REAÇÃO EM CADEIA POLIMERASE - PCR

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REAÇÃO EM CADEIA POLIMERASE
Reação de síntese de regiões específicas de DNA em ciclos repetidos. A cada ciclo, o número de fragmentos amplificados é duplicado;
A síntese de DNA é catalisada pela DNA polimerase termoestável;
PRIMERS: Pequenos segmentos de DNA de fita simples que agem como iniciadores.
ETAPAS DA PCR:
Desnaturação do DNA: separação das fitas do DNA molde em uma temperatura próxima a 95 graus (rompimento das pontes de hidrogênio);
Anelamento dos primers do DNA molde: Com o DNA desnaturado, os dois primers, cada um com a sequência de bases complementar, podem anelar o DNA-molde, através do pareamento das bases complementares. É possível com a diminuição da temperatura logo após a desnaturação.
Extensão dos primers (síntese de DNA): A DNA polimerase utilizada é usualmente a Taq DNA-polimerase, originalmente isolada e purificada da bactéria termofila Thormus aquaticus e cuja temperatura é em ótima atividade a 72 graus. A amplificação da região- alvo se dá em torno de 25 a 30 ciclos (cada ciclo dura cerca de 5 min).					OBS: Amplicon – produto final da reação. -> Fragmento de DNA de fita dupla, cuja extremidades são definidas pela extremidade 5’ de cada um dos primers. Forma mais usual do amplicon = eletroforese em gel de agarose, contendo brometo de etídeo.
Toda PCR deve conter: os primers, uma DNA- polimerase termoestável, os 4 desoxirribonucleotídeos, DNA-alvo e um tampão apropriado.
VANTAGENS:
- Pode detectar apenas UMA molécula de DNA;
- Técnica extremamente sensível no caso de diagnóstico molecular de doenças infecciosas;
- Método de detecção direta pela presença de material genético do próprio agente infeccioso na amostra analisada.
PARÂMETROS DOS CICLOS TÉRMICOS:
- O número de ciclos vai depender da complexidade e da quantidade de DNA- molde no início da reação;
- À medida que o amplicon vai sendo acumulado, a quantidade de primer disponível diminui;
- A taq DNA polimerase não é completamente termoestável;
- O tempo de incubação de cada ciclo pode influenciar na especificadade da PCR, uma vez que depende das características do termociclador;
- Uma das falhas da PCR pode ser a desnaturação incompleta do DNA- alvo.