongo tem cerca de 10 a 12 filhotes por ninhada). Se os animais começarem a morrer demasiadamente isso pode ser um indício de que a fêmea tem algum problema. O peso, eu preciso que os animais tenham um peso mínimo pra entrarem no programa. E os animais não podem ter nenhum defeito/anormalidade detectada. Agora vamos falar da estrutura do biotério. Existem 3 tipos de biotério: O biotério tem que ser uma estrutura física capaz de promover um ambiente ideal pro animal ser mantido, desde a criação até a utilização. Então tem que haver um controle tanto dos fatores físicos quanto de fatores ambientais. Desde o planejamento eu preciso de uma estrutura que seja fácil de limpar, tem que ser um local com ventilação adequada, também um sistema de luminação adequado, tem que ser um local com um nível adequado de barulho e livre de odores e vapores. Os animais quando são mantidos em grande quantidades eles vão produzir muita amônia e a amônia é tóxica tanto pra eles quanto pro pessoal que trabalha no biotério, por isso que o sistema de exaustão é importante. É importante o controle de temperatira adequado. E os biotérios de maneira geral são divididos em áreas: criação, experimentação, almoxarifado/depósito, água/alimento, limpeza material, esterilização, administração, pessoal. O fluxo dos biotérios tem que ser sempre igual. Então o material que tá preparado entra em um sentido para as salas de criação e experimentação, entro com o material limpo, troco os animais, coloca água e retiro o material sujo por outra porta e levo pra área de lavagem. É necessário que a estrutura seja construída de maneira que exista um fluxo delimitado da área limpa pra área suja. Tem que haver uma sepração da área limpa e área suja. A área limpa vai ser a área de criação ou experimentação e a área suja é a área onde eu lavo as caixas e garrafas sujas, onde eu preparo as caixas limpas, e onde eu estoco material. Como eu separo a área limpa da área suja? Através de barreiras que podem ser físicas ou químicas. Uma questão importante é o controle sanitário dos animais do biotério. Independente da classificação sanitária deles eu preciso ter o que a gente chama de gaiola sentinela, que é uma gaiola que vai ficar no bioterio, não vai ser utilizada no experimento, mas vai utilizar a mesma água, mesma comida, vai sofrer os mesmos procedimentos de todas as outras gaiolas e periodicamente eu vou pegar uma amostra dos animais da gaiola sentinela e vou avaliar pra verificar a presença de parasitas, vírus, bactérias, que possam causar doenças nos animais pra que eu possa me certificar do estado sanitário do meu animal. Não adianta nada eu dizer que em determinada ensaio eu usei animal SPF se eu não provei que é um animal SPF. Vamos falar um pouquinho agora sobre riscos e cuidados. Mesmo que o animal não seja experimentalmente infectado ele é um risco pra quem manipula. Então qualquer pessoal envolvida na manipulação de animais precisa receber treinamento com relação a procedimentos básicos de segurança. Os laboratórios que trabalham com animais de biotérios tem que ter cuidados com relação a prevenção de escape de organismos patogênicos caso seja um laboratório que estude algum patógeno nos animais. Se for um laboratório que trabalha com animais transgênicos, por exemplo, e eu deixar escapar um animal transgênico que pe resistente a raticida. Esse rato vai cair no ambiente, vai se reproduzir com outros ratos e em alguns anos nós vamos ter uma população que é totalmente resistente a raticida.
