Reações de Coloração e Precipitação de Proteínas

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FACULDADE EDUCACIONAL DE ARAUCÁRIA
ELAYNE CRISTINA RANIEL
MARIA IZABEL MEHRET
MAYRA SILVA
THAYANE CIDREIRA
PROTEÍNAS – REAÇÕES DE COLORAÇÃO E PRECIPITAÇÃO 
ARAUCÁRIA
ABRIL 2018
ELAYNE CRISTINA RANIEL
MARIA IZABEL MEHRET
MAYRA SILVA
THAYANE CIDREIRA
 PROTEÍNAS – REAÇÕES DE COLORAÇÃO E PRECIPITAÇÃO 
Relatório de Bioquímica apresentado como requisito parcial da 1ª nota semestral do Curso de Tecnologia em Processos Químicos da Faculdade Educacional de Araucária.
 Professora: Vivian C. Spier 
 
ARAUCÁRIA
ABRIL 2018
SUMÁRIO
1.	OBJETIVO	4
2.	INTRODUÇÃO	5
3.	MATERIAIS E MÉTODOS	8
3.1 Reação de ninhidrina	9
3.2 Reação do birueto	9
3.3 Reação de precipitação com desnaturação das proteínas	9
3.4 Reação de precipitação sem desnaturação	10
4.	PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL	11
4.1 Reação de ninhidrina	11
4.2 Reação do Birueto	11
4.3 Reação de precipitação com desnaturação das proteínas	11
4.4 Reação de precipitação sem desnaturação	11
5.	RESULTADOS E DISCUSSÃO	13
5.3.1 Precipitação por ação do calor:	13
5.3.2 Precipitação por reação com reagentes para alcaloides:	13
5.3.3 Precipitação por reação com sais de metais pesados	14
5.3.4 Precipitação por ação de solvente orgânico:	14
5.4.1 Efeito da força iônica sobre a solubilidade das proteínas	14
7.	CONCLUSÃO	19
8.	REFERÊNCIAS	20
OBJETIVO
Caracterizar a presença de proteínas em materiais biológicos
Verificar experimentalmente a precipitação de proteínas com e sem desnaturação
 INTRODUÇÃO
Em animais superiores, as proteínas são os compostos orgânicos mais abundantes, representam cerca de 50 % do peso seco dos tecidos. Do ponto de vista funcional, seu papel é fundamental, não existindo processo biológico que não dependa da presença ou da atividade deste tipode biomolécula. As proteínas desempenham inúmeras funções distintas, como por exemplo: enzimas, hormônios, proteínas transportadoras, anticorpos e receptores de muitas células. 
Todas as proteínas contêm carbono, hidrogênio, oxigênio e nitrogênio e 
Muitas possuem enxofre. Há variações na composição de diferentes proteínas, porém a quantidade de nitrogênio, representa, em média, 16 % da massa total da molécula. Dessa forma pode-se calcular a quantidade aproximada de proteína em uma amostra medindo-se a quantidade de nitrogênio da mesma. 
As proteínas são moléculas poliméricas de grande tamanho, pertencendo à categoria das macromoléculas, constituídas por um grande número de unidades monoméricas estruturais – os aminoácidos – que formam grandes cadeias. Devido a esse grande tamanho, quando são dispersas em um solvente adequado, formam soluções coloidais, que possuem características especiais que as distinguem das soluções de moléculas pequenas. Por meio da hidrólise podemos clivá-las em sequências menores de aminoácidos, pois centenas ou milhares de aminoácidos podem participar na formação de uma grande molécula polimérica de uma proteína. 
As proteínas são formadas através de ligações peptídicas entre os diversos tipos de aminoácidos e podemos classificá-las em duas grandes categorias: 
Estrutura primária: refere-se ao número e identidade dos aminoácidos que compõem a molécula e ao ordenamento ou sequência dessas unidades na cadeia polipeptídica. A união peptídica somente permite a formação de estruturas lineares e por isso, as cadeias não apresentam ramificações. 
Estrutura secundária: a medida que o comprimento das cadeias vai aumentando e em função das condições físico-químicas do meio, se cria a estrutura secundária, que é a disposição espacial regular, repetitiva, que a cadeia polipeptídica pode adotar, geralmente mantida por ligações de hidrogênio.
Estrutura terciária: é a estrutura da maioria das proteínas globulares, aparece a partir das hélices, que voltam a enrolar-se. É uma estrutura tridimensional completa que forma-se a partir das forças de atração ou repulsão eletrostática, das pontes de hidrogênio, das forças de Vander Waals e das pontes dissulfeto existentes entre os resíduos de aminoácidos que formam as cadeias.
Estrutura quaternária: são estruturas de caráter oligomérico, que estão compostas por várias moléculas separadas, mas entrelaçadas em estrutura terciária. Se aplica somente a proteínas constituídas por duas ou mais cadeias polipeptídicas e se refere à disposição espacial dessas cadeias e as ligações que se estabelecem entre elas – pontes de hidrogênio, atrações eletrostáticas, interações hidrofóbicas, pontes dissulfeto entre cisteínas de cadeias diferentes. Um exemplo deste tipo de estrutura é a hemoglobina que é composta por quatro subunidades semelhantes à mioglobina.
Os aminoácidos são moléculas formadas por um grupo carboxila e um grupo amina que se ligam a um átomo de carbono. A esse carbono ligam-se também um átomo de hidrogênio e um radical que varia de acordo com o aminoácido e geralmente é chamado de grupo R.
O termo peptídeo refere-se à união de dois ou mais aminoácidos por intermédio de ligações) em virtude da perda de uma hidroxila do grupo carboxila e de hidrogênio peptídicas, que ocorrem entre o grupo carboxila de um aminoácido e o grupo amina de outro. Quando esses grupos se ligam, ocorre a formação de água (reação de desidratação do grupo amina.
Os peptídeos diferem-se uns dos outros pelo número de aminoácidos e pela sequência dessas moléculas. De acordo com o número de aminoácidos que possuem, podemos classificá-los em dipeptídeos, quando são formados por dois aminoácidos; tripeptídeos, quando são formados por três; tetrapeptídeos, quando são formados por quatro aminoácidos, e assim por diante. Quando temos vários aminoácidos ligados, usamos a denominação polipeptídeo.
Os peptídeos apresentam importantes funções no nosso organismo. Alguns funcionam como hormônios, outros como neurotransmissores, analgésicos e até antibióticos. Em razão de suas importantes propriedades, os estudos científicos nessa área são amplamente realizados e a síntese desses compostos em laboratório é cada vez mais frequente.
Para sintetizar os peptídeos em laboratório, três técnicas são realizadas: síntese com DNA recombinante, síntese biocatalisada e síntese química de peptídeos. Após sua fabricação, os peptídeos sintéticos são levados a um controle de qualidade, posteriormente purificados e novamente analisados. Nesse ponto, o peptídeo pode ser então utilizado de modo seguro em pesquisas.
No momento em que a proteína está sendo sintetizada e as ligações peptídicas estão se formando, o radical carboxila perde um grupamento –OH (hidroxila), deixando uma ligação livre. Simultaneamente, o radical amina de outro aminoácido perde um átomo de hidrogênio (–H ), ficando, também, com uma ligação livre. Já que existem duas ligações livres, os aminoácidos tendem a se juntar: o OH do grupo carboxila de um aminoácido se liga ao H da amina do vizinho, produzindo uma molécula de água.
No entanto, essa molécula de água produzida não estabelece propriamente a ligação peptídica, uma vez que ela é eliminada, sendo assim, a união entre dois aminoácidos consiste numa reação de condensação (ou síntese por desidratação). A ligação peptídica efetivamente ocorre entre o carbono (C) de um aminoácido e o nitrogênio (N) do aminoácido vizinho, classificada como ligação covalente (C–N).
Uma ligação peptídica é capaz de impedir que a molécula se enrole, o que faz com que as moléculas resultantes apresentem uma estrutura planar. Para romper uma ligação peptídica, é necessário ocorrer uma hidrólise (quebra pela água). Ao adicionar uma molécula de água à cadeia proteica, acontecerá o inverso da formação da ligação peptídica: as ligações livres dos grupamentoscarboxila e amina serão “preenchidas” e, dessa forma, a ligação peptídica será quebrada.
 MATERIAIS E MÉTODOS
Tubo de Ensaio;
Pipeta;
Pera; 
Pipeta de Pasteur;
Pinça de Madeira;
Bico de Bunsen;
Bastão de Vidro;
Solução de ninhidrina a 0,1% em tampão fosfato pH 7,0 (10mM);
Solução de proteína: clara de ovo a 10%;
Hidróxido de sódio 2,5N;
Solução de sulfato de cobre 1%;
Solução de proteína de clara de ovo a 10% com solução salina de NaCl a 0,9%;
Ácido tricloroacético a 10%;
Acetato de chumbo a 5%; 
Álcool etílico absoluto;
Clara de ovo;
Solução de cloreto de sódio 1N;
Solução saturada de sulfato de amônio 76,6%;
Água Destilada.
3.1 Reação de ninhidrina
Em um tubo de ensaio pipetar 2 mL da solução de ninhidrina, adicionar 5 gotas da solução de proteínas e ferver durante 2 minutos. Observar o aparecimento da cor azul violeta.
3.2 Reação do birueto
Pipetar em um tubo de ensaio 1 mL da solução de proteína, adicionar 5 gotas de NaOH 2,5N e 3 gotas de sulfato de cobre a 1%. Desenvolve-se uma coloração purpura (violeta) característica de resultado positivo. Em um segundo tubo colocar 1mL de água, 3 gostas de sulfato de cobre e 5 gotas de NaOH 2,5N observando o aparecimento de uma cor azul escura, devido a alcalização de CuSO4 e que não deve ser confundida com a reação positiva do biureto, observada no primeiro experimento contendo proteína.
3.3 Reação de precipitação com desnaturação das proteínas
3.3.1	Precipitação por ação do calor: Em um tubo de ensaio colocar 2mL da solução de proteína e aquecer diretamente na chama, usando bico de Bunsen. Observar a formação de coágulo branco de proteína desnaturada.
3.3.2	Precipitação por reação com reagentes para alcaloides: Em um tubo de ensaio colocar 1 mL da solução de proteína e 1 mL de ácido triclocoacético a 10% (TCA). Observar a formação de um precipitado branco de proteína desnaturada.
3.3.3	Precipitação por reação com sais de metais pesados: Em um tubo colocar 1mL da solução de proteína e 1mL da solução de acetado de chumbo 5%. Observar a formação de um preciptado de proteína desnaturada.
	
3.3.4	Precipitação por ação de solvente orgânico: Em um tubo de ensaio colocar 1mL da solução de proteína e adicionar de 1 a 3mL de álcool etílico até a formação do precipitado de proteínas.
3.4 Reação de precipitação sem desnaturação
3.4.1	Efeito da força iônica sobre a solubilidade das proteínas: 
a) Solubilização “salting-in”: Pipetar 3mL de clara de ovo em um béquer. Diluir com água destilada mexendo com bastão de vidro, até notar o aparecimento de um precipitado (globulinas). Adicionar, em seguida solução de cloreto de sódio, gota a gota, até a redissolução do precipitado. Esta redissolução se deve a restauração da força iônica original e corresponde ao fenômeno de “salting-in”.
b) Solubilização “salting-out”: Pipetar 2 mL de solução obtida na experiência anterior (salting-in) e um tubo de ensaio adicionar 2mL de solução saturada de sulfato de amônio e observar a formação de precipitado de proteínas (globulinas) o que corresponde ao fenômeno “salting-out” juntar a seguir 4-6mL de água destilada a fim de recompor a força iônica anterior e como consequência, redissolver o precipitado.
PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
4.1 Reação de ninhidrina
Adicionou-se em um tubo de ensaio 2 mL da solução de ninhidrina, em seguida colocou-se 5 gotas da solução de proteínas e ferveu a solução durante 2 minutos. Observou-se o que aconteceu na reação.
4.2 Reação do Birueto
Pipetou-se em um tubo de ensaio 1 mL da solução de proteína clara de ovo a 10%, adicionou-se 5 gotas de NaOH 2,5N e 3 gotas de Sulfato de cobre 1%, observou-se a reação. Em outro tubo de ensaio adicionou-se 1mL de água, 3 gotas de sulfato de cobre 1% e 5 gotas de NaOH 2,5N. Observou-se a reação. 
4.3 Reação de precipitação com desnaturação das proteínas
4.3.1 Precipitação por ação do calor: Em um tubo de ensaio adicionou-se 2mL da solução de proteína clara de ovo a 10% com solução salina de NaCl a 0,9% e aqueceu–se diretamente na chama, usando bico de Bunsen. Observou-se a reação.
4.3.2 Precipitação por reação com reagentes para alcaloides: Em um tubo de ensaio adicionou-se 1 mL da solução de proteína de clara de ovo a 10% com solução salina de NaCl a 0,9% e 1 mL de Ácido tricloroacético a 10%. Observou-se a reação.
4.3.3 Precipitação por reação com sais de metais pesados: Em um tubo colocou-se 1 mL da solução de proteína de clara de ovo a 10% e 1mL da solução de acetado de chumbo 5%. Observou-se a reação.
4.3.4 Precipitação por ação de solvente orgânico: Em um tubo de ensaio colocou-se 1 mL da solução de proteína de clara de ovo a 10% e adicionou-se de 3mL de álcool etílico e observou-se a reação. 
4.4 Reação de precipitação sem desnaturação
4.4.1 Efeito da força iônica sobre a solubilidade das proteínas
a) Técnica - Solubilização “salting-in”
Pipetou-se 3 mL de clara de ovo em um béquer. Diluiu-se com água destilada mexendo com bastão de vidro, até notar o aparecimento de um precipitado. Em seguida adicionou-se a solução de cloreto de sódio, gota a gota, observou-se a reação.
b) Técnica - Solubilização “salting-out”
Pipetou-se 2 mL de solução obtida na experiência anterior (salting-in) em um tubo de ensaio e adicionou-se 2 mL de solução saturada de sulfato de amônio assim observou-se a formação de precipitado de proteínas o que corresponde ao fenômeno “salting-out”. Em seguida adicionou-se 6 mL de água destilada. Observou-se a reação.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Reação de ninhidrina
Neste experimento observamos que, devido ao aquecimento da solução de ninhidrina e a proteínas, apareceu uma coloração azul violeta. Isto se deu pelo fato das proteínas terem um grupamento amino livre que produz um composto púrpura.
5.2 Reação do Birueto
Neste experimento observamos que, devido a adição da solução de Biureto (Sulfato de Cobre e Tartarato de Sódio e Potássio) e a proteínas, apareceu uma coloração violeta. Isto se deu pelo fato das interações entre as ligações peptídicas de uma proteína com íons Cu2+.
Pelo fato do outro tubo de ensaio não possuir proteínas, não ouve interações entre as ligações peptídicas das proteínas e o os íons de Cu2+, portanto esta solução ficou com um tom azul translúcido.
5.3. Reação de precipitação com desnaturação das proteínas
5.3.1 Precipitação por ação do calor: 
Neste experimento observamos que, devido ao aquecimento ocorreu a formação de um precipitado. Isto se deve ao fato das proteínas, por causa da sua estrutura, serem muito sensíveis ao calor. Ou seja, quando as proteínas são aquecida, o calor desorganiza as ligações peptídicas alterando a sua estrutura, isto faz com que a solubilidade da proteína diminua e se precipite.
5.3.2 Precipitação por reação com reagentes para alcaloides: 
Foi possível identificar a formação de um precipitado esbranquiçado e viscoso grudado na parede do tubo logo que se adicionou o ácido tricloroacético (TCA).
Nesse experimento, o sal serve como ‘ponte’/interage entre a proteína e o meio, auxiliando assim, as interações proteína-água. O fato de se adicionar ácido tricloroacético solução de proteínas, reduz o pH do meio, tornando positiva a carga da proteína, o que contribui para a formação de um complexo insolúvel – o tricloroacetato de proteína. Além disso, vale ressaltar que o sal atua como uma ponte entre a proteína e o meio. Adicionando-se o ácido, diminui a concentração de sal e a interação proteína-água.
5.3.3 Precipitação por reação com sais de metais pesados
Neste experimento constatamos que, ao utilizar a solução de acetato de chumbo, houve a formação de precipitado. Isto ocorreu devido ao cátion de Chumbo, que é um metal pesado, interagir com a proteínas por causa do ponto isoelétrico e formar precipitados insolúveis de proteínas
5.3.4 Precipitação por ação de solvente orgânico: 
Neste experimento constatamos que, ao utilizar solventeorgânicos, houve a formação de precipitado. Isto se deu ao fato das proteínas realizar interações entre o solvente e entre elas, como a interação de solvente e proteínas é fraca, prevaleceu a interação proteínas-proteínas, onde esta interação se sobressai e consequentemente precipita. 
5.4	Reação de precipitação sem desnaturação
5.4.1 Efeito da força iônica sobre a solubilidade das proteínas
a) Técnica - Solubilização “salting-in”
Neste experimento quando adicionamos sais neutros a uma solução, ocorre um aumento da força iônica do sistema. Assim, quando adicionamos pequenas quantidades de sal a uma solução contendo proteínas, as cargas provenientes da dissociação do sal passam a interagir com as moléculas protéicas, diminuindo a interação entre elas. Consequentemente, temos um aumento da solubilidade da proteína no meio aquoso. As interações proteína - proteína, favorecendo a solubilidade das mesmas. A esse fenômeno dá-se o nome de "salting-in"
b) Técnica - Solubilização “salting-out”
Neste experimento constatamos que em uma solução aquosa de proteína à qual foi adicionada uma certa quantidade de sal neutro. A água, que apresenta um grande poder de solvatação, passa a interagir com as duas espécies: as proteínas e os íons provenientes da dissociação do sal. Porém, as moléculas de água apresentam maior tendência de solvatação de partículas menores (nesse caso, os íons). As moléculas de água, ocupadas em sua interação com os íons, "abandonam" a estrutura protéica. Como consequência, temos: maior interação proteína-proteína, diminuição da solubilidade em meio aquoso e consequentemente, precipitação da proteína. A esse fenômeno de insolubilização da proteína em decorrência de um considerável aumento da força iônica do meio dá-se o nome de "salting-out".
ANEXOS
1-	 Em que se fundamenta a reação de Ninhidrina e que classes de substâncias dão positivas com esta reação?
Essa reação é feita para verificar a presença de aminas em solução, dando positivo para proteínas, peptídeos, aminoácidos, aminas primárias e amônia. A reação é muito importante, pois é universalmente utilizado para detectar qualitativamente e quantitativamente os aminoácidos. Para os aminoácidos esta é a única reação de coloração verdadeiramente importante. A Ninhidrina reage com aminoácidos produzindo cor púrpura.
2-	Em que se fundamenta a reação do biureto e que grupos nas proteínas são responsáveis por esta reação?
Biureto é o nome dado à estrutura originada a partir da decomposição da ureia, quando esta é submetida a uma temperatura de aproximadamente 180º C. 
As proteínas contêm duas ou mais ligações peptídicas que dão resultado positivo neste teste. A reação é também positiva para as substâncias que contém dois grupos carbamínicos (-CO-NH2) ligados diretamente ou através de um único átomo de carbono ou nitrogênio.
3-	Qual a importância da reação do biureto?
É importante para demonstrar a presença de proteínas em materiais biológicos, como também para quantificá-las.
4-	Qual é a importância das reações de precipitação de proteínas por agentes dos alcaloides e por sais de metais pesados? Procure explicar os mecanismos das precipitações.
Essa precipitação é mais intensa quando o pH está a cima do ponto isoelétrico. Isso porque, acima do ponto I, a carga líquida sobre a proteína é negativa, favorecendo a interação com os cátions provenientes do sal. Quando a proteína está a baixo do seu pI, a carga líquida total da molécula é positiva. Isso facilita a interação da molécula com os ânions provenientes de ácidos como o tungístico, o fosfotunguístico e pícrico. Nas duas situações o precipitado pode ser ressolubilizado através de alterações do pH. Verifica-se que na adição de sais de metais pesados como de ácidos orgânicos fortes ocorreram precipitação.
5-	Que mudanças podem ocorrer numa proteína, quando em contato com etanol?
A solubilidade das proteínas em solventes orgânicos é menor do que em água, porque a capacidade de interação com as partículas do soluto é diferente para cada solvente. A grandeza que mede a capacidade de interação do solvente com o soluto é denominada constante dielétrica.
Os solventes orgânicos apresentam valor de constante dielétrica bem inferior à da água, a interação proteína-proteína "vence" o poder de solvatação da água. A proteína precipita. A precipitação por solventes orgânicos depende muito da temperatura. Os solventes orgânicos, quando utilizados a temperaturas baixas, são bastante úteis na separação de misturas de proteínas. As temperaturas mais elevadas esses solventes podem levar à desnaturação por rompimento das pontes de hidrogênio e estabelecimento de interações apolares.
6-	As solubilidades de duas proteínas em função da concentração de sulfato de amônio estão mostradas no diagrama. Como esta observação pode ser usada para separar as proteínas A e B?
Sais neutros ao serem adicionados, principalmente sulfato de amônio a elevadas concentrações reduz a disponibilidade da água devido à hidratação dos íons criando condições para a precipitação, a qual ocorre principalmente por interação das zonas hidrófobas. O sal e outros precipitantes não provocam a precipitação de todas as proteínas do meio, pois o seu efeito é de reduzir a solubilidade. A concentração do sal ou do solvente que provoca a precipitação varia com a concentração da proteína e a presença de outras proteínas contaminantes
7-	Explique os mecanismos que levam uma proteína a dissolver-se por um pequeno aumento na força iônica da solução e os mecanismos que levam uma proteína a precipitar por um grande aumento na força iônica da solução?
Ao adicionar sais neutros ocorre um aumento da força iônica. Os íons carregados provenientes da dissociação dos sais passam a interagir com as moléculas proteicas, diminuindo a interação entre as próprias moléculas da proteína. Deste modo, temos um aumento na solubilidade da proteína em meio aquoso. Esse fenômeno dá-se o nome de salting-in.
Em condições de elevada força iônica, as moléculas de água apresentam maior tendência de solvatação de partículas (nesse caso, os íons). As moléculas de água, desse modo, interagem mais com os íons desfazendo suas interações com a estrutura proteica. Como consequência, temos: maiores interações proteína-proteína, resultando na diminuição da solubilidade em meio aquoso. A esse fenômeno dá-se o nome de salting-out.
CONCLUSÃO
Conclui-se que as proteínas possuem uma estrutura tridimensional bem definida que está relacionada com as propriedades físicas e biológicas. A modificação na estrutura tridimensional nativa de uma proteína, com a consequente alteração de suas propriedades é conhecida como desnaturação. A desnaturação envolve alterações nas estruturas quaternárias, terciárias e secundarias de proteínas, mas não da primaria. A desnaturação, usualmente decresce a solubilidade das proteínas. A diminuição da solubilidade pode ser explicada pela exposição de radicais hidrofóbicos e outros que prejudiquem a interação proteína-água e favoreçam a interação proteína-proteína. A desnaturação é o evento primário e importante. A floculação e a coagulação, que muitas vezes são confundidos com desnaturação de proteínas, são simplesmente manifestações visíveis das alterações estruturais causadas pelos agentes desnaturantes. 
Existem vários agentes desnaturantes de proteínas, tais como: calor, ácidos, álcalis, solventes orgânicos, soluções concentradas de uréia e guanidina, detergentes, sais de metais pesados, etc. Entre as alterações que se observam em decorrência da desnaturação proteica, pode se citar: diminuição da solubilidade, perda de atividade biológica (por exemplo, da ação enzimática, da ação hormonal), aumento da reatividade de radicais da cadeia polipeptídica, alterações na viscosidade e coeficiente de sedimentação, etc. A precipitação com desnaturação, além de serem utilizadas para caracterizar a presença de proteínas em solução, tambémsão úteis para proceder a desproteínação de líquidos biológicos para análise de componentes não proteicos. 
REFERÊNCIAS
LEHNINGER, A.L.; NELSON, D.L.; COX, M.M. Princípios de Bioquímica. 2. ed. São Paulo: Sarvier, 2000. 839p.
<http://mundoeducacao.bol.uol.com.br/biologia/peptideos.htm>. Acesso em 03 de abril de 2018.
<https://www.infoescola.com/bioquimica/ligacao-peptidica>. Acesso em 03 de abril de 2018.