PCR - resumo

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PCR 
Conceito
· Reação de polimerização em cadeia = é a técnica de replicação (amplificação) do DNA e RNA. 
· Imita o processo in vivo em in vitro. 
· Usando uma reação enzimática catalisada pela polimerase (enzima termoestável) cuja atividade depende dos íons Mg+2. 
· Componentes da replicação in vivo: DNA pol, ligase, helicase, primase, girase e DNA molde. 
· Dificuldade do in vitro = precisa de enzimas e cada uma tem um PH e temperatura ótimos.
OBS: Qual o problema de utilizar DNA pol humano? Não resiste às altas temperaturas. 
vantagens 
· Qualquer sequência alvo de DNA pode ser amplificada por PCR. 
· Método rápido e eficiente - alta especificidade e reprodutividade
· Pequena porção 
· DNA gerado – base para nova amplificação 
· Ciclos: cada ciclo origina duas novas cadeias de DNA. 
OBS: Por isso precisa de ciclos = cada DNA gera uma nova fonte de replicação.
· Reação em cadeia – DNA ampliado exponencialmente. 
· Diagnóstico mais preciso das doenças, afastando a medicina do diagnóstico somente pela sintomatologia. 
como substiuit as enzimas?
· Helicase: separa a fita dupla de DNA 
- Substituída pelo calor, pois as pontes de hidrogênio são ligações fracas, precisam de pouca energia para serem rompidas. 
· Girase: estabiliza o lado oposto do DNA que está aberto. 
- DNA completamente aberto por causa do calor.
· Ligase: liga os fragmentos de Okasaki 
- Não precisa porque a síntese é de forma contínua nas duas fitas.
· Primase: forma os primers 
- As empresas já mandam o primers prontos = não precisa de uma enzima para isso. 
características 
· É muito rápido (identificação em 20min)
· Eficiente com alta especificidade (não existe reação cruzada na PCR)
· Reprodutível (caso a técnica seja repetida 10x, o resultado será sempre o mesmo)
· Segura
· Pode ser feita por qualquer pessoa. 
princípios da pcr
· Ocorre em 3 etapas (cada ciclo realiza as 3): 
· Melting: desnaturação (separação das fitas de DNA a ser amplificada). 
· Annealing: anelamento ou hibridização = ligação do iniciador ou primer ao DNA a se amplificado.
· Extension: extensão, ou seja, a polimerização propriamente dita = DNA polimerase. 
· Alternância da temperatura em cada ciclo: 
· Desnaturação (94° a 96°)
· Anelamento (37° a 65°)
· Extensão (72°): DNA polimerase acrescenta os dNTP’s à fita de acordo com o pareamento de bases. 
OBS: tudo acontece em tempo curto.
automação da pcr
· Reagentes necessários: 
· DNA polimerase termoestável 
· Par de primers 
· Cloreto de magnésio (MgCl2)
· dNTPs
· Tampão 
· DNA molde.
PRIMERS: 
· Segmentos de DNA ou RNA 
· Sintéticos (criados em laboratório) 
· Especificidade 
· Utilizados em par (um para cada fita) 
· Feito a partir do DNA e RNA que se quer identificar 
· Consumidos na reação 
· Definem os limites do DNA a ser amplificado. 
· Fornece OH para o início da síntese. 
TAMPÃO 
· Mantém o PH ótimo para a atividade da enzima 
MAGNÉSIO 
· Estimular a taq polimerase 
DNA POLIMERASE TERMOESTÁVEL 
dNTPs:
· Matéria prima para a síntese da fitas-filhas.
cinética da pcr
· Fase de screening (ciclos iniciais): os primers procuram o molde de DNA com as sequencias que lhes são complementares. 
· Fase intermediária: o processo de amplificação está ocorrendo levando ao acúmulo exponencial dos fragmentos de DNA. 
· Fase tardia ou fase de platô: A amplificação já é sub-ótima devido à limitação dos reagentes = DNA polimerase desnaturada e primer consumido. 
vantagens e desvantagens da pcr
Vantagens 
· Muito sensível, podendo amplificar uma única molécula de DNA/RNA. 
· Grande quantidade de DNA em pouco tempo 
· Baixo custo 
· A amostra de DNA não necessita estar altamente purificada. 
· O produto do PCR pode ser digerido com enzimas de restrição, sequenciado ou clonado. 
Desvantagens
· Requer técnicas específicas para conduzir o teste e avaliar o resultado. 
variações da pcr
NESTED PCR 
· Dois rounds = duas amplificações 
· Um fragmento maior depois outro menor 
· Aumentar a quantidade de produto final. 
· Aumentar a sensibilidade da técnica.
RT-PCR
· Não parte diretamente do molde de DNA da amostra
· Transcriptase reversa = RNA que é convertido em DNA. 
· Estudos em HIV 
clocagem 
· Isolamento do gene a ser clonado 
· Amplificação do gene por PCR 
· Inserção dos genes em plasmídeos (DNA bacteriano)
· Introdução do plasmídeo no organismo e expressão do gene. 
pcr real time 
· PCR metodológica + dectecção de sinais florescentes 
· Detecção, quantificação e amplificação do DNA em uma única etapa. 
· Técnica quantitativa e ágil. 
· Quantificação de moléculas a cada ciclo.
OBS: Hepatite C = quantifica a quantidade de interferons para o tratamento. 
VANTAGENS 
· Sem manipulação pós-PCR
· Concetração de DNA e RNA 1000 x 
· Resultados quantitativos
· Tempo de reação reduzido. 
· Maior reprodutibilidade, sensibilidade e precisão. 
DESVANTAGENS 
· Mais caro