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INSTITUTO FEDERAL DE EDUCAÇÃO, CIÊNCIA E TECNOLOGIA DO TRIÂNGULO MINEIRO – Campus Uberaba MESTRADO PROFISSIONAL EM CIÊNCIA E TECNOLOGIA DE ALIMENTOS JOÃO PAIXÃO DOS SANTOS NETO OCORRÊNCIA DE AERÓBIOS MESÓFILOS, COLIFORMES E Salmonella sp., EM OVOS COMERCIAIS HIGIENIZADOS POR DIFERENTES MÉTODOS UBERABA, MG 2016 JOÃO PAIXÃO DOS SANTOS NETO OCORRÊNCIA DE AERÓBIOS MESÓFILOS, COLIFORMES E Salmonella sp., EM OVOS COMERCIAIS HIGIENIZADOS POR DIFERENTES MÉTODOS Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos, do Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Triângulo Mineiro, como requisito para conclusão e obtenção do Título de Mestre em Ciência e Tecnologia de Alimentos. Orientadora: Profa. Dra. Carolina Rodrigues da Fonseca Co-Orientadora: Profa. Dra. Elaine Donata Ciabotti UBERABA, MG 2016 JOÃO PAIXÃO DOS SANTOS NETO OCORRÊNCIA DE AERÓBIOS MESÓFILOS, COLIFORMES E Salmonella sp., EM OVOS COMERCIAIS HIGIENIZADOS POR DIFERENTES MÉTODOS Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos, do Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Triângulo Mineiro, como requisito para conclusão e obtenção do Título de Mestre em Ciência e Tecnologia de Alimentos. Aprovada em 24 de Setembro de 2016 Banca Examinadora _________________________________________________________________ Profa. Dra. Carolina Rodrigues da Fonseca (Orientadora) – IFTM, Campus Uberaba _________________________________________________________________ Profa. Dra. Fernanda Barbosa Borges Jardim – IFTM, campus Uberaba _________________________________________________________________ Profa. Dra. Mônica Hitomi Okura – Universidade Federal do Triângulo Mineiro UBERABA, MG 2016 Dedico este trabalho a minha rainha (mãe), Luzenir Paixão dos Santos, pois todo sonho que se sonha junto é realidade. AGRADECIMENTOS Agradeço a Deus, pelo dom da vida. A minha avó do coração Geruza (In memoriam), saudades eternas. A minha família, em especial minha mainha Luzenir, minhas irmãs Jackelliny e Joanny, meus sobrinhos Maria Ryta e Cicero Hiago. Ao Instituto Federal do Triângulo Mineiro, campus Uberaba, por proporcionar a oportunidade de ingressar no mestrado e desenvolvimento do projeto de pesquisa. A orientadora Dr.ª Carolina Fonseca, pela orientação e por compartilhar seus conhecimentos de vida e ciência. A co-orientadora Dra. Elaine Ciabotti pelos incentivos e pelas contribuições estatísticas. A Dra. Mônica Okura pela disponibilidade de participar da banca e por ceder o seu laboratório. Aos componentes da banca de qualificação, Dra. Fernanda Jardim e Dr. Gabriel Nascentes por todas as correções e sugestões importantes para o andamento deste trabalho. Aos meus colegas da turma de mestrado (2014), em especial três pessoas que se tornaram minhas amigas a ‘best friend’ M.ª Cindy, a minha ‘preta’ Suelen e a ‘parceira’ Cristielle. A técnica Cintia Oliveira por ter me ajudado na condução do experimento, sem você não teria conseguido. Aos meus amigos de longas datas Edjamir Silva e Tarcísio Rodrigues, mesmo distantes sempre estamos juntos. A Tia Lúcia Mendonça, minha professora e amiga por quem tenho enorme carinho, a qual foi a primeira pessoa que me ajudou a seguir este objetivo. A mainha do coração Márcia Carvalho pelos primeiros ensinamentos em suas aulas de reforço e carinho. A Raphaela Viana pelos incentivos e por me ceder a estadia durante a realização do experimento, me senti em casa. A tantas outras pessoas que direta ou indiretamente me ajudaram a realizar este objetivo. Meu muito obrigado! RESUMO Ocorrência de aeróbios mesófilos, coliformes e Salmonella sp., em ovos comerciais higienizados por diferentes métodos. A finalidade deste estudo foi analisar a ocorrência de micro-organismos em ovos in natura comerciais higienizados por diferentes procedimentos. Os ovos coletados da granja foram selecionados de forma aleatória e submetidos à simulação dos procedimentos de lavagem e higienização industrial com cloro e ácido peracético em diferentes concentrações. Foram avaliadas as populações na casca e conteúdo interno de mesófilos aeróbios, do grupo dos coliformes, além da pesquisa de Salmonela sp. segundo Silva et al. (2010) afim de avaliar a eficácia da sanitização na qualidade microbiológica. Em todas as amostras estudadas foi verificado contagem total de mesófilos aeróbios de até 2,4 x 102 UFC g-1, para o grupo dos coliformes totais foi encontrado até >110 NMP g-1 e para coliformes termotolerantes até 24 NMP g-1. Em uma amostra proveniente da higienização com sanitizante a base de cloro (5,5%) foi observada a presença de Salmonella sp. Concluiu-se que para o procedimento de higienização faz-se necessária uma pré-seleção visual dos ovos, com intuito de retirar da linha de higienização os que apresentarem alguma sujidade, otimizando a ação do sanitizante, e que a água e cloro 100 ppm foram mais eficazes para a redução de micro- organismos. Palavras-chave: avicultura, micro-organismos, limpeza, sanitização, cloro, ácido peracético. ABSTRACT Occurrence of aerobic mesophilic, coliforms and Salmonella sp. in commercial eggs sanitized by different methods. The purpose this study was analyze the occurrence of microorganisms in in natura commercial eggs sanitized by different cleaning procedures. The eggs collected from factory-farm egg were random shape selected and submitted to simulation process of washing and sanitizing procedures with industrial chlorine and peracetic acid in different concentrations. Mesophilic aerobic and the coliform group populations were evaluated, in addition to research of Salmonella sp. according Silva et al. (2010) in order to evaluate the sanitization effect on microbiological quality of eggs. In all samples was verified total count of aerobic mesophilic of up to 2.4 x 102 CFU g-1, and the result for the group of total coliforms was found to > 110 MPN g-1 for termotolerant coliforms populations rechead up 24 MPN g -1. In a sample (5.5%) that was sanitized with chlorine at 50 ppm, it was observed presence of Salmonella sp. It was concluded that it is helpful and necessary a visual pre-selection of eggs before the sanitization procedure, in order to remove the dirt eggs from the line production, optimizing the action to sanitizer and that just cleaning the eggs with water or using 100 ppm of chlorine were efficient to improve the reduction of micro-organisms populations. Keywords: aviculture, micro-organisms, cleaning, sanitization, chlorine, peracetic acid. SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO .......................................................................................................... 10 2. REVISÃO DE LITERATURA ..................................................................................12 2.1 Avicultura de postura, estrutura e formação do ovo ................................................. 12 2.2 Contaminação microbiológica de ovos..................................................................... 15 2.3 Efeitos da higienização na qualidade microbiológica de ovos ................................. 16 2.4 Os métodos de sanitização de ovos comerciais ........................................................ 18 2.4.1 Aplicação do Cloro ................................................................................................ 18 2.4.2 Aplicação do Ácido peracético .............................................................................. 19 2.5 Contaminação por Salmonella sp. e Escherichia coli em ovos comerciais.............. 20 3. METODOLOGIA ....................................................................................................... 25 3.1 Local e coleta das amostras ...................................................................................... 25 3.2 Procedimentos de lavagem e higienização dos ovos ................................................ 26 3.3 Análise microbiológica da casca e do conteúdo interno dos ovos ........................... 26 3.4 Análise de mesófilos aeróbios .................................................................................. 27 3.5 Análise de coliformes totais e termotolerantes ......................................................... 27 3.6 Análise de Salmonella sp. ......................................................................................... 28 3.7 Análise estatística ..................................................................................................... 29 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................... 30 4.1 MICROBIOLOGIA DAS CASCAS ........................................................................ 30 4.1.1 Contagem de Mesófilos Aeróbios ......................................................................... 30 4.1.2 Contagem de Coliformes Totais e Termotolerantes .............................................. 33 4.1.3 Ocorrência de Salmonella sp. ................................................................................ 37 4.2 MICROBIOLOGIA DO CONTEÚDO INTERNO ................................................. 41 5. CONCLUSÃO ............................................................................................................ 43 6. REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 44 10 1. INTRODUÇÃO A avicultura de postura tem apresentado um crescimento significativo nos últimos anos, tendo a produção brasileira de ovos um aumento de 6,1% em 2015, em relação ao ano de 2014, e resultou em 39,5 milhões de unidades, sendo o estado de São Paulo responsável por 33,24% da produção brasileira, seguido do estado de Minas Gerais com 11,5%. O consumo doméstico chegou a 191,7 unidades per capita (ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE PROTEÍNA ANIMAL – ABPA, 2016). O ovo comercial é o resultado de uma eficiente transformação biológica realizada pela galinha. Sua estrutura básica é composta por casca, gema e clara e apresenta constituintes que atuam como barreiras físicas e químicas, preservando a qualidade e evitando a contaminação por patógenos. Especialmente a casca, membranas interna e externas e enzimas com propriedades antimicrobianas as quais atuam como barreira protetora. Os dados epidemiológicos divulgados pelas mídias, que referem a casos de toxi- infecções alimentares causados por ovos, tem como principais agentes etiológicos as salmonelas e os coliformes. A maior frequência de contaminação em ovos comercializados em locais de vendas relaciona-se ao sistema de produção das aves, muitas vezes, sem a atenção necessária aos aspectos higiênico-sanitários do ambiente; contato de ovos com as fezes pela passagem na cloaca no momento da postura ou no ninho; tempo de permanência no ninho; armazenamento em locais impróprios e por tempo indeterminado e a manipulação inadequada (ANDRADE et al., 2004). O processo de higienização dos ovos gera grande polêmica quando se reporta a qualidade de ovos. Todavia, este procedimento influencia positivamente na aceitação do produto pelo consumidor, uma vez que melhora a aparência para comercialização, por questão de aspecto visual (LLOBET; PONTES; GONZALEZ, 1989), além de diminuir a probabilidade de contaminação e a ameaça à segurança alimentar (LAUDANNA, 1995; ALMEIDA, 2013). Os procedimentos de higienização de ovos, comumente, utilizam como agentes químicos o ácido peracético e cloro, este último devido sua facilidade na aplicação, 11 custo e por apresentar rápida ação biocida sobre micro-organismos, sendo assim bastante usado na indústria de alimentos. O objetivo deste estudo foi analisar a ocorrência de mesófilos aeróbios, coliformes totais e termotolerantes e Salmonella sp. em ovos comerciais, tanto na casca como no conteúdo interior, lavados com água e/ou higienizados com cloro e ácido peracético em diferentes concentrações. 12 2. REVISÃO DE LITERATURA 2.1 Avicultura de postura, estrutura e formação do ovo A criação e o manejo de poedeiras comerciais apresentam algumas diferenças em relação aos frangos de corte. De uma maneira geral, as aves são criadas em gaiolas de produção, sendo separadas em fase de cria, recria e postura. O ponto mais importante da produção do ovo é a sua qualidade, no entanto, isso envolve desde a compra da pintinha até a venda do ovo (LANA, 2000). Há granjas onde estas aves são alojadas na fase de pintinhas em piso dos galpões e somente depois, quando atingem a fase de postura (cerca de 17 semanas), são alojadas em gaiolas de postura. Na fase de produção, geralmente elas permanecem de 87 até 100 semanas pondo ovos, podendo chegar a 120 semanas. Os galpões, geralmente, são abertos, telados, com as baterias de gaiolas em seu interior. Nas gaiolas, é fornecida água ad libitum (à vontade) e ração sobre sistema GAD (Gramas de ração por Aves ao Dia), de acordo com a recomendação da linhagem. As aves são submetidas a um fotoperíodo gradual geralmente iniciando com 14 horas e terminando com 17 horas de luz por dia. Cada ave põe um ovo por dia e, ao final da vida, uma boa ave de postura deve ter posto em média 280 ovos por ano durante a fase produtiva. Os ovos são depositados sobre uma canaleta pela ação da gravidade, assim coletados e armazenados em uma sala de estocagem com temperatura e umidade controladas. Algumas granjas adotam o processo de limpeza e sanitização de ovos, principalmente os sujos de fezes (LANA, 2000). O ovo é uma estrutura complexa que possui três partes principais: a gema, a clara e a casca. Outras partes do ovo encontram-se em menor proporção, o blastodisco, a chalaza, a câmara de ar, a cutícula e as membranas da casca (Figura 1). A coloração da casca dos ovos varia do branco ao marrom escuro, sendo uma característica genética, determinada pela linhagem da ave. É importante ressaltar que, do ponto de vista nutricional, não há diferenças entre os ovos com coloração das cascas branca e vermelha (ROSE, 1997; BENITES; FURTADO; SEIBEL, 2005). O processo biológico de formação do ovo ocorre no sistema genital reprodutivo da galinha que constitui desde o ovário até a cloaca, dividido em cinco regiões, infundíbulo, magno, istmo, útero e vagina (FURLAN, 2009, SESTI; ITO, 2009). 13 Figura 1. Anatomiade um ovo Fonte: Horst (2007). A formação do ovo tem início após a ovulação, e na região do infundíbulo, onde a gema (ou oócito) é captada. Em seguida, o ovo em formação passa para a região do magno, onde é depositada a maior porção da proteína do ovo, a clara; e onde há a formação das chalazas, isto é mucinas retorcidas que mantém a gema no centro do ovo. Em continuação, ele chega a região do istmo, onde ocorrerá a formação das membranas interna e externa da casca. Estas membranas estão intimamente ligadas, exceto onde existe a formação de uma câmara de ar (BURKE, 1996; SESTI; ITO, 2009). Após, o ovo em formação chega no útero ou na glândula da casca, onde é adicionada a parte fluida da clara, formada basicamente de água, sais minerais e vitaminas, os quais passam através das membranas por osmose. Ainda no útero ocorre a formação da casca, composta basicamente pela deposição de carbonato de cálcio (98%) e por uma menor parte de matriz orgânica (2%). No processo de calcificação da casca os íons cálcio são retirados da corrente sanguínea (BURKE, 1996; SESTI; ITO, 2009). A casca é essencial para manter a integridade dos componentes dos ovos, podendo ser considerada a embalagem natural do ovo, resistente, rígida e suporta o peso de uma ave adulta durante a incubação natural, em função de sua forma ovalada e arranjo radiado de cristais. É porosa, contém 7.000 a 17.000 poros por ovo, que possuem 0,5 a 12,8 micra de diâmetro, para permitir a respiração do embrião e perda de umidade, sendo considerada a maior fonte de minerais para o desenvolvimento do embrião 14 (MORENG; AVENS, 1990). A casca constitui de 8 a 11% do peso do ovo e possui 94% de carbonato de cálcio (CaCO3), 1,4% de carbonato de magnésio (MgCO3), 3% de glicoproteínas, mucoproteínas, colágeno e mucopolissacarídeos (ORNELLAS, 2001). A casca é coberta por uma cutícula formada por uma camada proteica e hidrossolúvel que protege o ovo da penetração de micro-organismos, além de preservar a umidade interna do ovo, evitando a troca entre o interior e exterior (PROUDLOVE, 1996; BURKE, 1996; BENITES; FURTADO; SEIBEL, 2005). O ovo possui duas membranas, sendo a interna mais fina, e a externa mais espessa, que se localiza próximo à casca. As duas membranas conferem resistência à casca evitando rompimento e também tem a função de impermeabilizar o conteúdo dos ovos contra a penetração de micro-organismos (MADRID; CENZANO; VICENTE, 1996; RAMOS, 2008). A câmara de ar constitui num espaço entre a membrana interna e externa da casca, estando localizada na ponta mais larga do ovo, sendo formada logo após a oviposição. Com o esfriamento natural do ovo, ocorre uma contração do seu conteúdo, fazendo com que a membrana interna se separe da externa, proporcionando as trocas gasosas. A câmara de ar é importante na mensuração de qualidade interna do ovo. Em ovos frescos ela é quase inexistente. Todavia, aumenta o tempo de armazenagem do ovo, a câmara de ar aumenta e ocorre uma perda de umidade e gás carbônico pelos poros da casca e penetração do ar no ovo (LLOBET; PONTES; GONZALEZ, 1989). A clara constitui aproximadamente 56 a 61% do peso do ovo e contém 88% de água. Essa estrutura é praticamente isenta de lipídios e carboidratos (OLIVEIRA, 2006) e é uma importante fonte de riboflavina (0,2 a 0,5g 100g-1 de clara), e cerca de 3,5 g 100 g-1 de proteína (CARBÓ, 1987). A gema constitui aproximadamente de 27 a 32% do peso do ovo e é composta por 50% água, 34% de lipídeos, 16% de proteína e traços de glicose e sais minerais. Possui também lecitina, que é um lipídeo emulsificante (estabiliza misturas de água e óleo) (OLIVEIRA; SILVA, 2006), e contém aproximadamente a metade das proteínas presentes no ovo e é considerada de alto valor biológico, responsável por toda a vitamina A, D e E presente no ovo, e ainda contém fósforo, manganês, ferro, cobre, cálcio, zinco, fosfoproteínas ricas em aminoácidos essenciais, lipídios em forma de emulsão com grande proporção de ácidos graxos insaturados e colesterol (XAVIER et al., 2008). 15 2.2 Contaminação microbiológica de ovos Os ovos e produtos à base de ovos estão frequentemente envolvidos nos surtos de Doenças Transmitidas por Alimentos (DTAs). De acordo com o Sistema de Informação de Agravos de Notificação Nacional (SINAN, 2015), estes produtos foram associados a 7,8% dos casos epidemiológicos entre os anos de 2000 a 2015, sendo o 3º maior grupo de alimentos relacionados às DTAs. As bactérias que produzem infecções sistêmicas, como por exemplo Escherichia coli e Salmonella sp., são introduzidas nas galinhas através do trato gastrointestinal. Estudos de Soncini e Bittencourt (2003) e Okamura et al. (2001a, b) propõem duas vias possíveis de contaminação de ovos: por transmissão vertical e transmissão horizontal (Figura 2). Figura 2. Mecanismo de contaminação de ovos. Fonte: PLUSVET (2014). Na transmissão horizontal os ovos podem ser contaminados por penetração através da casca de ovo no intestino colonizado, ou por fezes contaminadas durante, ou após a oviposição (MESSENS; GRIJSPEERDT; HERMAN, 2005; DE REU et al., 2006). A segunda rota possível é por contaminação direta, também denominada transmissão vertical, da gema, clara, membranas, ou, casca de ovo antes de oviposição, e é originária da infecção de órgãos reprodutivos com Salmonella Enteritidis (KELLER 16 et al., 1995; MIYAMOTO et al., 1997; OKAMURA et al., 2001a, b). No entanto, Soncini e Bittencourt (2003) relatam que a transmissão transuterina ou transmissão vertical ocorre devido contaminação com E. coli. Embora alguns autores afirmem que a transmissão horizontal é a mais importante forma de contaminar os ovos (BARROW; LOVELL, 1991; BICHLER et al., 1996), a maioria dos autores afirmam que a transmissão vertical é a rota mais importante (GAST; BEARD, 1990; MIYAMOTO et al., 1997; GUARD-PETTER, 2001), por estar em contato direto com o conteúdo interno dos ovos. E, que a preservação das barreiras naturais da casca serve para evitar a contaminação dos ovos, tendo em vista uma melhor eficiência produtiva das aves e a preservação da qualidade microbiológica dos seus produtos, sendo importante o aprofundamento no conhecimento dos diversos produtos de sanitização, objetivando a manutenção das características protetoras da casca (CAFÉ; GONZALES, 2003). 2.3 Efeitos da higienização na qualidade microbiológica de ovos A higienização é a ação combinatória da limpeza e sanitização. A etapa de limpeza define-se como sendo a remoção das contaminações visíveis, tais como resíduos orgânicos e minerais presentes nas superfícies. A sanitização pode ser realizada por meios físicos e químicos e tem como objetivo reduzir ou eliminar completamente a presença de micro-organismos de importância higiênico-sanitária e patogênicos (ALMEIDA et al. 1995, EVANGELISTA, 2005). Os efeitos de lavagem e sanitização no processo de higienização da casca de ovo são muito discutidos em sua produção, apesar destes processos resultarem em melhor aparência para comercialização e influencia diretamente na aceitação do produto pelo consumidor (LLOBET; PONTES; GONZALEZ, 1989; ALMEIDA, 2013). Os primeiros estudos sobre a qualidade dos ovos armazenados mostraram que a etapa de lavagem dos ovos aumentou a probabilidade de deterioração e, por essa razão, a limpeza de ovos por lavagem já foi e é amplamente condenada em alguns países (European Food Safety Authority - EFSA, 2005). O conteúdo interno do ovo é um meio ideal para o crescimento de micro- organismos potencialmente patogênicos para os seres humanos. Temsido observado que a microbiota da casca do ovo é dominada por bactérias Gram-positivas, enquanto 17 que as bactérias Gram-negativas são melhores estruturadas para superar as defesas antimicrobianas do conteúdo do ovo (DE REU et al., 2006). A casca de um ovo contém milhares de poros, grandes o suficiente para permitir a entrada de bactérias, e é revestida externamente por uma fina cutícula proteica, que a torna impermeável, e internamente por duas membranas subjacentes, as quais lhe fornecem resistência adicional à penetração por micro-organismos (GANTOIS et al., 2009). De acordo com Laudanna (1995), existe desvantagem do procedimento de lavagem dos ovos, como a remoção da cutícula dos poros da casca, o que facilita a entrada de micro-organismos, resultando na deterioração e diminuição do período de estocagem, ou seja, de vida de prateleira, depreciando a qualidade e a segurança alimentar para o consumo. Entretanto, na tentativa de reduzir problemas decorrentes da contaminação por micro-organismos patogênicos e deteriorantes, os ovos são submetidos a processos como a lavagem da casca. No entanto, os defensores da lavagem dos ovos, apresentam que os riscos de contaminação aumentam com a comercialização de ovos sujos, com cascas defeituosas, sujas e rachadas, e apontam que há baixa incidência de toxi-infecções alimentares ligada a ovos lavados. Porém, enfocam que em estudos com ovos provenientes de locais onde há cadeia de frio, torna-se difícil avaliar a eficácia de lavagem (TOOD, 1996; HUTCHISON et al., 2003). Em estudo de Musgrove et al. (2008) acerca do efeito da lavagem sobre a incidência de micro-organismos em ovos, foi observada, após todo o processo de lavagem, a redução e até mesmo a eliminação de algumas bactérias presentes. Hutchison et al. (2003) e Jones et al. (2005) entenderam que a lavagem industrial e a sanitização são eficientes e tem efeito benéfico na conservação dos ovos, quando adotados corretamente os requisitos de temperatura e qualidade da água. De acordo com o United States Department of Agriculture – (USDA, 2001) recomenda-se a lavagem dos ovos com água abundante a 32ºC com uma margem de ± 12ºC. Nessa mesma perspectiva, Arrifano (2013) relata que a utilização de água limpa e morna contendo detergente e sanitizante com efeito germicida com uma rápida secagem dos ovos, ajuda no combate à invasão microbiana. 18 2.4 Os métodos de sanitização de ovos comerciais A Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), através da Portaria n° 15, de 23 de Agosto de 1988, definiu sanitizantes ou desinfetantes como formulações que têm na sua composição substância microbicida que apresenta efeito letal sobre micro- organismos não esporulados (BRASIL, 1988). A sanitização é o conjunto de medidas empregadas para impedir a entrada e crescimento de micro-organismos em um ambiente ou estrutura, tornando-os livres de agentes infecciosos, com o uso de substâncias sanitizantes ou outras formas físicas de sanitização (SPINOSA; GORNIAK; BERNARDI, 2006). As substâncias são usadas para destruir todas as formas vegetativas de micro-organismos em superfícies, mas esse processo não promove necessariamente a esterilização do material (PELCZAR et al., 1990). Segundo Kondo (2006), a sanitização de ovos pode ser feita na forma seca (fumigação) ou úmida (aspersão ou imersão). Os sanitizantes são classificados em agentes de níveis alto, intermediário e baixo. A efetividade dos processos de sanitização é influenciada pela natureza do material a ser desinfetado, número e resistência dos organismos contaminantes, quantidade de material orgânico presente (que pode inativar o sanitizante), tipo e concentração, além da duração e temperatura de exposição. Os sanitizantes cloro e ácido peracético referem-se ao nível alto, sendo suas utilizações mais eficientes se for realizado uma limpeza prévia da superfície para remoção de material orgânico (MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2009). 2.4.1 Aplicação do Cloro O cloro (Cl) e os compostos que possuem cloro são os sanitizantes mais comumente utilizados como agente bactericida em processamento de ovo, devido à sua disponibilidade, custo relativamente baixo e eficácia (CAO et al., 2009). O cloro puro (Cl2) dissocia-se quando adicionado na água e libera o ácido hipocloroso, conforme a reação (1). Atua combinando-se a radicais oxidáveis, principalmente – SH de enzimas (SPINOSA; GORNIAK; BERNARDI, 2006). Cl2 + H2O ⇌ HClO + H+ + Cl- (1) 19 Os hipocloritos são muito reativos, podendo ser empregados em baixa concentração, mostrando eficácia num amplo espectro, incluindo esporos e bacteriófagos, porém são instáveis ao armazenamento, corrosivos além de precipitarem em presença de ferro e serem inativados pela matéria orgânica (McDONNELL, 2009). Wang e Slavik (1998) estudaram ovos higienizados com hipoclorito de sódio e demonstraram que o sanitizante é eficiente na redução da multiplicação e penetração de Salmonella Enteritidis na casca dos ovos. O dióxido de cloro atua como agente oxidante forte, que na maioria das vezes reage por meio de mecanismo de transferência de elétrons agredindo a membrana celular, penetrando, desidratando, e por último, oxidando os componentes internos da célula microbiana sem, no entanto, gerar ação tóxica como a maioria dos compostos de cloro (McDONNELL, 2009). Os altos níveis de cloro podem ser maléficos para a qualidade do ovo (BIAŁKA et al., 2004) tornando-os não completamente aceitáveis devido a resíduos químicos, a eficácia limitada e impactos ambientais adversos, e segundo Jaculi (2009), recomenda- se após a aplicação de compostos clorados a uma concentração acima de 200 ppm, um enxágue final com água potável para que o cloro residual não reaja com a matéria orgânica dos alimentos. Jaenisch, Kuchiishi e Coldebella (2010) avaliaram atividades antibacterianas in vitro utilizando hipoclorito de sódio a 1% e a 0,1% de cloro ativo em Escherichia coli, Salmonella Enteritidis e Staphylococcus aureus, na presença e ausência de matéria orgânica, sob duas diferentes temperaturas (10ºC e 30ºC), e tempo de contato de 20 minutos, obtendo resultados eficazes frente às bactérias testadas. 2.4.2 Aplicação do Ácido peracético O ácido peracético (APA) (CH3 – COOOH), também chamado de peróxido de ácido acético ou ácido peroxiacético é um princípio ativo de vários sanitizantes comerciais. Sua reação é obtida do ácido acético (2) ou anidrido acético com o peróxido de hidrogênio (SREBERNICH, 2007). CH3COOH + H2O2 ↔ CH3COOOH + H2O (2) 20 O APA é irritante para a pele e para as mucosas, havendo necessidade de cuidados especiais no manuseio do produto concentrado como roupas protetoras, luvas de policloreto de vinila e proteção ocular (CHEREGATTO, 2015). Sua eficácia é semelhante ou superior a do hipoclorito de sódio, e mais potente que o peróxido de hidrogênio, tendo uma rápida ação inclusive em baixas concentrações (0,0001% a 0,2%). É efetivo na presença de material orgânico, possui baixa dependência de pH, e não apresenta efeito residual tóxico, atuando sobre um amplo espectro de micro- organismos, bactérias, fungos, vírus, algas e esporos (BLOCK, 2001; SILVA et al., 2008). O APA é considerado um excelente sanitizante pelo potencial inativador de bactérias Gram-positivas e negativas, pela sua capacidade de oxidação dos componentes gerandogrupos hidroxilas livres, sulfidrila e ligações dissulfeto que atacam lipídeos de membranas, DNA e proteínas, altera o equilíbrio químico-osmótico podendo causar o rompimento de sua parede celular (TOMAZELLI; SANTOS, 2000; RUTALA; WEBER, 2008), entretanto sua ação biocida é influenciada pela concentração, temperatura e tipo de micro-organismos (BLOCK, 2001). O uso do ácido peracético foi eficiente para a redução dos micro-organismos Staphylococcus aureus e Escherichia coli em superfície de aço inoxidável (KUNIGK; ALMEIDA, 2001). Uma desvantagem ou limitação do ácido peracético é que ele apresenta uma baixa estabilidade da solução de uso em temperatura ambiente (PETRUS et al., 2001). Jaenisch, Kuchiishi e Coldebella (2010) avaliaram atividades antibacterianas in vitro utilizando ácido peracético 2% em Escherichia coli, Salmonella Enteritidis e Staphylococcus aureus, na presença e ausência de matéria orgânica em ovos, sob duas diferentes temperaturas (10ºC e 30ºC), e tempo de contato de 20 minutos, demonstrando que na ausência de matéria orgânica, reduziu a zero a contagem de UFC frente à S. Enteritidis, sendo igualmente efetivo, independente da matéria orgânica, frente a S. aureus e E. coli, revelando-se uma opção válida para sanitização na avicultura. 2.5 Contaminação por Salmonella sp. e Escherichia coli em ovos comerciais 21 Estudos relatam que a contaminação de ovos ocorre de forma natural. Ovos são apontados como principal alimento responsável pela salmonelose em seres humanos (PINTO; SILVA, 2009). Os principais patógenos associados à contaminação do ovo são Salmonella thyphimurium, Salmonella Enteritidis, Salmonella Pullorum e Escherichia coli enteropatogênica (STRINGHINI et al., 2009). Salmonella sp. e Escherichia coli presentes na superfície da casca de ovos podem penetrar no seu interior, dependendo da qualidade da casca, condições de tempo, temperatura e estocagem (HUMPHREY, 1990; PADRON, 1990; CLAY; BOARD, 1991; HUMPHREY et al., 1991; SCHOENI et al., 1995; JORDAN; PATTISON, 1998; FERREIRA; KNÖBL, 2000). A Salmonella sp. presente nas fezes da ave pode penetrar no ovo antes do estabelecimento da barreira cuticular proteica da sua superfície, a qual é considerada a primeira barreira de prevenção contra a invasão bacteriana. Assim, o agente localizado na vagina se adere à casca, ultrapassando-a e contaminando o conteúdo interno do ovo (MIYAMOTO et al., 1997). A salmonelose é uma doença causada pela bactéria da família Enterobacteriaceae, do gênero Salmonella, que são bastonetes gram-negativos, móveis, flagelados e não fermentadores de lactose e sacarose. São anaeróbios facultativos, catalase positivos, produzem ácido sulfídrico e reduzem nitrito a nitrato, com crescimento ótimo a 35 a 37 ºC e pH 6,5 a 7,5. Podem sobreviver ao congelamento e à desidratação por longos períodos na matéria orgânica (VASCONCELLOS; HAMATY; NASCIMENTO, 2014). Há cerca de 2.500 sorotipos de Salmonella identificados, mas as de sorotipo de Salmonella Enteritidis tem sido associadas a mais de 20% dos surtos alimentares (Centers for Disease Control and Prevention - CDC, 2011). É uma doença de grande importância para o homem e, portanto, para a saúde pública, pois é uma zoonose que se caracteriza por uma toxi-infecção de origem alimentar, geralmente decorrente de má higiene e pelo contato com animais portadores assintomáticos ou doentes, que eliminam o agente da salmonelose através de suas fezes, podendo contaminar alimentos de origem animal e também vegetal. S. Typhimurium é o principal sorotipo de salmonela encontrado em alimentos, seguido pela S. Enteritidis, que tem se envolvido com infecções transmitidas a partir de ovos crus e derivados (VASCONCELLOS; HAMATY; NASCIMENTO, 2014). 22 Escherichia coli é uma bactéria pertencente à família Enterobacteriaceae, é um bastonete curto, com coloração Gram negativa, não esporulado, cujo tamanho varia de 1,1 a 1,5 μm por 2-6 μm. Em sua maioria, são móveis, devido à existência de flagelos peritríqueos. Em meios nutrientes sólidos, as colônias apresentam cerca de 1 a 3 mm de diâmetro podendo apresentar duas formas, lisa e rugosa, mas podem existir colônias com características intermediárias e mucoides. Colônias lisas são convexas e brilhantes, possuem bordas regulares, enquanto colônias rugosas apresentam um aspecto e aparência grosseira, contornos irregulares (EDWARDS; EWING’S, 1986; FERREIRA; KNÖBL, 2009). Essa bactéria possui metabolismo respiratório e fermentativo, pois é anaeróbio facultativo. A sua temperatura ideal de multiplicação é 37ºC, porém consegue multiplicar em temperaturas de 18 a 44ºC. Nas provas bioquímicas é positiva para vermelho de metila (VM) e produção de indol, enquanto para as provas de catalase, oxidase, utilização do citrato e Voger Proskauer (VP) é negativa. Não é capaz de utilizar a ureia como única fonte de nitrogênio, descarboxila os aminoácidos arginina, lisina e ornitina e possui como principal característica fermentar lactose e glicose produzindo ácido e gás (EDWARDS; EWING’S 1986). De acordo com o Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento, para a produção de ovos destinados à industrialização devem ser previamente observados os requisitos estabelecidos pelo Serviço de Inspeção Federal para o procedimento mencionado (BRASIL, 1990). A RDC (Resolução da Diretoria Colegiada) nº 12, de 12 de janeiro de 2001 da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), a qual estabelece padrões microbiológicos para fins de registro e fiscalização de produtos alimentícios, a Salmonella spp. deve ser ausente em 25g de ovo cru (BRASIL, 2001). Franco e Landgraf (2008) afirmam que a pesquisa de E. coli fornece, com maior segurança, informações sobre as condições higiênico sanitárias de um produto, sendo a melhor indicação da eventual presença de enteropatógenos. Os processos de produção de ovos livres de Salmonella spp. e Escherichia coli deve priorizar a higienização após a postura e refrigeração pois, são pontos críticos de controle para redução dos surtos de intoxicação humana de origem alimentar (MEDEIROS et al., 2011). A contaminação de ovos, seja na casca ou no conteúdo (gema e/ou clara), é o principal fator de qualidade que deve ser rigorosamente inspecionado na tentativa de garantir segurança do consumidor, já que relatos mostram alta incidência de 23 contaminação de ovos no mercado por Salmonella (ANDRADE et al., 2004; SILVA JÚNIOR, 2014). Vaniel et al. (2013) detectaram Salmonella sp. em 4,17% (3/72) das amostras de ovos analisadas, sendo duas amostras provenientes de supermercado e uma proveniente de feira livre de Pelotas, RS. De acordo com a porção do ovo analisada, duas amostras continham a bactéria na gema e uma amostra apresentou Salmonella sp. na casca. Corroborando com isto, Oliveira e Silva (2000) detectaram contaminação por Salmonella Enteritidis no conteúdo interno (3,2%) e na casca (9,6%) de ovos destinados ao consumo humano no estado de São Paulo. No entanto, Baú, Carvalhal e Aleixo (2001), ao avaliarem 94 amostras de cascas e gemas de ovos, provenientes de granjas ou da região da colônia de Pelotas, não detectaram a presença de Salmonella sp.. Bezerra, Vieira e Melo Júnior (1995) isolaram Escherichia coli de 70% das cascas de ovos provenientes de supermercados e feiras livres. Essa observação é preocupante, uma vez que as enterobactérias possuem atividade proteolítica, que destroem algumas estruturas da casca do ovo, podendo facilitar a penetração de micro-organismos, os quais se multiplicam no conteúdo do ovo e provocam sua deterioração. Andrade et al. (2004) estudarama frequência de micro-organismos isolados em 272 amostras de ovos de galinhas coletados em granjas e no comércio varejista de Goiânia, Goiás. Os resultados demonstraram que 40,44% dos ovos examinados continham bacilos Gram negativos e fungos, que podem alterar a qualidade nutricional dos ovos. A frequência de Escherichia coli isolada foi de 1,83% nas granjas, e de 1,11% em postos de venda. Neste mesmo estudo, foi observada a presença de Salmonella sp. em 1,48% das amostras e de Salmonella Enteritidis em 0,36%. Em estudo realizado por Stringhini et al. (2009), as frequências de coliformes totais das cascas de ovos dos galpões e das salas de classificação das granjas com sistema de lavagem apresentaram um aumento da frequência do número mais provável (NMP) de coliformes totais na sala de classificação em relação aos resultados obtidos nos galpões. Para as frequências de coliformes termotolerantes nas cascas de ovos coletados nos galpões, tanto nas granjas que utilizavam lavagem de ovos, quanto naquelas que comercializavam ovos não lavados, indicaram contaminação fecal, possivelmente pelo contato com excretas das aves na gaiola. Tal fato permite inferir que a produção nessas granjas foi realizada em condições higiênicas insatisfatórias e que a proliferação dessas bactérias poderia causar diminuição da vida de prateleira dos ovos e 24 perigo à saúde dos consumidores. No mesmo estudo, não se observou presença de Salmonella sp. nas cascas, nem contaminação do conteúdo dos ovos coletados. Cabe ressaltar que a presença de coliformes totais nas cascas de ovos não indica, necessariamente, contaminação fecal recente ou ocorrência de enteropatógenos, uma vez que esse grupo envolve outros gêneros além da Escherichia, como Citrobacter, Enterobacter e Klebsiella, as quais podem estar presentes também no solo e na água (SILVA et al., 2010). 25 3. METODOLOGIA 3.1 Local e coleta das amostras Foram utilizados ovos com peso de 50,0±3,0g, oriundos de um mesmo lote de poedeiras da linhagem Hisex Brown, com idades entre 35 e 50 semanas, oriundos da produção do Setor de Avicultura do IFTM – campus Uberaba (Figura 3), que apresenta cerca de 200 ovos por dia. Figura 3. Galinhas Hisex Brown de postura do Setor de Avicultura – IFTM Fonte: Acervo do autor Foram coletados aleatoriamente 60 ovos corresponde a 30% produção diária para cada ensaio, num total de 180 ovos em 3 ensaios realizados em semanas diferentes. A determinação da qualidade da casca foi realizada por inspeção visual. Ovos classificados como sem defeitos de casca foram aqueles que não apresentaram defeitos visíveis. Os ovos selecionados foram dispostos em bandejas de papelão para transporte ao Laboratório de Microbiologia do IFTM – campus Uberaba, onde foram imediatamente tratados de acordo com os procedimentos de lavagem e higienização. 26 3.2 Procedimentos de lavagem e higienização dos ovos A simulação dos procedimentos de lavagem e higienização industrial, conforme Tabela 1, foi conduzida em béqueres constituídos com barreiras físicas (escovas de cerdas macias) e com auxílio de movimentação controlada das soluções utilizadas. A temperatura da água e das soluções sanitizantes, bem como os tempos de cada etapa foram fixos em 25ºC e 3 minutos, respectivamente. Após os tratamentos de lavagem e/ou sanitização, os ovos foram secos com secador de ar frio e, analisados microbiologicamente, utilizando-se 6 unidades amostrais aleatórias para cada tratamento. Tabela 1. Procedimentos de lavagem e sanitização de ovos comerciais. Tratamentos T1 Grupo controle (ovos não lavados nem sanitizados) T2 Ovos lavados com água por 3 minutos (béquer de 10L em agitação controlada com barra magnética) T3 Ovos lavados com água (3 minutos) + sanitização via úmida com ácido peracético (concentração 50 ppm*) por 3 minutos (béquer de 5L em agitação controlada com barra magnética) T4 Ovos lavados com água (3 minutos) + sanitização via úmida com ácido peracético (concentração 100 ppm*) por 3 minutos (béquer de 5L em agitação controlada com barra magnética) T5 Ovos lavados com água (3 minutos) + sanitização via úmida com cloro ativo (concentração 50 ppm**) por 3 minutos (béquer de 5L em agitação controlada com barra magnética) T6 Ovos lavados com água (3 minutos) + sanitização via úmida com cloro ativo (concentração 100 ppm**) por 3 minutos (béquer de 5L em agitação controlada com barra magnética) *Adaptado de Melo et al. (2015) e Silva et al. (2008). **Adaptado de Wang e Slavik (1998) e Oliveira e Silva (2000). 3.3 Análise microbiológica da casca e do conteúdo interno dos ovos A recuperação dos micro-organismos da casca foi realizada através da lavagem da superfície de seis unidades amostrais (ovos) para cada tratamento, segundo Silva et al. 27 (2010), através do método International Organization for Standardization - ISO 7218: 2007. Foram pesadas as cascas e os conteúdos internos dos ovos, sendo que para cada 1 grama do peso foi utilizado 1 mL de água peptonada tamponada (APT) representando assim a diluição zero (1:1), ou seja (100). Para a diluição dos 25 g do conteúdo interno dos ovos e dos 25 mL de APT proveniente da lavagem da superfície dos ovos, foram transferidos assepticamente para 225 mL representando a diluição 10-1, a partir desta obtendo-se as demais diluições seriadas. Tanto para a casca quanto para o conteúdo interno dos ovos, foram realizadas análises para presença/ausência de Salmonella sp., contagem de coliformes totais e termotolerantes e mesófilos de acordo com os itens 3.4, 3.5 e 3.6, seguindo os procedimentos descritos no Compendium of methods for the microbiological examination of foods (DOWNES; ITO, 2001). 3.4 Análise de mesófilos aeróbios Para a contagem de bactérias mesófilas, o meio de cultura utilizado foi o Plate Count Agar (PCA) para contagem e o plaqueamento foi o de semeadura em profundidade. A partir das diluições, 1 mL foi plaqueado em profundidade com meio PCA, sendo então as placas incubadas a 35ºC por 48 h. Transcorrido o tempo de incubação fez-se a contagem do número de colônias com o auxilio de um contador de colônias (Phoenix) das triplicatas. Para os cálculos do número de UFC, multiplicou-se a média aritmétrica das triplicatas pelo respectivo fator de diluição. Os resultados foram expressos em Unidade Formadoras de Colônias – UFC g ou mL de amostra (SILVA et al., 2010). 3.5 Análise de coliformes totais e termotolerantes Para análise de coliformes totais e termotolerantes foi utilizada a técnica do Número Mais Provável (NMP), que inclui as seguintes etapas: Teste presuntivo, em que três alíquotas de três diluições seriadas das seis unidades amostrais foram inoculadas em uma série de três tubos de Caldo Lauril Sulfato Triptose (LST) por diluição. Os tubos com LST após 24-48h de incubação a 35ºC, com formação de gás no tubo de Durhan e 28 produção de ácido evidenciado pela formação de cor amarela foram presuntivamente considerados positivos. Para a confirmação dos coliformes totais e termotolerantes, uma alçada de cada tubo suspeito foi transferido para tubos de Caldo Verde Brilhante Bile 2% (VB) e Caldo E. coli (EC), meios seletivos que contêm lactose. A observação de crescimento foi realizada através da produção de gás no tubo de Durhan nos tubos de VB, após 24-48h de incubação a 35ºC, sendo considerada confirmativa dapresença de coliformes totais. O crescimento com produção de gás nos tubos de EC, após 24h de incubação a 44,5ºC, em banho-maria, foi considerada confirmativa da presença de coliformes termotolerantes. Os resultados foram expressos em NMP/g ou mL de amostra (SILVA et al., 2010). 3.6 Análise de Salmonella sp. Para análise do conteúdo interno, as diluições 100 foram incubadas por 96 h a 35ºC. A APT obtida da lavagem da superfície dos ovos e da diluição de 25 g do conteúdo interno homogeneizado dos ovos, após as 96 h de incubação, em 225 mL de APT foram incubados a 35ºC por 24 horas para pré-enriquecimento. Após a incubação, foi feito enriquecimento seletivo, transferindo-se 1 ml e 0,1 ml da cultura pré- enriquecida para dois tubos, um contendo 10ml de caldo Tetrationato (TT) e outro com 10ml de Caldo Rappaport-Vassiliadis (RV), respectivamente, sendo os tubos do TT incubados a 37ºC ± 1ºC, e os tubos de RV incubados em banho-maria a 41,5 ± 1ºC, ambos durante 24 h ± 3 h. Após o enriquecimento seletivo nos caldos TT e RV, foram semeadas alíquotas em três placas contendo: Ágar Hektoen Enteric (HE), Ágar Xilose Lisina Desoxicolato (XLD), Ágar Bismuto Sulfito (BS), incubando-se à 37ºC ± 1ºC por 24 h (ISO 6579, 2002). Das placas que continham colônias características ou típicas, foram selecionadas 5 (cinco) colônias: Ágar Hektoen Enteric (HE): colônias verde-azuladas, com ou sem centro preto. Cepas fortemente produtoras de H2S podem produzir colônias inteiramente pretas. Ágar Xilose Lisina Desoxicolato (XLD): colônias cor de rosa escuro, com ou sem centro preto. Cepas fortemente produtoras de H2S podem produzir colônias com centro preto grande e brilhante, ou mesmo inteiramente pretas. 29 Ágar Bismuto Sulfito (BS): colônias marrons ou pretas com ou sem brilho metálico. O meio ao redor das colônias muda gradativamente para uma coloração marrom a preta, com o prolongamento do tempo de incubação. Em tubos com ágar inclinados de Ágar Tríplice Açúcar Ferro (TSI) e Ágar Lisina Ferro (LIA) após o período de incubação a 35 ºC ± 1ºC por 24 h, observou-se a ocorrência de reação típica de Salmonella. Em TSI, observou-se a coloração na rampa alcalina (vermelha) e no fundo ácido (amarelo), com ou sem produção de H2S (escurecimento do ágar). Em LIA, observou-se a coloração do fundo e da rampa alcalinos (roxos, sem alteração da cor do meio), com ou sem produção de H2S (escurecimento do meio). Para a confirmação definitiva as colônias foram submetidas às provas bioquímicas, de acordo com Andrews e Hammack (2003) realizados no Laboratório de Microbiologia da Universidade do Triângulo Mineiro - UFTM, e as culturas com comportamento bioquímico típico para Salmonella sp. foram confirmadas pela técnica de aglutinação em lâmina, utilizando-se soros polivalentes anti-Salmonella (Probac do Brasil). Os resultados foram expressos como presença ou ausência de Salmonella sp. em 25 g ou mL de amostra. Para averiguar o efeito da eficácia dos sanitizantes sobre a Salmonella sp. foi realizado o teste o teste de sensibilidade bacteriana in vitro pela técnica de difusão em disco pelo método de Kirby-Bauer (BAUER; KIRBY, 1966), utilizando diferentes concentrações de cloro e ácido peracético (50, 100, 150 ppm), tendo como controle o antibiótico cloranfenicol, sendo o resultado expresso em sensível, intermediário ou resistente ao antimicrobiano testado. 3.7 Análise estatística Os resultados das contagens das análises microbiológicas dos três ensaios foram transformados em log 10 e submetidos à análise de variância (α= 0,05) e ao teste Scott- Knott com o auxílio do software Assistat 7.7 a fim de verificar a influência dos diferentes tratamentos nos ovos sobre a contagem bacteriana na casca e no conteúdo interno dos ovos (MONTGOMERY, 1997). Os resultados obtidos das análises de Salmonella dos três ensaios foram submetidos ao teste de Fisher, a partir da categorização binária dos dados (presença e ausência), segundo Fleiss (1991). 30 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 4.1 MICROBIOLOGIA DAS CASCAS 4.1.1 Contagem de Mesófilos Aeróbios Na Figura 4, é apresentada a contagem de bactérias mesófilos aeróbios dos ovos submetidos a diferentes procedimentos de sanitização, verificou-se que para todas as repetições houve variação na contagem de bactérias mesófilas aeróbias, sabendo que estas podem ser consideradas indicadoras das condições de limpeza e sanitização. Nota: APA = Ácido Peracético, Cl = Cloro, REP = Repetição do experimento Médias seguidas pela mesma letra não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Scott-Knott (P>0,05). Figura 4. Médias das populações de bactérias aeróbias mesófilas em casca de ovos submetidos a diferentes procedimentos de higienização por repetição. 31 A técnica de contagem em placas de bactérias aeróbias mesófilas é comumente utilizada para indicar a qualidade sanitária dos alimentos, pois mesmo que os patógenos estejam ausentes e que não tenham ocorrido alterações nas características sensoriais do alimento, um número elevado destes microrganismos (contagem acima de 10⁶ UFC/g) indica que o alimento é insalubre (FORSYTHE, 2002). Assim, as contagens das populações das bactérias mesófilas aeróbias (Figura 4) se expressaram de diferentes formas nas três repetições neste estudo. A dinâmica destes resultados é condizente com a realidade industrial de processamento de ovos. Neste sentido, o propósito da sanitização é reduzir ou eliminar as populações bacterianas na superfície, e tornar o ovo isento ou a um índice aceitável de microrganismos (ARAGON-ALEGRO et al., 2005). Na primeira repetição (Figura 4), a população de mesófilos aeróbios variou de 6,0 x 100 a 2,4 x 102 UFC g-1. Os ovos do tratamento controle apresentaram 2,4 x 102 UFC g-1, a utilização dos sanitizantes nos tratamentos com água (T2), APA 50 ppm (T3), cloro 50 ppm (T5), cloro 100 ppm (T6) reduziram as contagens a 7,0 x 100, 5,8 x 101, 1,6 x 104, 8,0 x 101, 6,0 x 100 UFC g-1, respectivamente, no entanto os tratamentos T2 e T6 assim como T3 e T5 não apresentaram diferença entre si. De acordo com Rêgo et al. (2012), os micro-organismos mesófilos aeróbios em ovos integrais comerciais estiveram em populações de 2,5x103 UFC g-1. Na segunda repetição (Figura 4), a população de mesófilos aeróbios variou de 4,0 x 100 a 1,3 x 102 UFC g-1, não sendo reduzida em nenhum dos tratamentos (T2, T3, T4, T5 e T6) como pode ser observado pelas médias 7,2 x 101, 8,0 x 100, 2, 9 x 101, 1,3 x 102, 1,0 x 101 UFC g-1, respectivamente. Na terceira repetição (Figura 4), a população de mesófilos aeróbios variou de 1,0 x 100 a 4,8 x 101 UFC g-1, mostrando que houve a redução nos tratamentos, T2, T3, T5, T6, como pode ser observado nas médias 3,0 x 100, 1,0 x 100, 9,0 x 100, 7,0 x 100 UFC g-1. Não houve diferença significativa entre os tratamentos T2 e T3 assim como no T5 e T6 em ambos demonstram-se os efeitos na redução das contagens, porém os tratamentos com cloro 50 e 100 ppm mostraram ser mais eficazes na eliminação dos micro-organismos. Na repetição 1 (Tabela 2), nos tratamentos T6, T2, T3, T5 em ordem decrescente de redução da população de mesófilos, nota-se que os melhores percentuais de redução foram encontrados no T6 e no T2, sendo a simples lavagem com água ou a lavagem 32 com água seguida da sanitização com cloro 100 ppm recomendados para o procedimento de higienização, desde que os ovos sejam inspecionados visualmente antes das operações. Na repetição 2, não houve redução alguma, ou seja, era preferívelnão ter higienizado o ovo (controle). Na repetição 3, os tratamentos T2, T3 e T6 apresentaram redução da população de mesófilos, contudo o T3 foi o mais eficaz. Pontualmente, observa-se que o T4 (ácido peracético 100 ppm) foi ineficiente, pois não mostrou redução nenhuma das populações de mesófilos nas 3 repetições (Tabela 2). Tabela 2. Redução das populações de micro-organismos mesófilos em cascas de ovos lavados com água e/ou higienizados com cloro e ácido peracético em diferentes concentrações. Redução da população de mesófilos (%) REP1 REP2 REP3 T1 Controle - - - T2 Água 97,1 0,0 95,1 T3 APA 50ppm 75,7 0,0 100,0 T4 APA 100ppm 0,0 0,0 0,0 T5 Cl 50ppm 66,7 0,0 0,0 T6 Cl 100ppm 97,6 0,0 86,0 Nota: APA = Ácido Peracético, Cl = Cloro, REP = Repetição do experimento Diante destes resultados, pode-se considerar que os valores aceitáveis de bactérias nas cascas de ovos, mesmo não estabelecidos pelo Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento, seria a menor carga bacteriana na casca, a fim de diminuir o risco de penetração do micro-organismo no conteúdo (STRINGHINI et al., 2009). Nas três repetições pode-se notar um comportamento diferente com o tratamento com APA 100 ppm (T4), que de alguma forma pode ter afetado a membrana proteica da casca de ovo, ocasionando o rompimento desta membrana, que permitiu a entrada ou saída de bactérias, as quais se espalharam pela superfície da casca, explicando a contagem maior da população. Na primeira repetição, foi observado que os ovos submetidos a este tratamento estavam com incrustação de fezes na casca, mesmo depois do procedimento de sanitização, o que também justifica a contagem maior da população de mesófilos neste tratamento. 33 De acordo com Aragon-Alegro et al. (2005), o emprego de agentes químicos constitui uma solução crítica para a redução ou eliminação do risco de contaminação da casca. Favier et al. (2000) estudaram alguns sanitizantes, dentre eles o hipoclorito de sódio, e verificaram que os sanitizantes podem afetar a fina e delicada camada da casca e, assim, permitir a recontaminação do ovo. Stringhini (2008) observou que os valores médios de 2,0 ± 1,3 Log UFC g-1 a 3,1 ± 0,4 Log UFC g-1 para as contagens de mesófilos nas cascas dos ovos lavados com lavados com hipoclorito de cálcio e com clorhexidina oriundos de sala de classificação, foram menores do que aquelas encontradas em ovos coletados em galpões, ou seja, ovos não lavados. Os dados da Figura 4 corroboram com esta afirmativa. Já em estudo de Melo et al. (2015), foi verificado contagem total de aeróbios mesófilos viáveis de até 3,95 Log UFC g-1 em ovos caipiras sanitizados com ácido peracético 0,02% por 15 minutos produzidos por agricultores familiares localizadas nos assentamentos da região metropolitana do Estado do Rio de Janeiro-RJ. 4.1.2 Contagem de Coliformes Totais e Termotolerantes Nas Tabelas 3 e 4, são apresentados os resultados relativos às determinações dos NMP g-1 de coliformes totais e termotolerantes das três repetições experimentais. As contagens elevadas de bactérias do grupo coliformes são consideradas indicadores das condições de higiene e, refletem quando a limpeza e a sanitização são ineficientes (SILVA et al., 2010). Podem ser encontrados diversos tipos de micro-organismos na casca de ovos, e eles variam conforme as situações, sendo os mais comuns encontrados também no ar, solo e água (MUSGROVE et al., 2008). A presença destes micro-organismos, estão diretamente relacionado ao manejo e condições sanitárias do campo. Os dados microbiológicos obtidos para casca (Tabela 3) demonstram que a população de coliformes totais no controle (T1) diferiu das demais na primeira repetição, porém esta tendência não pôde ser observada nas demais repetições. As análises de coliformes totais (Tabela 3) evidenciaram que na primeira repetição os tratamentos com água (T2), APA 50 ppm (T3), APA 100 (T5) e Cl 50 ppm (T6) demonstraram redução na população de coliformes totais, sendo que variou de <0,36 (T2, T3 e T6) a 4,6 (T5) NMP g-1de amostra. Essas diferentes concentrações 34 diminuíram a contagem microbiana, porém, o tratamento APA 100 ppm (T4) não foi eficiente. Todavia foi observado visualmente que os ovos que compunham este tratamento estavam com fezes incrustadas mesmo depois de ter sido submetido ao procedimento de lavagem. Tabela 3. Coliformes totais em cascas de ovos submetidos a diferentes procedimentos de higienização. Tratamento (T) 1ª repetição NMP g-1 2ª repetição NMP g-1 3ª repetição NMP g-1 T1 – Controle >110 <0,30 <0,30 T2 – Água 0,36 <0,30 <0,30 T3 – APA 50 ppm 0,36 <0,30 <0,30 T4 – APA 100 ppm >110 24 <0,30 T5 – Cl 50 ppm 4,30 <0,30 <0,30 T6 – Cl 100 ppm <0,30 <0,30 <0,30 Nota: APA = Ácido Peracético, Cl = Cloro Pode-se observar que o aumento dos micro-organismos no tratamento T4, na segunda repetição. No entanto este não apresentava visualmente incrustações de matéria orgânica (fezes), sugerindo que a utilização de ácido peracético em concentração de 100 ppm tenha afetado a estrutura da membrana proteica que protege a casca do ovo, fato relatado Tomazelli e Santos (2000) e Rutala e Weber (2008), possibilitando a entrada ou saída de micro-organismos proveniente do material orgânico das fezes do ovo. Segundo Ornellas (2001), caso as cascas possuam bactérias e enterotoxinas pré- formadas por alguns micro-organismos, poderá haver a contaminação do conteúdo interno dos ovos. E, que a ineficiência do APA também pode ser devida à baixa estabilidade do sanitizante em temperatura ambiente, de acordo com Petrus et al. (2001). O procedimento de lavagem com cloro 100 ppm (T6) demonstrou ser eficiente na eliminação deste grupo de coliformes totais, apresentando uma frequência de 100% de eliminação nas três repetições frente os coliformes totais. 35 Os ovos que foram submetidos a diferentes procedimentos de sanitização apresentaram uma frequência da presença de coliformes totais de 33,3%, valor equivale ao encontrado por Cardoso et al. (2001) para coliformes totais em ovos comerciais de vários fornecedores da região de Descalvado, estado de São Paulo. No entanto, não se observa o mesmo no estudo de Stringhini et al. (2009) em granjas com sistemas de lavagem, onde foi encontrado 6% de frequência para coliformes totais nas cascas de ovos. De encontro aos resultados deste estudo, a etapa de sanitização visa a redução significativa da população microbiana através de substâncias químicas antimicrobianas. Contudo, a eficiência de um agente antimicrobiano depende de fatores ambientais, que podem agir isoladamente ou em combinação, tais como carga microbiana inicial e etapa de limpeza para eliminação de matéria orgânica para melhor ação do sanitizante (WILEY, 1994), com foco na qualidade microbiológica dos alimentos de forma que não ocasionem riscos à saúde do consumidor, principalmente quando esse é consumido cru (ANDRADE; MACÊDO, 1996; SILVA JÚNIOR, 2014). O emprego da lavagem com cloro a 100 ppm (T6), foi eficaz na redução das contagens de coliformes totais durante a primeira repetição, mesmo efeito notado por Wang e Slavik (1998), que observaram a eliminação destes micro-organismos em ovos, sem danos à cutícula da casca. Desta forma, sugere-se que em granjas com sistemas de lavagem, seja realizado uma pré-seleção visual de ovos, para remoção de ovos com sujeiras ou material externo aderente a casca, visto que auxilia na diminuição do risco de contaminação e provendo assim a segurança da qualidade. Além disso, sabe-seque a lavagem dos ovos influencia positivamente na aceitação do produto pelo consumidor, uma vez que melhora a aparência para comercialização (LLOBET; PONTES; GONZALEZ, 1989). A utilização apenas da água na lavagem de ovos mostrou ser eficaz na redução de coliformes totais (Tabela 3) e termotolerantes (Tabela 4), sendo desta forma interessante o seu emprego no momento do consumo. No entanto, a RDC nº 12, de 2 de janeiro de 2001 da ANVISA (BRASIL, 2001), não estabelece padrões microbiológicos para coliformes totais e termotolerantes em ovos in natura, o que poderia ser interessante no controle de qualidade industrial, já que se sabe que os coliformes são micro-organismos indicadores das condições higiênico-sanitárias. 36 Tabela 4. Coliformes termotolerantes em casca de ovos submetidos a diferentes procedimentos de higienização. Tratamento 1º repetição NMP g-1 2º repetição NMP g-1 3º repetição NMP g-1 T1 – Controle 0,92 <0,30 <0,30 T2 – Água <0,30 <0,30 <0,30 T3 – APA 50 ppm <0,30 <0,30 <0,30 T4 – APA 100 ppm 1,50 24,00 <0,30 T5 – Cl 50 ppm 2,30 <0,30 <0,30 T6 – Cl 100 ppm <0,30 <0,30 <0,30 Nota: APA = Ácido Peracético, Cl = Cloro Em 22% das amostras, houve a presença de coliformes termotolerantes (Tabela 4), sendo que índices variaram de 0,92 a 24 NMP g-1. Os resultados diferiram de Stringhini et al. (2009), que em granjas com sistemas de lavagem verificou a frequência de 2,1% para coliformes termotolerantes nas cascas de ovos. Segundo Cardoso et al. (2001), os coliformes termotolerantes foram encontrados 8,3%, de ovos comerciais, demonstrando que esses ovos apresentavam condições higiênicas insatisfatórias. Desta forma, é extremamente importante a pré-seleção de ovos a serem higienizados. Stringhini et al. (2009) concluíram que os ovos lavados apresentam qualidade bacteriológica de casca melhor que os ovos não lavados, embora o processo de lavagem realizado nas granjas de postura comercial analisadas não tenha sido capaz de eliminar completamente os coliformes termotolerantes, sendo essa situação a mesma deste estudo. O emprego do T2, e dos sanitizantes dos T3 e T6 mostraram-se eficazes na redução deste grupo de micro-organismos na primeira repetição. Os tratamentos com sanitizantes T4 na primeira e segunda repetição e T5 na primeira repetição não apresentaram redução em relação ao T1. Uma das possíveis justificativas para este fato deve-se ao espalhamento dos micro-organismos contidos nas cascas, e também a baixa estabilidade do ácido peracético a temperatura ambiente Petrus et al (2001) e a presença de fezes aparente na casca na primeira repetição. 37 Os baixos índices de coliformes termotolerantes (<0,30 NMP g-1) são um bom indicador das condições de manejo na produção de ovos. Estudo de Leite et al. (2016) demonstraram que não houve detecção de coliformes termotolerantes em ovos de galinha caipira, julgando que a operação de manuseio foi eficiente, no entanto este estudo não faz referência a nenhum procedimento de higienização para os ovos. Uma possível explicação para ausência de amostras positivas (<0,30 NMP g-1) para coliformes totais e termotolerantes nos ovos analisados foi a utilização de ovos limpos e sem presença de fezes na casca. Este mesmo resultado pode ser notado no estudo de Figueiredo (2008), que para coliformes totais e termotolerantes nos ovos de poedeiras novas e velhas em diferentes condições de armazenamento apresentaram resultados negativos para todas as 120 amostras. A partir dos resultados das Tabelas 2 e 3, seria recomendável a aplicação da água ou de cloro na higienização de ovos, contanto que os ovos não estejam sujos, como definido no Decreto nº 56.585 (BRASIL, 1965), que são aqueles que apresentam sujidades aderidas na casca. 4.1.3 Ocorrência de Salmonella sp. As salmonelas ocupam lugar de destaque como micro-organismo indesejável na avicultura de postura, sendo amplamente pesquisado na cadeia produtiva avícola por acarretar grandes prejuízos no setor (SILVA; DUARTE, 2002). Para a triagem das colônias típicas de Salmonella sp. provenientes das placas de cultura com os meios indicadores utilizados, pode-se notar que no ágar BS, as colônias estavam escuras, com brilho metálico; no ágar XLD, as colônias tinham aspectos cor de rosa com centro escuro e no ágar HE, colônias esverdeadas com centro escuro (Figura 5). 38 Nota: T5TT: Tratamento 5 com colônias oriundas do Caldo Tetrationato , T5RV: Tratamento 5 com colônias oriundas do caldo Rappaport-Vassilidis, BS: Ágar Bismuto Sulfito, XLD: Ágar Xilose Lisina Desoxicolato, HE: Ágar Entérico de Hectoen. Figura 5. Características morfocolônias típicas de Salmonella sp. em diferentes meios sólidos Fonte: Acervo do autor Na identificação preliminar (Figura 6) utilizando o meio de cultura LIA, as reações positivo-suspeitas apresentaram características de rampa alcalina (violeta) e fundo alcalino (violeta). No meio de cultura TSI, as colônias apresentaram rampa alcalina (vermelha) e fundo ácido (amarelo) com formação de H2S. Figura 6. Cultivo em ágar “Triple Sugar Iron” (TSI) (A e B) e ágar “Lysine Iron Agar” (LIA) (C). Fonte: Acervo do autor Nas análises confirmativas, por meio das provas bioquímicas, as culturas suspeitas mostraram-se urease negativa, assim como para as provas de sulfeto e de indol. Já no 39 teste de motilidade, as culturas apresentaram resultados positivos, proporcionando a identificação de Salmonella sp. Através da pesquisa de Salmonella sp., foi detectada a presença desse micro- organismo em uma amostra do tratamento 5 (5,5%) (Tabela 5) na primeira repetição do experimento. De acordo com a legislação vigente (RDC nº 12), os ovos deste tratamento seriam rejeitados, pois a legislação estabelece ausência para Salmonella em 25g de ovos in natura como padrão microbiológico. Tabela 5. Salmonella sp. em 25 g de casca de ovos submetidos a diferentes procedimentos de higienização. Tratamento 1ª repetição 2º repetição 3º repetição T1 – Grupo Controle Ausência Ausência Ausência T2 – Água Ausência Ausência Ausência T3 – APA 50 ppm Ausência Ausência Ausência T4 – APA 100 ppm Ausência Ausência Ausência T5 – Cl 50 ppm Presença Ausência Ausência T6 – Cl 100 ppm Ausência Ausência Ausência Nota: APA = Ácido Peracético, Cl = Cloro Corroborando com os resultados deste estudo, Vaniel et al. (2013) detectaram 4,17% das amostras positivas para Salmonella sp. sendo que apenas uma amostra apresentou Salmonella sp. na casca. Andrade et al. (2004), avaliaram a qualidade microbiológica de ovos de galinha comercializados em Goiânia, GO, notaram que, aproximadamente, 40% dos ovos continham bacilos Gram-negativos e, dentre estes, 4,46% estavam contaminados com Salmonella sp., os quais poderiam representar potencial risco à saúde humana. Já Oliveira e Silva (2000) encontraram 9,6% das cascas e 3,2% do conteúdo de ovos de galinha obtidos no comércio varejista de Campinas, SP, positivos para Salmonella Enteritidis. De acordo com Scur et al. (2014), a matéria orgânica reduz a eficácia de ácido peracético entre 57,5 a 66,2%, e do hipoclorito de sódio entre 10 a 15,5%, como foi comprovado ao testá-los no controle de Salmonella enterica sorotipo Enteritidis ATCC 40 1402. Já quando os mesmos sanitizantes foram utilizados na ausência de matéria orgânica, os tratamentos de higienização foram 100% eficiente na eliminação do mesmo micro-organismo. O teste de sensibilidade aos antimicrobianos representa uma importante ferramentano monitoramento da evolução da resistência bacteriana e age também como um método auxiliar na implantação de medidas de controle que evitem a disseminação de bactérias multirresistentes (BRASIL, 2008). Pode ser visualizado na Figura 7, as concentrações de ácido peracético e cloro (50, 100, 150 ppm) não promoveram a formação de halos de inibição sobre Salmonella sp. apresentando ser resistente frente aos produtos testados. O antibiótico cloranfenicol, testado como controle, agiu no crescimento da cultura testada, mostrando a formação de um halo de inibição de 22 mm frente a Salmonella sp., mostrando a sensibilidade da bactéria ao antimicrobiano, corroborando com Cortez et al. (2006), que demonstraram que as cepas de Salmonella sp. isoladas de abatedouros de aves foram sensíveis ao cloranfenicol. Figura 7 (A), (B). Teste de sensibilidade das colônias de Salmonella sp. as diferentes concentrações de cloro e ácido peracético (50, 100, 150 ppm) e o controle cloranfenicol. Fonte: Acervo do autor 41 4.2 MICROBIOLOGIA DO CONTEÚDO INTERNO Os resultados obtidos para o conteúdo interno dos ovos nas análises de mesófilos aeróbios, coliformes totais, coliformes termotolerantes e Salmonella sp. em todas as repetições e tratamentos foram a ausência dos micro-organismos estudados, a qual pode ser explicada pela presença de agentes antimicrobianos do próprio conteúdo interno dos ovos, constituintes naturais da clara de ovos, que combatem eficientemente os micro- organismos que possam invadir o conteúdo do ovo imediatamente após a oviposição, e que tem como papel principal manter os micro-organismos afastados da gema, que está é o reservatório de nutrientes do ovo (BRAKE et al., 1997, IBRAHIM, 2000, NAIDU, 2000). Aliado aos antimicrobianos, a ausência de micro-organismos pode explicada pelos ovos terem sido analisados com 1 dia após a postura, não havendo tempo suficiente para os micro-organismos da casca contaminarem a gema do ovo (MARTELLI; DAVIES, 2012). A defesa antimicrobiana da clara se deve provavelmente à imobilização de bactérias, ao efeito bactericida, à indisponibilidade de nutrientes para bactérias e inibição de enzimas (STADELMAN; COTTERILL, 1977; OLIVEIRA; SILVA, 2000). A distribuição das proteínas antimicrobianas existentes na clara de ovo podem ser dada da seguinte forma: ovalbumina (54%), ovotransferrina (12%), ovomucoide (11%), lisozima (3,5%), ovomucina (3,5%). A avidina (0,05%), a cistatina (0,05%), a ovomacroglobulina (0,5%), a ovoflavoproteína (0,8%), a ovoglicoproteína (1,0%), e ovoinibidor (1,5%) são as proteínas em menor quantidade (KOVACS-NOLAN et al., 2005). A ovalbumina é a principal proteína da clara do ovo, sendo sintetizada no oviduto da galinha (STADELMAN; COTTERILL, 1977). A rota bioquímica ocorre na conversão da ovalbumina em S-ovalbumina e sucede na dissociação do complexo ovomucina-lisozima (com a destruição do gel de ovomucina), o que resulta na diminuição da viscosidade da clara do ovo (DAVIS; REEVES, 2002). A ovotransferrina, também denominada de conalbumina é o componente principal da defesa antimicrobiana do ovo. É a principal proteína que possui alta afinidade por ferro di- e trivalente, assim como pelo cobre. O ferro é um elemento essencial para as bactérias, pois é necessário para um número elevado de reações enzimáticas. Como grupo prostético ou como co-fator, atua como agente bactericida e a sua atividade 42 antimicrobiana pode ser desacoplada das suas propriedades de captura do ferro, além de possuir um efeito bacteriostático inibindo o crescimento de micro-organismos (THEODORE; SCHADE, 1965; TRANTER; BOARD, 1984; IBRAHIM, 2000; NAIDU, 2000). As bactérias podem ser eliminadas por enzimas que estão presentes na clara, principalmente se houver imobilização no gel composto por ovomucina. A lisozima provoca lise na parede de bactérias Gram-positivas, enquanto que a N- acetilglucosaminidase inibe o crescimento de bactérias Gram-negativas (STADELMAN; COTTERILL, 1977). A clara contém ainda várias proteínas que se ligam a nutrientes essenciais para os micro-organismos, principalmente metais e vitaminas. A mais conhecida, a avidina, se liga a biotina, sendo a avidina considerada um antibiótico presente na clara, que inibe o crescimento in vitro de bactérias e leveduras com necessidade de biotina, e pela sua capacidade de ligação a várias bactérias Gram negativas, por exemplo E. coli (MINE; KEERATIURAI, 2000, NAIDU, 2000). 43 5. CONCLUSÃO Através dos resultados obtidos neste estudo pôde-se concluir que para as granjas de produção de ovos: É imprescindível realizar a pré-seleção visual de ovos para que o processo de higienização seja eficaz; Os procedimentos de higienização podem ser realizados através da lavagem com água potável, ou da lavagem com água potável seguida da sanitização com cloro 100 ppm por 3 minutos. Apesar da higienização dos ovos com ácido peracético 50 ppm ter apresentado redução nas populações de mesófilos, não é recomendável a utilização deste sanitizante para ovos, tendo em vista suas dificuldades de utilização e que também a utilização de concentrações maiores (100 ppm) podem ser prejudiciais à qualidade da casca, aumentando a sua contaminação por micro-organismos. 44 6. REFERÊNCIAS ABPA. Associação Brasileira de Proteína Animal. Relatório anual 2016. Disponível em: <http://abpa-br.com.br/setores/avicultura/publicacoes/relatorios-anuais>. Acesso em: 18 ago. 2016. ALMEIDA, D. S. 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