Controle de qualidade microbiológico- água

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Controle de Qualidade Microbiológico da Água
Importância da qualidade da
água para fins farmacêuticos
SISTEMA EXTREMAMENTE CRÍTICO
MP MAIS IMPORTANTE (> volume)
PRODUTOS SUSCEPTÍVEIS
Envolvida em processos industriais:
Lavagem
Limpeza
Vapor (esterilização) / testes laboratoriais
Importância da qualidade da
água para fins farmacêuticos
Tipos principais águas em processos farmacêuticos :
Água purificada (PW)
Água p/ injeção (WFI)
Obtidas do tratamento de fonte de ÁGUA POTÁVEL
PW
Obtida por ⇒ Destilação, Troca Iônica ou Osmose Reversa
Formas farmacêuticas não estéreis (orais / tópicas)
Não deve ser usada para injetáveis
WFI
Obtida por ⇒ Destilação ou Osmose Reversa (OR)
Melhor caso ⇒ destilação PW obtida por OR-Duplo passo
Não deve ser obtida por Troca Iônica ⇒ proliferação MO’s
Uso em formas farmacêuticas estéreis
Sistemas de purificação
A- TROCA IÔNICA
Resina catiônica e seguida de uma aniônica
NÃO remove material orgânico dissolvido (TOC),
MO’s e endotoxinas
B- OSMOSE REVERSA – OR
- Alta pressão / membrana semipermeável
Filtração Tangencial ⇒ Remoção partículas e MO’s por flush (rejeito)
Remove endotoxinas, MO’s (99%), TOC e inorgânicos
Armazenamento e Distribuição
Anel de circulação (loop) e tanques ⇒
AÇO INOX 316 L ELETROPOLIDO (ancoragem /acúmulo de nutrientes)
Respiros do tanque de armazenamento com FILTROS 0,22 µm hidrofóbicos (teste de integridade periódico)
Válvulas SANITÁRIAS ⇒ tipo diafragma ⇒ SISTEMA SEM PONTOS MORTOS
Cloração
MUITO CRÍTICA P/ O CONTROLE MICROBIANO ⇒ Teor de Cl: 1,5 a 2,0 ppm (mínimo 1,0 ppm) na entrada (controlar c/ bomba dosadora)
⇒ pH ácido (5,5 a 6,5)
⇒ CONSUMO ⇒MAT. ORGÂNICA e Fe2+ (oxidação)
Remoção do Cloro - o mais próximo possível da geração da água PW.
REDUÇÃO MÁXIMA DA BIOCARGA NA ALIMENTAÇÃO
 É PRIMORDIAL P/ O CONTROLE DO SISTEMA
Sanitização - Tipos
TÉRMICA (Água/Vapor Fluente) e/ou
QUIMICA (Ozônio, AP,H2O2, NaOH, Glutaraldeído,etc)
- 1 ª opção - Á quente (> 80 ºC) – BF
- 2 ª opção - Ozônio (O3) (0,04 / 0,05 ppm) – BF
- 3 ª opção - Á frio (⇓ 15 ºC)- ⇓ proliferação MO
EM TODO SISTEMA ⇒ DISTRIBUIÇÃO / VÁLVULAS
COMBINAÇÃO DE MÉTODOS DE SANITIZAÇÃO PERIÓDICOS ENFRAQUECEM OS BIOFILMES
Sanitização - Frequência
 A- Programada:
Determinada na Qualificação (monitoramento):
Semanal, mensal, trimestral ou parada anual
 
B- Não programada:
Contagem próximo ou acima do limite de alerta ou no limite de ação (emergencial)
Alteração, intervenção/manutenção no sistema
BIOFILMES
Agregados de microrganismos embebidos em uma matriz polimérica e aderidos a uma superfície 
Produção de EPS e glicocálice
⇒ ADESÃO MO / NUTRIENTES, PROTEÇÃO
Competição por nutrientes e metabólitos tóxicos limitam crescimento e a diversidade (equilíbrio)
Sésseis – fixas em biofilmes (95%)
Planctônicas – livres “flutuantes” (5%)
BIOFILMES
1. INÍCIO com Células “pioneiras” livres -PLANTÔNICAS)
⇓ [ ] nutrientes
⇓ replicação - ⇓ citoplasma (só DNA) = ⇓ vol.Celular
⇓ metabolismo - Energia p/ locomoção / integridade 
2. ADESÃO-Colonização/crescimento em superfícies:
⇑ DNA / ⇑ parede celular / ⇑ cito = vol. Celular normal
Taxa de crescimento proporcional à disponibilidade de nutrientes
Produção de EPS (Slime)
Etapas da Formação do Biofilme
1 ª - Adesão
2 ª - Maturação
3 ª - Ruptura, desadesão ou dispersão
Adesão
A) Aproximação: aleatória, quimiotaxia ou
motilidade do MO
B) Forças de atuação: eletrostáticas, ligações covalentes, etc.
C) Fatores de adesão: CÁPSULA, GLICOCÁLICE (cápsula não-verdadeira), fimbrias, flagelos
Maturação
Ocorre em dias ou ao longo de anos
PRODUÇÃO DE EXOPOLISSACARÍDEOS (EPS) e desenvolvimento de microcolônias –
Irreversível sem ação mecânica e /ou química
Ruptura ou Dispersão
Massa crítica / equilíbrio dinâmico
Liberação de células da periferia ou por
fragmentação (multiplicação, colonização e
formação de novos biofilmes)
Ausência de nutrientes, O2, metabólitos tóxicos
Desintegração do biofilme
Como evitar a formação de BF’s ?
A) PROJETO de purificação adequado
B) Medidas de CONTROLE DA CONTAMINAÇÃO
⇒Pré-tratamento / Sanitização / Manutenção do sistema
C) MONITORAMENTO MICROBIOLÓGICO
CONTÍNUO E APROPRIADO
MONITORAMENTO MICROBIOLÓGICO
CONTÍNUO E APROPRIADO
1- Contemplar os PONTOS CRÍTICOS do sistema
2- FREQÜENTE
3- Monitorar INDICADORES (UFC e P. aeruginosa)
4- METODOLOGIA APROPRIADA
5- ANÁLISE DE TENDÊNCIAS
Microbiota do sistema de água
Enterobactérias:
Contaminante eventual / geralmente pontual
< sobrevida
Leveduras e bolores ⇒ relativamente raros
Geralmente própria de cada sistema: investigação eventualmente indica a possível fonte da contaminação ⇒ PLANO DE AÇÃO
ANÁLISE MICROBIOLÓGICA
DE ÁGUAS (Potável, PW, WFI)
MO’s de escolha geralmente pesquisados:
A- Heterotróficos (Contagem Total)
B- Coliformes totais e fecais
C- Pseudomonas aeruginosa
Metodologias Oficiais /Especificações
Farmacopéias (EP, USP, JP, Brasileira, etc.):
Água purificada: Máx:100 UFC/mL
Água para injeção: Máx:10 UFC/100mL
(0,25 EU/ml - Endotoxinas)
Contagem total
Indicador geral da qualidade sanitária
Avaliação geral da eficiência dos tratamentos ⇒ Cloração, filtração, etc.
Coliformes totais e fecais
Indicadores sanitários da qualidade da água
Crescem na presença de sais biliares / LAC+
Controle de Qualidade Microbiológico da Água
 1) Introdução
Os microrganismos indicadores vêm sendo utilizados na avaliação da qualidade microbiológica da água há longo tempo, devido às dificuldades encontradas na detecção de microrganismos patogênicos, como, por exemplo, Salmonella typhi. 
Estes microrganismos indicadores são grupos ou espécies de microrganismos que, quando presentes podem fornecer informações sobre a ocorrência de contaminação de origem fecal, ou sobre a provável presença de patógenos. 
Controle de Qualidade Microbiológico da Água
 2) Grupo Coliformes
O grupo de coliformes totais (20 espécies) incluem as bactérias na forma de bastonetes Gram-negativos, não esporogênicos, aeróbios ou anaeróbios facultativos, capazes de fermentar a lactose com produção de gás, em 24 a 48 horas a 35°C, podendo ou não ser originárias do tratogastrointestinal.
Controle de Qualidade Microbiológico da Água
 2) Grupo Coliformes
Os coliformes fecais restringe-se aos membros capazes de fermentar a lactose com produção de gás, em 24 horas a 44,5 -45,5°C. 
Atualmente sabe-se que o grupo dos coliformes fecais inclui pelo menos três gêneros, Escherichia, Enterobacter e Klebsiella, dos quais dois (Enterobacter e Klebsiella) incluem cepas de origem não fecal. 
Por este motivo, a presença de coliformes fecais é menos representativa, como indicação de contaminação fecal, porém, muito mais significativa do que a presença de coliformes totais, dada alta incidência de E.coli dentro do grupo fecal. 
Controle de Qualidade Microbiológico da Água
 3)Descloração 
Quando se trata de coletas de água clorada, há necessidade de adicionar ao frasco de coleta um agente desclorante, que neutraliza o cloro residual e evita a continuidade de ação bactericida. A adição de 1 mL de uma solução de 1% de tiossulfato de sódio neutraliza 15ppm numa amostra de 100mL.
Controle de Qualidade Microbiológico da Água
 4)Transporte
A amostra deve ser submetida a análise o mais cedo possível, de preferência dentro da primeira hora. Caso não seja possível, há necessidade de refrigeração das amostras após a coleta, sendo que o tempo máximo entre a coleta e a análise é de 24 horas aproximadamente. 
Controle de Qualidade Microbiológico da Água
 4) Número e tamanho da amostra
Resultados da amostra examinada são significativos somente quando esta for representativa da água que esta sendo examinada. 
Deve-se coletar a água da origem de fornecimento (copasa) de cada processamento que esta água sofre (deionização, destilação, etc) dos reservatórios e da água tal qual entra como matéria prima em um determinado produto. 
A quantidade da amostra não deveser inferior a 100 mL . 
Controle de Qualidade Microbiológico da Água
5)Técnica de amostragem 
Material 
Álcool 70% (v/v) 
Frasco de amostragem: Frasco (vidro) contendo 4mL de tiossulfato de sódio 2% esterilizado em autoclave (121°C por 15 minutos) 
Saco estéril 
Luva, máscara, gorro e avental de manga comprida 
Controle de Qualidade Microbiológico da Água
 Procedimento de amostragem 
O frasco de amostragem/saco deverá estar devidamente identificado com as seguintes considerações: ponto de coleta, local, data, hora, nome do amostrador e classificação da água. 
O amostrador deverá estar devidamente vestido com máscara, gorro e avental de manga comprida.
Aspergir álcool 70% em toda superfície externa da torneira em que se deseja coletar a amostra. 
Realizar o procedimento de lavagem das mãos.
Calçar a luva e aspergir álcool.
Abrir a torneira e deixar escoar água por 2 minutos. 
Durante o período de escoamento, retirar a tampa do frasco ou o lacre do saco e coletar a amostra.Fechar rapidamente o frasco. 
Analisar o mais rápido possível.
Controle de Qualidade Microbiológico da Água
 6) Identificação e contagem de coliformes totais e fecais empregando a técnica do Número Mais Provável (NMP) 
 A ) Introdução 
O processo é um teste quantitativo que conjuntamente é utilizado para identificação de coliformes totais e fecais. Este método baseia-se no conhecimento da distribuição Poison e é normalmente praticado para amostras reconhecidamente de baixa contaminação , como se pretende sejam as águas. 
Em um meio de cultura líquido, à partir de uma amostra representativa, se colocam várias séries de diluições (séries decimais) paralelas. Cada diluição deve ser incubada em triplicata ou quintuplicata, adicionando a cada tubo contendo 10mL de Caldo Lauril Triptose ou Caldo Lactosado, 1mL da diluição correspondente. 
Controle de Qualidade Microbiológico da Água
Depois da incubação a 35°C por 24 ou 48 horas, determina o número mais provável a partir dos tubos onde houve crescimento e formação de gás. Os meios de cultura empregados para o teste devem ser preparados com tubos de Durham para confirmação da formação de gás. 
O número de tubos positivos de cada série, constituem a fórmula que se buscará na tabela apropriada (Tabela de Grady) para determinar o número provável por mL, levando-se em consideração o fator de diluição aplicado. 
Controle de Qualidade Microbiológico da Água
 B) Preparo da amostra 
Porções de 10mL de água amostra são colocados em recipiente contendo 90mL de diluente e homogeneizados vigorosamente (diluição 1/10). 
Adiciona-se ao tubo contendo 9mL de diluente, 1 mL da solução anterior dando origem a (diluição 1/100); 
Em outro tubo contendo 9mL de diluente acrescentar 1mL da solução anterior ( diluição 1/1000 ) e da mesma forma deve-se produzir a solução 1/100000. 
Controle de Qualidade Microbiológico da Água
Controle de Qualidade Microbiológico da Água
 C) Ensaio Presuntivo 
Fundamento: Muitas das bactérias incluindo todas enterobactérias, utilizam o carboidrato. A lactose é um dissacarídeo composto por glicose e galactose ligadas através de uma ligação galactosídica. Por hidrólise, esta ligação é destruída, formando glicose e galactose. 
A ß-galactosídeo permease é responsável pela transmigração de ß-galactosídeo através da parede celular e a ß-galactosidase é responsável pela hidrólise da lactose. 
 
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C) Ensaio Presuntivo 
 
É um processo denominado fermentação ácida mista, através da qual é finalmente produzida uma variedade de ácidos orgânicos, derivados do ácido pirúvico. Dentre os ácidos, o ácido fórmico, no entanto, é degradado pela formiase liberando H2 e CO2.
 
Ensaio: Contendo 10mL de caldo lactosado com tubo de fermentação de Durhan. Incubar a temperatura de 35°C. A evidenciação de crescimento microbiológico com produção de qualquer quantidade de gás 24 ou 48 horas de incubação é caracterizado como ensaio presuntivo positivo. 
Controle de Qualidade Microbiológico da Água
Controle de Qualidade Microbiológico da Água
 D) Ensaio confirmativo
 
Uma porção de cultivo presuntivo positivo é transferido para meio sólido de Ágar Mac Conkey e ágar Eosina Azul de Metileno , que são incubadas a 35°C após 24 e 48 horas. 
Resultado positivo para coliformes: 
Ágar Mac Conkey: colônias vermelhas 
Ágar Eosina Azul de Metileno: colônias pretas com superfície esverdeada.
Controle de Qualidade Microbiológico da Água
Agar Mac Conkey: é diferencial para a seleção e isolamento de enterobactérias e bacilos entéricos Gram-negativos. Os sais biliares e cristal violeta de sua composição evitam o crescimento de bactérias Gram-positivas e algumas bactérias Gram-negativas. A lactose é o único carboidrato. As bactérias fermentadoras de lactose produzem colônias de diferentes tons de vermelho, devido à viragem do indicador neutro (vermelho em pH abaixo de 6,8) pela produção de ácidos mistos.As colônias de bactérias não -fermentadoras aparecem incolores ou transparentes. 
Ágar eosina azul de metileno: é um meio diferencial que pode ser usado também para o isolamento e detecção de enterobactérias ou dos bacilos coliformes a partir de amostras com bactérias mistas. Os corantes anilina (eosina azul de metileno) inibem o crescimento de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas existentes. Combinam-se formando um precipitado em pH ácido e desta forma, atuam também como indicadores de produto ácido. 
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 E) Ensaio completo
 
 Uma mesma colônia desenvolvida na placa de EMB ou Mac Conkey, é repicada para dois tubos, um contendo ágar inclinado (TSA) e o outro contendo caldo lactosado com tubo de Durhan. O caldo lactosado é incubado por 24-48 horas, ambos a 35°C. A partir da cultura em ágar inclinado preparar em lâmina de vidro esfregaços corados pelo método de Gram e observar ao microscópio usando objetiva de imersão. 
Prova completa positiva: bacilos Gram negativos, não esporulados, que atacam a lactose com produção de gás. 
Prova completa negativa: falta de pelo menos um dos requisitos de prova completa positiva. 
Controle de Qualidade Microbiológico da Água
 F) Determinação de coliformes fecais
Pode ser presumido através da prova de temperatura elevada, ou através das provas bioquímicas. 
Prova de temperatura elevada: Com o auxilio de uma alça de platina, transferir um material dos tubos de caldo lactosado, presuntivos positivos, para um mesmo número de tubos contendo o meio EC Broth ou Lauril Sulfato Triptose Broth , incubando a seguir a temperatura de 44,5 por 24 horas. A produção de gás dentro de 24 horas, é considerada positiva para presença de coliformes fecais e sua densidade numérica é calculada pelo emprego da tabela de NMP. 
Controle de Qualidade Microbiológico da Água
 Para obter o NMP, proceda como se segue: 
Escolha a mais alta diluição em que cinco tubos são positivos, e as outras duas maiores diluições. Se isso não for possível porque nenhuma das diluições produziram cinco tubos positivos ou porque diluições subseqüentes não foram feitas, escolha as últimas três diluições e anote o número de positivos em cada. 
Exemplo: se as três últimas diluições foram 1/100, 1/1000 1/10000 e o número de tubos positivos para cada diluição foi 5,3 e 1 respectivamente aos resultados são anotados como 1/100,5; 1/1000, 3; 1/10000,1. 
Consultando a tabela , isso leva NMP de 110 por 100mL de amostra. 
Controle de Qualidade Microbiológico da Água
OBS:NMP em cinco tubos é o método mais apurado, mas o teste pode ser executado usando 3 ou 4 tubos para cada diluição. 
 Tabela McGrady
Verificar tabela
Técnica da Membrana Filtrante para análise de água
A) Equipamentos,materiais e meios utilizados:
Unidade filtrante, empregada na filtração da amostra, consta de : 
Base do filtro ou receptáculo: serve para sustentar a membrana filtrante. Apresenta-se como uma placa de aproximadamente 50mm de diâmetro, a parte central é um disco poroso de superfície lisa na parte externa. 
Funil: encerra a amostra até que ela passe através da membrana filtrante. A parte inferior do funil é um anel achatado que se apóia sobre a parte externa da membrana filtrante, diretamente sobre a parte não porosa da placa. 
Garra: serve para unir a base 
Bomba de vácuo: Usada para apressar a filtração, é ligada a uma frasco kitassato onde está montada a unidade acima descrita. 
Membrana filtrante: discos de ésteres de celulose com porosidade igual ou menor que 0,45 µm. 
Técnica da Membrana Filtrante para análise de água
B) Procedimento 
Monte o sistema filtrante, estéril. Trabalhe em ambiente asséptico, com técnicas de assepsia. Passe através da membrana volume conhecido da amostra de água 
 (100mL). 
Retire a membrana do suporte ( base ) e coloque-a sobre a superfície do meio de cultura contido na placa, evitando a formação de bolhas de ar, e mantendo a posição da membrana.
Incube a placa invertida a 35°C por 48 horas.
Técnica da Membrana Filtrante para análise de água
C) Interpretação
 
Coliformes totais: a coloração da colônia típica vai de róseo a vermelho escuro com brilho metálico que poderá ser central ou cobrir toda a superfície da colônia. 
Os coliformes podem dar colônias atípicas. Se encontradas em grande número devem ser identificadas. 
Para a contagem de bactérias, contar as colônias presentes na membrana.
Os resultados serão expressos em número de colônias por volume filtrado. 
Técnica da Membrana Filtrante para análise de água
Placas para culturas: placas de Petri contendo cerca de 20mL de meio de cultura estéril 
Meio de Cultura: para determinação de microrganismo totais utiliza-se TGE. 
Coliformes fecais utiliza-se o meio Endo- Agar ou mFC. 
Contagem de Bactérias Mesófilas aeróbias totais e fungos através de plaqueamento 
Consiste na semeadura da amostra diluída ou não em placa de Petri estéril, a qual é acrescentado cerca de 20mL do meio de cultura TSA estéril fundido e resfriado aproximadamente 45°C. 
Incubar 48 horas a 35°C. 
Efetuar a contagem confrontando a mesma com a especificação da amostra. 
Determinação de Bactérias mesófilas aeróbias totais, fungos e coliformes totais utilizando a técnica de semeadura em profundidade
Esta técnica é empregada para determinação direta de coliformes pela técnica de Pour-plate que consiste em adicionar o meio de interesse sobre a placa contendo a amostra e efetuar movimentos giratórios para homogeneização dos mesmos. 
As placas devem ser colocadas de forma invertida e incubadas a temperatura de 35°C por 48 horas. Para investigação de coliformes totais emprega-se o meio Mca Conkey, no entanto, deve-se confirmar a presença de coliformes ( fermentação de lactose ) inoculando as colônias isoladas no meio MacConkey para tubos com caldo Lactosado contendo tubos de Duharam (crescimento com produção de gás). 
Para avaliação de bactérias mesófilas totais e fungos utiliza-se a mesma metodologia empregando bactérias e fungos utilizando os respectivos meios TSA e SAB (adicionar solução de Cloranfenicol 1% no momento do resfriamento do ágar para execução do ensaio). Todas as análises devem ser realizadas em duplicata.
Determinação de Bactérias mesófilas aeróbias totais, fungos e coliformes totais utilizando a técnica de semeadura em profundidade
Determinação de Bactérias mesófilas aeróbias totais, fungos e de coliformes totais utilizando a técnica de semeadura em profundidade
 Limites de Contaminação microbiana para água destinada a produção: 
Potável: Máx 500 UFC/mL	
Purificada (PW): Máx 100 UFC/mL 
Água para injeção (WFI): 10 UFC/100mL 
Pseudomonas aeruginosa
Indicadora da presença de matéria orgânica
[ ] baixas TOC - OLIGOTROFISMO
Tendência a formação de biofilmes (!!)
Síntese de cápsula - Formas “Slime” (mucóides):
Maior resistência e adesão – BF 
Ágar Cetrimide
Ágar Cetrimida ⇒ USP / EP